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Resumen

Aquí informamos un método de bioimpresión 3D de astrocitos corticales murinos para biofabricar tejidos neurales para estudiar la funcionalidad de los astrocitos en el sistema nervioso central y los mecanismos que involucran a las células gliales en enfermedades y tratamientos neurológicos.

Resumen

Los astrocitos son células gliales con un papel esencial en el sistema nervioso central (SNC), incluyendo el soporte neuronal y la funcionalidad. Estas células también responden a las lesiones neuronales y actúan para proteger el tejido de eventos degenerativos. Los estudios in vitro de la funcionalidad de los astrocitos son importantes para dilucidar los mecanismos implicados en tales eventos y contribuir al desarrollo de terapias para tratar trastornos neurológicos. Este protocolo describe un método para biofabricar una estructura de tejido de tipo neural rica en astrocitos mediante bioimpresión 3D de biotinta cargada de astrocitos. En este trabajo se utilizó una bioimpresora 3D basada en extrusión, y se extrajeron astrocitos de las cortezas cerebrales de los cachorros de ratones C57Bl / 6. La biotinta se preparó mezclando astrocitos corticales de hasta el pasaje 3 a una solución de biomaterial compuesta de gelatina, gelatina-metacriloil (GelMA) y fibrinógeno, complementada con laminina, que presentaba condiciones óptimas de bioimpresión. Las condiciones de bioimpresión 3D minimizaron el estrés celular, contribuyendo a la alta viabilidad de los astrocitos durante el proceso, en el que el 74,08% ± el 1,33% de las células eran viables justo después de la bioimpresión. Después de 1 semana de incubación, la viabilidad de los astrocitos aumentó significativamente a 83.54% ± 3.00%, lo que indica que la construcción 3D representa un microambiente adecuado para el crecimiento celular. La composición del biomaterial permitió la unión celular y estimuló el comportamiento astrocítico, con células que expresan el marcador específico de astrocitos glial de proteína ácida fibrilar (GFAP) y poseen la morfología astrocítica típica. Este protocolo reproducible proporciona un método valioso para biofabricar tejido neural 3D rico en astrocitos que se asemeja al microambiente nativo de las células, útil para los investigadores que tienen como objetivo comprender la funcionalidad de los astrocitos y su relación con los mecanismos involucrados en las enfermedades neurológicas.

Introducción

Los astrocitos son el tipo de célula más abundante en el Sistema Nervioso Central (SNC) y juegan un papel clave en la homeostasis cerebral. Además de soportar el apoyo neuronal, los astrocitos son responsables de modular la absorción de neurotransmisores, mantener la integridad de la barrera hematoencefálica y regular la sinaptogénesis neuronal1,2. Los astrocitos también tienen un papel esencial en la inflamación del SNC, respondiendo a lesiones en el cerebro en un proceso que conduce a la reactividad astrociátrica o astrogliosis reactiva3,4,formando una cicatriz glial que impide la exposición del tejido sano a agentes degenerativos5. Este evento resulta en cambios en la expresión génica, morfología y función de los astrocitos6,7. Por lo tanto, los estudios que involucran la funcionalidad de los astrocitos son útiles para el desarrollo de terapias para tratar trastornos neurológicos.

Los modelos in vitro son cruciales para estudiar los mecanismos relacionados con las lesiones neurológicas, y aunque se ha establecido un aislamiento exitoso y un cultivo bidimensional (2D) de astrocitos corticales8,este modelo no proporciona un entorno realista que imite el comportamiento de las células nativas y reproduzca la complejidad del cerebro9 . En condición 2D, el pobre soporte mecánico y bioquímico, las bajas interacciones célula-célula y célula-matriz, y el aplanamiento celular que conduce a la ausencia de polaridad basal-apical, afectan la dinámica de señalización celular y los resultados experimentales que conducen a la alteración de la morfología celular y la expresión génica, que comprometen la respuesta a los tratamientos10. Por lo tanto, es crucial desarrollar alternativas que proporcionen un entorno neuronal más realista, con el objetivo de traducir los resultados a la clínica.

El cultivo celular tridimensional (3D) representa un modelo más avanzado que recapitula con mayor fidelidad las características de órganos y tejidos, incluido el SNC11. En cuanto al cultivo glial, los modelos 3D contribuyen al mantenimiento de la morfología de los astrocitos, la polaridad basal-apical celular y la señalización celular12,13. La tecnología de bioimpresión 3D surgió como una poderosa herramienta para biofabricar tejidos vivos 3D de manera controlada mediante el uso de células y biomateriales para recrear la estructura y las propiedades de los tejidos nativos. El uso de esta tecnología ha supuesto una mejora sustancial de la predicción de resultados y ha contribuido a la medicina regenerativa aplicada al SNC14,15,16.

El protocolo descrito aquí detalla el aislamiento y cultivo de astrocitos corticales. El protocolo también detalla un método reproducible para bioimprimir astrocitos incrustados en gelatina / gelatina metacriloilo (GelMA) / fibrinógeno, complementado con laminina. En este trabajo, se utilizó una bioimpresora basada en extrusión para imprimir la composición del biomaterial que contiene astrocitos corticales a una densidad de 1 x 106 células/ ml. El estrés de cizallamiento de bioimpresión se minimizó mediante el control de la velocidad de impresión, y los astrocitos mostraron una alta viabilidad después del proceso. Los constructos bioimpresos se cultivaron durante 1 semana, y los astrocitos pudieron propagarse, adherirse y sobrevivir dentro del hidrogel, manteniendo la morfología astrocítica y expresando un marcador específico de proteína ácida fibrilar glial (GFAP)4.

Este procedimiento es compatible con bioimpresoras basadas en extrusión accionadas por pistón y se puede utilizar para bioimprimir astrocitos derivados de diferentes fuentes. El modelo bioimpreso en 3D propuesto aquí es adecuado para una amplia gama de aplicaciones de ingeniería neuronal, como los estudios de los mecanismos involucrados en la funcionalidad de los astrocitos en tejidos sanos y la comprensión de la progresión de las patologías neurológicas y el desarrollo de tratamientos.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales siguieron las pautas internacionales para el uso de animales en la investigación (http://www.iclas.org) y fueron aprobados por el Comité de Ética en Investigación de la Universidade Federal de São Paulo (CEUA 2019 / 9292090519).

1. Disección cerebral de ratones

  1. Transfiera 10 ml de solución de sal tamponada de Hanks fría (HBSS) a un plato de cultivo de 100 mm y 1 ml a un microtubo de 1,5 ml. Preparar un microtubo por animal.
    NOTA: Tanto el plato de cultivo como el microtubo deben mantenerse en hielo.
  2. Preparar el medio de cultivo de astrocitos utilizando DMEM F12 + 10% fetal bovino (FBS), 2% glutamina y 1% penicilina-estreptomicina (P/S). Esterilizar el medio filtrando con un filtro de 0,2 μm.
  3. Sacrificar a los cachorros de ratones C57Bl / 6 (día postnatal 1) por decapitación con una tijera operativa afilada. Usando forrórceps, tira de la piel y expone el cráneo. Asegúrese de que tanto las tijeras como las pórceps estén esterilizadas con etanol al 70%.
  4. Corte el cráneo desde el foramen magnum hasta la parte superior de la cabeza a lo largo del plano sagital con una tijera de punta curva afilada.
    NOTA: Asegúrese de que el tejido encefálico no esté dañado.
  5. Utilizando una espátula previamente esterilizada con etanol al 70%, levantar el cerebro de la cavidad craneal y colocarlo en la placa de cultivo que contiene 10 ml de HBSS frío.
  6. Coloque el plato de cultivo que contiene el cerebro debajo del estereomiroscopio, y usando dos fórceps de punta roma, retire las meninges del cerebro (Figura 1).
  7. Separe las cortezas del resto del cerebro alejándolas suavemente de la línea mediana del cerebro usando una espátula.
  8. Recoja ambas cortezas y transfiéralas inmediatamente al mismo microtubo que contenga 1 ml de HBSS frío.

2. Aislamiento y cultivo de astrocitos

  1. Bajo el flujo laminar, corte el tejido cortical en trozos pequeños con una micro tijera curva y lávelos con 1 ml de HBSS mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 3x. Espere a que el tejido se asiente. Retire HBSS y agregue HBSS nuevo, repitiendo el proceso dos veces más.
  2. Retire el HBSS e incube el tejido con 1 ml de tripsina al 0,05% a 37 °C durante 5 min.
    NOTA: Solo la digestión de tripsina es suficiente en este punto.
  3. Disociar mecánicamente el tejido canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo 15x.
    NOTA: La disociación completa del tejido se observa por el aumento de la turbidez de la suspensión y por la ausencia de grandes fragmentos de tejido en la suspensión.
  4. Transfiera la solución a un tubo cónico de 15 ml, neutralice la actividad de la tripsina agregando un volumen igual de FBS y filtre la solución en un filtro colador celular de 0,4 μm para eliminar fragmentos no disociados.
  5. Lavar el filtro con 1 mL de medio de astrocitos, recoger la suspensión celular que pasó por el colador, y centrifugarla durante 5 min a 200 x g y 25 °C. Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y suspender el pellet en 1 mL de medio de cultivo de astrocitos.
  6. Transfiera la suspensión celular a un matraz de cultivo T25, consciba el volumen del medio a 3,5 ml e incube las células a 37 °C y 5% de CO2.
  7. Asegúrese de que después de 24 h, las células sean adherentes. Luego, reemplace el medio y cámbielo cada 3 días.
  8. Después de 7 días, elimine la microglía y los oligodendrocitos del cultivo lavando las células con 2 ml de 1x PBS.
  9. Reemplace la solución de PBS con el medio de cultivo de astrocitos y deje el matraz de cultivo en un agitador orbital a 180 rpm durante la noche.
    NOTA: Los astrocitos forman una monocapa confluente en aproximadamente 10-12 días de cultivo.

3. Síntesis de gelatina metacriloil (GelMA)

  1. Pesar 10 g de gelatina obtenida de la piel porcina y disolver en 100 ml de PBS dejando que la solución se revuelva en una placa calefactora a 240 rpm y 50 °C hasta la disolución completa.
  2. Debajo de una capucha, agregue 2 ml de anhídrido metacrílico (MA) para un bajo grado de funcionalización, y deje que la emulsión de gelatina se revuelva a 240 rpm y 50 ° C durante 2 h.
    PRECAUCIÓN: Declaración de peligro MA: H302 + H332 (dañino si se ingiere o inhala), H311 (tóxico en contacto con la piel), 314 (causa quemaduras graves en la piel y daño ocular), 315 (causa irritación de la piel), H317 (puede causar una reacción alérgica en la piel), H318 (causa daño ocular grave), 331 (tóxico si se inhala), H332 (dañino si se inhala), H335 (puede causar irritación respiratoria). Pautas de manejo: P261 (evite respirar polvo / humo / gas / niebla / vapores / aerosol), P305 + P351 + P338 + P310 (SI ESTÁ EN LOS OJOS: Enjuague con precaución con agua durante varios minutos. Quítese las lentes de contacto, si están presentes y son fáciles de hacer. Continúe enjuagando. Llame inmediatamente a un CENTRO DE ENVENENAMIENTO / médico), P301 + P312 + P330 (SI SE TRAGA: Llame a un CENTRO DE ENVENENAMIENTO / médico si se siente mal. Enjuague la boca).
    NOTA: Agregue MA muy lentamente, gota a gota.
  3. Diluir la solución de gelatina-MA en 100 mL de PBS precalentado (50 °C) para obtener 200 mL de volumen final y dejar remover la solución a 240 rpm y 50 °C durante 10 min.
  4. Cortar ~20 cm de membrana de diálisis (corte molecular 12-14 kDa) y remojarla en agua desionizada hasta que esté blanda.
    NOTA: Llene las membranas con agua desionizada para asegurarse de que no haya agujeros o defectos.
  5. Usando un embudo, transfiera la solución de gelatina-MA a las membranas.
    NOTA: Cierre ambos lados dejando espacio adicional en el interior para permitir la mezcla.
  6. Coloque las membranas que contienen la solución de gelatina-MA en un recipiente con 2 L de agua destilada para diálisis, dejándolas remover a 40 °C durante 5 días (500 rpm).
    NOTA: Cubra el recipiente para evitar la evaporación del agua.
  7. Cambie el agua destilada dos veces en un día. Cada vez, voltee las membranas boca abajo para la homogeneización.
  8. En el quinto día, mezcle 200 ml de agua ultrapura precalentada (40 °C) con la gelatina dializada-MA, y déjela remover durante 15 min a 40 °C.
  9. Transfiera la solución de gelatina-MA a tubos cónicos de 50 ml hasta 25 ml y deje que los tubos permanezcan a -80 °C durante 2 días.
    NOTA: Guarde los tubos horizontalmente para facilitar la liofilización.
  10. Liofilizar las soluciones congeladas durante 3-5 días y almacenar el GelMA liofilizado protegido de la humedad.

4. Preparación de biotinta

NOTA: Para obtener 1 mL de biotinta, se recomienda fabricar al menos 3 mL de solución de biomaterial, ya que puede haber pérdidas durante la filtración.

  1. Preparación de la solución de fibrinógeno
    1. Preparar solución salina (NaCl 0,9%) en agua desionizada, y disolver 10 mg de fibrinógeno del plasma bovino en 1 mL de la solución salina para obtener una concentración de 10 mg/mL.
      NOTA: Como el fibrinógeno se adsorbe al vidrio, no use matraces de vidrio para preparar la solución de fibrinógeno.
    2. Dejar la solución bajo agitación a 37 °C hasta la disolución completa del fibrinógeno.
      NOTA: Para la disolución de fibrinógeno, utilice un sistema rotativo colocado dentro de un horno a 37 °C. La agitación magnética (180 rpm) de fibrinógeno en una placa caliente a 37 °C también es adecuada. Bajo esta condición, 10 mg / ml de fibrinógeno tarda aproximadamente 40 minutos en disolverse.
  2. Preparación de la solución de gelatina/GelMA
    1. Pesar 0,12 g de gelatina y añadirla a 1,9 ml de PBS precalentado (40 °C) para obtener una concentración final de gelatina al 4% (p/v). Vórtice para facilitar la disolución.
    2. Mantener la emulsión a 40 °C hasta la disolución completa.
    3. Pesar 0,06 g de GelMA liofilizado y transferir a la solución de gelatina para obtener una concentración final de GelMA al 2% (p/v). Vórtice para facilitar la disolución.
    4. Mantenga la solución a 40 °C hasta la disolución completa.
  3. Preparación de biotinta de gelatina/GelMA/fibrinógeno cargada de astrocitos
    1. Pipetear 0,9 ml de la solución de fibrinógeno de 10 mg/ml y transferir a la solución de gelatina/GelMA para obtener una concentración final de 3 mg/ml de fibrinógeno.
    2. Pesar 0,015 g de fotoiniciador (IP) y transferir a la solución de gelatina/GelMA/fibrinógeno para obtener una concentración final de PI al 0,5% (p/v). Mezcle la solución volteando el tubo hacia arriba y hacia abajo y manténgalo a 40 °C protegido de la luz para evitar la degradación de PI.
      NOTA: Almacene la biotinta a 4 °C durante un máximo de 24 h.
    3. Bajo el flujo laminar, filtre la solución con un filtro de 0,2 μm en un tubo cónico estéril de 15 ml.
      NOTA: La solución de biomaterial debe estar a 37-40 °C para permitir la filtración.
    4. Transfiera 980 μL de la solución de biomaterial a un tubo cónico de 15 ml.
    5. Diluir laminina en solución salina para obtener una solución stock de 100 μg/mL.
    6. Pipetear 20 μL de laminina y transferir al tubo que contiene la biotinta para obtener una concentración final de 2 μg/ml de laminina.
    7. Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo, evitando burbujas. Si persiste alguna burbuja, centrífuga el tubo cónico a 200 x g durante 2 min. Mantenga la biotinta a 37 °C hasta que se mezcle con las células.
    8. Tripsinizar astrocitos primarios con tripsina al 0,05% durante 5 min.
      NOTA: Use astrocitos de los pasajes 1 a 3.
    9. Neutralice la actividad de tripsina con FBS en una proporción de 1: 1 y transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugarlo a 200 x g durante 5 min.
    10. Cuente las células y transfiera 1 x 106 células a un tubo cónico diferente. Centrifugarlo a 200 x g durante 5 min.
    11. Retire el sobrenadante dejando un pequeño volumen (~ 200 μL) para suspender el gránulo celular, golpeando suavemente la parte inferior del tubo cónico.
    12. Transferir 1 mL de solución de gelatina/GelMA/fibrinógeno al tubo que contiene las células y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar, obteniendo una concentración final de 1 x 106 células/ml.

5. Preparación de la solución de reticulación

  1. Reconstitución de trombina
    1. Preparar una solución caldo de trombina 100 U/mL en agua desionizada estéril con albúmina sérica bovina (BSA) al 0,1% (p/v) en un tubo cónico de 15 mL. Stock en microtubos a -20 °C.
      NOTA: Como la trombina se adsorba al vidrio, no use matraces de vidrio para preparar la solución de caldo o almacenar las alícuotas.
  2. Preparación de la solución de trombina-CaCl2
    1. Pipetear 100 μL de solución de trombina y transferir a un tubo cónico de 50 mL que contenga 8,9 mL de agua desionizada estéril para obtener una concentración final de 1 U/mL de trombina.
    2. Preparar una solución de CaCl2 al 10% (p/v) en agua desionizada y esterilizar con un filtro de 0,2 μm.
    3. Transfiera 1,1 ml de la solución de CaCl2 al 10% al tubo cónico que contiene trombina, con el fin de obtener una relación final de 1:9 (CaCl2 a trombina).
      NOTA: Prepare la solución de reticulación en el volumen que se utilizará en el experimento, evitando el almacenamiento.

6. Bioimpresión de biotinta cargada de astrocitos utilizando una bioimpresora basada en extrusión

  1. Diseño del tejido neural
    1. Usando el código G: construir una cuadrícula de 6 x 6 mm (forma cuadrada) con 1 mm de distancia entre cada línea bioimpresa en los ejes X e Y, y 6 capas en el eje Z (0,2 mm entre cada línea); establecer la extrusión (E) a 0,01 mm, aumentando 0,001 mm en cada nueva capa del eje Z; y establecer la velocidad de impresión (F) en 400 mm/min(Información suplementaria).
  2. Configuración de bioimpresora
    1. Exponga la máquina a la luz UV durante 15 minutos y luego límpiela con etanol al 70%.
    2. Encienda la bioimpresora con el interruptor de encendido. Conecte la máquina a la computadora a través de un cable USB. Abra el software de control para conectarlo a la bioimpresora y cargue el diseño del archivo.
  3. Preparación de la jeringa de bioimpresión
    1. Transfiera la biotinta de gelatina/GelMA/fibrinógeno cargada de astrocitos a una jeringa de plástico de 5 ml utilizando una pipeta de 1.000 μL.
      NOTA: Transfiera lentamente para evitar la formación de burbujas.
    2. Conecte una aguja roma estéril de 22 G a la jeringa.
      NOTA: Deje la jeringa a 4 °C durante 2 min.
    3. Conecte la jeringa al cabezal de impresión de la bioimpresora y enjuague manualmente la biotinta para eliminar las burbujas restantes.
  4. Bioimpresión
    NOTA: La bioimpresión se realizó fuera de la campana laminar.
    1. Coloque un plato de cultivo de 35 mm en la mesa de la bioimpresora y coloque la aguja a 0,1 mm de distancia de la superficie del plato de cultivo para permitir el movimiento de la aguja.
      NOTA: Utilice un plato de cultivo de 35 mm para cada bioimpresión.
    2. Pulse el botón Imprimir.
    3. Una vez que termine la bioimpresión, asegúrese de que la jeringa se aleje del plato. Luego, cierre el plato de cultivo y prepárese para el proceso de reticulación.
      NOTA: La bioimpresión de una construcción dura aproximadamente 1 min y 10 s.
  5. Reticulación de la construcción bioimpresa y la cultura
    1. Coloque la placa de cultivo bajo luz UV a 2 mW/cm2 durante 2 x 60 s (arriba y abajo) para la reticulación GelMA.
    2. Bajo el flujo laminar, transfiera la construcción bioimpresa a una placa de 24 pozos utilizando una espátula estéril.
    3. Añadir 500 μL de solución de trombina/CaCl2 y dejar actuar durante 30 min para permitir la reticulación de fibrina.
    4. Retire la solución de reticulación y lave la construcción con 2 ml de PBS 1x. A continuación, sustituir el PBS por 1 mL de medio de cultivo de astrocitos e incubar a 37 °C y 5% de CO2. Cambie el medio cada 3 días.

7. Evaluación de la viabilidad de los astrocitos

  1. Viabilidad de los astrocitos bioimpresos
    1. Transfiera la construcción bioimpresa a un plato de cultivo de 35 mm utilizando una espátula.
    2. Lave la construcción con 1 ml de 1x PBS.
    3. Deposite 100 μL del reactivo Live/Dead sobre la construcción y manténgalo a 37 °C durante 30 min, manteniéndolo protegido de la luz.
    4. Retire el reactivo Live/Dead y lave la construcción con 1 mL de 1x PBS.
    5. Transfiera la muestra a un plato confocal usando una espátula y observe las células dentro de la construcción bajo un microscopio confocal utilizando excitación de 488 y 570 nm para la adquisición de imágenes.
      NOTA: Utilice una ampliación de 10x para una visualización general de las celdas dentro de la construcción.
    6. Asegúrese de que la muestra esté plana. Si es necesario, coloque una cubierta sobre la muestra para aumentar la planitud.
      NOTA: Durante la toma de imágenes, asegúrese de que el plato confocal esté bien sellado para evitar que la muestra se seque.
    7. Calcule el número de viables (verde) y muertos (rojo) utilizando un software computacional.
  2. Viabilidad del cultivo de astrocitos 2D
    1. Sembrar 0,5 x 106 astrocitos (paso 1-3) en una placa confocal de 35 mm, añadir astrocitos de medio, e incubarlos a 37 °C y 5% de CO2.
    2. Cuando las células estén confluentes, retire el medio de cultivo y lávese con 1 ml de 1x PBS.
    3. Deposite 200 μL del reactivo Vivo/Muerto y mantenga el plato a 37 °C durante 30 min, protegido de la luz.
    4. Retire el reactivo Vivo/Muerto y lave las células con 1 ml de 1 PBS.
    5. Lleve el plato a un microscopio confocal junto con una cámara digital y use excitación de 488 y 570 nm para la adquisición de imágenes.
    6. Calcule el número de viables (verde) y muertos (rojo) utilizando un software computacional.

8. Inmunotinción de astrocitos

  1. Tinción de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de astrocitos bioimpresos en 3D
    NOTA: Para investigar la presencia de otros marcadores celulares, cambie el anticuerpo primario en consecuencia.
    1. Retire el medio del pozo y lave la construcción con 1 ml de 3x PBS.
    2. Añadir paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS al pozo hasta que la construcción esté completamente cubierta y dejarlo durante 2 h a 4 °C.
    3. Retire el PFA y lave la construcción con 1 ml de 3x PBS.
      NOTA: Este procedimiento se puede pausar durante varios meses si se almacena a 4 °C en PBS. Asegúrese de que la placa del pozo esté sellada para evitar la evaporación de PBS.
    4. Tratar la muestra con glicina 0,1 mol/L durante 5 min.
    5. Lavar con 1 mL de 1x PBS durante 5 min.
    6. Permeabilizar la muestra con PBS que contenga 0,1% de Tritón X-100 y 10% de FBS durante 1 h a 25 °C bajo agitación orbital.
    7. Incubar el constructo con pollo anti-GFAP (dilución de anticuerpos primarios 1:500) a 4 °C durante la noche.
    8. Aspire el anticuerpo primario y lave la muestra con 1 ml de PBS durante 5 min, 3 veces.
      NOTA: El anticuerpo primario se puede reutilizar varias veces cuando se almacena a 4 °C.
    9. Incubar la muestra con Alexa fluor 488-conjugado anti-pollo (dilución secundaria de anticuerpos 1:500) y 1 μg/mL DAPI durante 1 h a 25 °C bajo agitación orbitaria.
      NOTA: Mantenga la muestra protegida de la luz.
    10. Lave la muestra con 1 ml de PBS durante 5 min, 3 veces.
    11. Transfiera la construcción a un plato confocal de 35 mm.
      NOTA: Asegúrese de que el plato esté bien sellado para evitar que la muestra se seque.
  2. Tinción de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) del cultivo de astrocitos 2D
    1. Sembrar 0,5 x 106 astrocitos (paso 1-3) en una placa confocal de 35 mm, añadir astrocitos de medio, e incubarlos a 37 °C y 5% de CO2.
    2. Cuando las células estén confluentes, retire el medio de cultivo y lávelas con 1 ml de 1x PBS.
    3. Repita los pasos 8.1.2-8.1.10.
  3. Tinción del citoesqueleto de los astrocitos
    1. Repita los pasos 8.1.1-8.1.6.
    2. Añadir 200 μL de 50 μg/mL de solución de faloidina conjugada fluorescente en PBS y 1 μg/mL de DAPI sobre la construcción.
    3. Incubar durante 1 h a 25 °C bajo agitación orbitaria, manteniendo la muestra protegida de la luz.
    4. Lave la muestra con 1 ml de PBS durante 5 min 3 veces y transfiera la construcción a un plato confocal usando una espátula.
      NOTA: Asegúrese de que el plato esté bien sellado para evitar que la muestra se seque.

9. Imágenes confocales

  1. Lleve los platos a un microscopio confocal junto con una cámara digital para obtener imágenes (excitación de 359, 488 y 570 nm).
  2. Utilice un aumento de 10x para una visualización general y de 40 o 63x para imágenes ampliadas de celdas.
    NOTA: Asegúrese de que la muestra esté plana. Si es necesario, coloque una cubierta sobre la muestra para aumentar la planitud.

Resultados

Este trabajo tuvo como objetivo desarrollar un tejido similar a un neural utilizando la tecnología de bioimpresión 3D para depositar capa por capa la biotinta cargada de estratocitos primarios / GelMA / fibrinógeno. Los astrocitos fueron extraídos y aislados de la corteza cerebral de cachorros de ratones(Figura 1),añadidos a una composición de biomaterial, permitiendo la biofabricación de una construcción 3D viva.

El diseño asistido por ordenador (CAD) se...

Discusión

La tecnología de bioimpresión 3D ha surgido como una alternativa de biofabricación que permite la ingeniería de construcciones refinadas que estructural y fisiológicamente se asemejan a tejidos nativos22,incluido el cerebro23. La biofabricación de tejidos neurales permite el modelado de microambientes nativos in vitro, siendo una herramienta importante para comprender los mecanismos celulares y moleculares asociados con el desarrollo y tratamiento de muchas e...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Investigación de São Paulo (FAPESP), números de subvención 2018/23039-3 y 2018/12605-8; Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq), números de subvención 465656/2014-5 y 309679/2018-4; y Coordinación para el Perfeccionamiento del Personal de Educación Superior (CAPES), código financiero 001.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
3D Bioprinter3D Biotechnology SolutionsExtrusion-based bioprinter
Blunt-tip forcepsIntegra Miltex6--30Forceps for brain dissection previously sterilized
Bovine serum albuminSigma-Aldrich9048-46-8Protease free, fatty acid free, essentially globulin free
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4
Cell culture flaskFisher Scientific156340Culture flask T25
Cell strainerCorning Incorporated352340Cell strainer 40 µm
Confocal microscopeLeicaConfocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system
Conical tubesThermo Scientific339651, 339652Sterile tubes of 15 mL and 50 mL
DAPIAbcamab224589DAPI staining solution
DMEM/F12Gibco; Life Technologies Corporation12500062DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Dyalisis tubingSigma-AldrichD9527Molecular weight cut-off = 14 kDa
EthanolFisher Scientific64-15-5Reagent grade
Fetal Bovine SerumGibco; Life Technologies Corporation12657011Research Grade
FibrinogenSigma-Aldrich9001-32-5Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma
GelatinSigma-Aldrich9000-70-8Gelatin powder from porcine skin
GlycineSigma-Aldrich56-40-6Glycine powder
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)Gibco; Life Technologies Corporation14175095No calcium, no magnesium, no phenol red
L-GlutamineSigma-Aldrich56-85-9L-Glutamine crystalline powder
LamininSigma-Aldrich114956-81-9Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit cell imaging kitThermo ScientificR37601Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylic anhydrideSigma-Aldrich760-93-0For GelMA preparation
MicrotubesCorning IncorporatedMCT-150-CMicrotubes of 1,5 mL
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
Needle 22GFisher ScientificNC1362045Sterile blunt needle
Operating scissorIntegra Miltex05--02Sharp scissor for brain dissection previously sterilized
ParaformaldehydeSigma-Aldrich30525-89-4Paraformaldehyde powder
Penicillin/StreptomycinGibco; Life Technologies Corporation15070063Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)
Petri dishCorning Incorporated430591, 430588Sterile petri dishes of 35 and 100 mm
PhalloidinAbcamab176753iFluor 488 reagent
PhotoinitiatorSigma-Aldrich106797-53-92-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone
Phosphate buffer saline (PBS)Gibco; Life Technologies Corporation10010023PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium
Poly-L-lysineSigma-Aldrich25988-63-0Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000
Primary antobodyAbcamab4674Chicken polyclonal to GFAP
Secondary antibodyAbcamab150176Alexa fluor 594 anti-chicken
SpatulaMiltexV973-70Number 24 cement spatula previously sterilized
StereomicroscopeFisherbrand3000038Microscope for brain dissection
Syringe 5 mLBD1222C84Sterile syringe
Syringe filter 2 µmFisher Scientific09-740-105Polypropylene filter for sterilization
ThrombinSigma-Aldrich9002--04-4Thrombin cristalline powder from bovine plasma
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1Laboratory grade
Trypsin-EDTAGibco; Life Technologies Corporation15400054Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS
Versene solutionGibco; Life Technologies Corporation15040066Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS
Well plateThermo Scientific144530Sterile 24-well plate

Referencias

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