A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
هنا ، يتم وصف طرق مفصلة لتوليد والحفاظ على وتوصيف العضيات المعوية الدقيقة والقولونية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. تم تصميم هذه الطرق لتحسين قابلية التكاثر وتوسيع قابلية التوسع وتقليل وقت العمل المطلوب لطلاء ومرور العضيات.
تصف المواصفات الإقليمية المعوية عملية يتم من خلالها نقل التشكل والوظيفة الفريدة إلى مناطق محددة من الجهاز الهضمي النامي (GI). يتم تشغيل المواصفات الإقليمية في الأمعاء من خلال مسارات نمو متعددة ، بما في ذلك مسار البروتين المورفوجيني للعظام (BMP). بناء على المواصفات الإقليمية العادية ، تم تطوير طريقة لتوليد عضيات القولون البشري (HCOs) من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) ، والتي تشمل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hES) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs). تحريض لمدة ثلاثة أيام لإشارات BMP يضع أنماط كافية لثقافات أنبوب الأمعاء الوسطى / الخلفية في بروتين خاص غني بالتسلسل الغني ب AT 2 (SATB2) - يعبر عن HCOs التي تحتوي على جميع أنواع الخلايا الظهارية الرئيسية الموجودة في القولون البشري بالإضافة إلى الخلايا الوسيطة النامية المشتركة. أدى إغفال BMP (أو إضافة مثبط BMP NOGGIN) خلال فترة الزخرفة الحرجة هذه إلى تكوين عضيات معوية بشرية (HIOs). تشبه HIOs و HCOs شكليا وجزيئيا الأمعاء الدقيقة والقولون النامية للإنسان ، على التوالي. على الرغم من فائدة HIOs و HCOs لدراسة نمو الأمعاء البشرية ، فإن إنشاء HIOs و HCOs يمثل تحديا. تقدم هذه الورقة طرقا لتوليد والحفاظ على وتوصيف HIOs و HCOs. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير الخطوات الحاسمة في البروتوكول وتوصيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
من الصعب دراسة نمو القولون البشري بسبب القيود المفروضة على استخدام أنسجة الجنين البشري. كانت النماذج الحيوانية لا تقدر بثمن واستخدمت تاريخيا للأساليب الجينية في الفئران لدراسة نمو الأمعاء. ومع ذلك ، فإن الاختلافات بين نمو الفأر والأمعاء البشرية تحد من قابلية تطبيق الفئران كنظام نموذجي. على سبيل المثال ، على الرغم من أن تكوين القبو في الأمعاء الدقيقة والقولون للفئران يحدث بعد الولادة ، إلا أن البشر يولدون بخبايا كاملةالتكوين 1. علاوة على ذلك ، تحتوي الأمعاء الدقيقة والقولون البشري على أنواع خلايا غير موجودة في الفئران ، بما في ذلك خلايا الغدد الصماء المعوية التي تعبر عن الموتيلين (MLN) في الأمعاءالدقيقة 2 وخلايا الكأس التي تعبر عن الميوسين 5B (MUC5B) في القولون3،4. لهذا السبب ، من المهم أن يكون لديك نظام زراعة خلايا يقوم بنمذجة الأحداث الجزيئية الديناميكية التي تحدد المراحل المبكرة من تطور القولون بدقة. لذلك ، فإن توجيه hPSCs لتوليد خلايا ذات خصائص القولون يوفر نموذجا قويا لدراسة تطور القولون البشري.
تم تطوير بروتوكولات لتسهيل التكوينالقابل للتكرار 5 والمتزامن والفعال للعضيات الشبيهةبالأمعاء 6 والعضويات الشبيهة بالقولون7 من hPSCs. تستخدم هذه البروتوكولات إجراء تمايز تدريجي يحاكي تطور الأمعاء والقولون الجنينية (الشكل 1). أولا ، يتم إنشاء الأديم الباطن النهائي من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات عن طريق العلاج باستخدام Activin A ، وهو محاكي عقدي. يؤدي تعرض الأديم الباطن النهائي لمستويات عالية من WNT وعامل نمو الخلايا الليفية (FGF) إلى التشكل في CDX2 + كرويات أنبوب المعى الأوسط / الخلفي. ثم يتم تضمين الأمعاء الوسطى / الأمعاء الكروية في المصفوفة خارج الخلية (ECM) ويتم تصميمها إما في HIOs أو HCOs من خلال معالجة عابرة لإشارات BMP. يؤدي تثبيط إشارات BMP باستخدام NOGGIN أو إضافة وسط النمو وحده إلى تكوين HIOs ، والتي تشبه الأمعاء الدقيقة القريبة من الإنسان.
من خلال تنشيط إشارات BMP باستخدام BMP2 ، يتم تصميم الأمعاء الوسطى / الخلفية في HCOs ، والتي تحتفظ بالزخرفة في الظهارة واللحمةالمتوسطة 7. تحتوي HCOs على خلايا كأس غنية بالقولون والتي تعبر عن MUC5B وهي مؤهلة لتوليد خلايا الغدد الصم المعوية الشبيهة بالأنسولين 5 (INSL5) الخاصة بالقولون. يعبر اللحمة المتوسطة المعزولة من HCOs عن الوسيط A13 (HOXA13) و HOXD13 ، والتي يتم التعبير عنها أيضا في اللحمة المتوسطة للقولون الأوليةالبشرية 8. من المهم أن تتذكر أن خطوة الزخرفة تحدث خلال الأيام 7-10 من بروتوكول التمايز. هذه الفترة التي تبلغ ثلاثة أيام كافية للحث على زخرفة القولون التي يتم الحفاظ عليها بعد الثقافة الممتدة في المختبر .
البروتوكولات الموضحة أدناه مخصصة للباحثين الذين هم على دراية بثقافة hPSC الخالية من المغذيات. بالنسبة للباحثين الذين ليسوا على دراية بهذا النوع من ثقافة hPSC ، يوصى بدورة تدريبية حول hPSCs مثل تلك التي تقدمها Stem Cells Technologies أو مرفق الخلايا الجذعية متعدد القدرات (PSCF) في مستشفى سينسيناتي للأطفال. تعد جودة hPSCs البادئة أمرا بالغ الأهمية ويمكن أن تؤثر على جميع خطوات المصب. سيبدأ البروتوكول التالي ب hPSCs التي نمت لمدة 4 أيام وجاهزة للانقسام.
1. توليد العضيات المعوية والقولونية البشرية
2. التحقق من زخرفة العضيات عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR)
3. التحقق من زخرفة العضيات عن طريق التألق المناعي
يدل التوليد الناجح للكبوتات الكروية خلال مرحلة تحريض الأمعاء الوسطى / الخلفية على الزخرفة الناجحة. قم بإجراء تلطيخ IF ل CDX2 على الكرات الكروية العائمة وعلى الطبقة الأحادية للتأكد من صحة الزخرفة. على الرغم من أن التلوين في مرحلة الأديم الباطن النهائي (DE) يمكن أن يشير إلى فعا...
يعد تمايز hPSCs إلى HIOs و HCOs عملية معقدة تتطلب ضوابط الجودة في كل خطوة. تحتاج hPSCs البادئة إلى الحد الأدنى من التمايز قبل بدء التمايز في DE. يعد تحسين كثافة hPSCs المطلية لتمايز DE أمرا بالغ الأهمية لنجاح البروتوكول. لضمان جودة تمايز DE ، قم بإجراء IF ل FOXA2 و SOX17 لتحديد كفاءة تمايز DE. يج?...
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
يتم تمويل مختبر Múnera من قبل NIH / NCI 5U54CA210962-02 مركز أبحاث التفاوتات في السرطان في ساوث كارولينا (SC CADRE) ، و NIH / NIGMS P20 GM130457-01A1 COBRE في أمراض الجهاز الهضمي والكبد ، و NIH / NIDDK 1P30 DK123704-01 MUSC مركز أبحاث أمراض الجهاز الهضمي.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1% Bovine serum albumin (BSA) solution | N/A | N/A | N/A |
15 mL Corning tube | Falcon | 21008-918 | N/A |
30% Sucrose | N/A | N/A | Made in PBS. |
5% Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 017-000-121 | N/A |
50 mL Corning tube | Falcon | 21008-951 | N/A |
Accutase | Thermo Scientific | A1110501 | Cell detachment solution; aliquot 5 mL of Accutase into 10 mL tubes totaling 20 tubes and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use. |
Activin A | Cell guidance Systems | GFH6-100x10 | Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Aliquot 38 µL of Activin A into prechilled microcentrifuge tubes and store at -80 °C (Tubes expire 12 months from date of receipt). |
Activin Day 1 medium (RPMI 1640) | Corning | MT10041CV | Use nonessential amino acids (NEAA, Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 1 medium: 500 mL of RPMI 1640 and 500 mL of NEAA. When preparing Activin Day 1 medium, add 13 mL of basic day 1 medium, 13 µl of Activin A (100 µg/mL), and 2 µl of BMP4 (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors. |
Activin Day 2 medium (RPMI 1640, 0.2% FBS vol/vol) | Hyclone | SH30070.03T | Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 2 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL of NEAA, and 1 mL of 0.2% serum. When preparing Activin Day 2 medium, add 12.5 mL of basic day 2 medium and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors. |
Activin Day 3 medium (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol) | Hyclone | SH30070.03T | Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 3 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL NEAA, and 10 mL of 2% serum. When preparing Activin Day 3 medium, add 12.5 mL of basic day 3 and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors. |
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Goat | Thermo Scientific | A11055 | 1:500 dilution (Secondary antibody) |
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit | Thermo Scientific | A21206 | 1:500 dilution (Secondary antibody) |
Alexa Fluor 546 Donkey anti-Mouse | Thermo Scientific | A10036 | 1:500 dilution (Secondary antibody) |
Alexa Fluor 647 Donkey anti-Mouse | Thermo Scientific | A31571 | 1:500 dilution (Secondary antibody) |
Base mold | Fisher | 22-363-552 | N/A |
Basic gut medium (advanced DMEM) | Gibco | 12491015 | When preparing Basic gut medium, add 500 mL of DMEM, 500 mL of N2 (Gibco 17-502-048), 500 mL of B27 (Gibco), 500 mL of L-Glutamine to get 2 mM L-Glutamine (Corning A2916801), 5 mL of 100 U/mL Penicillin-Streptomycin (Gibco 15-140-122), and 7.5 mL of 1 M HEPES to get 15 mM HEPES. The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors. |
Biorad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | N/A | Other qRT-PCR systems can be used. |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | ECM-degrading solution |
CHIR99021 | Reprocell | 4000410 | Reconstitute by adding 2.15 mL of DMSO at 10 mM. Prepare 50 µL aliquots and store at -20 °C. Store powder at 4 °C, protected from light. |
CTRL HIO patterning medium | N/A | N/A | Basic gut medium and 100 ng/mL EGF. |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:100 dilution (Secondary antibody) |
DE monolayer | N/A | N/A | Monolayer was generated in prior steps (Section 4.4). |
Dispase | Gibco | 17105041 | Resuspend lyophilized powder in Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) to a 1 mg/mL final concentration. Filter the solution for sterilization by vacuuming using a Millipore filter sterilization tube. Make 10 mL aliquots (1 mg/mL) and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use. |
EGF | Thermo Scientific | 236-EG-01M | When preparing 100 ng/mL EGF reconstitute 500 µg/mL in sterile PBS. Next add 2 mL of sterile PBS to 1 mg EGF and make 500 µg/mL EGF solution. Aliquot 100 µL of EGF in 20 tubes. |
Fisherbrand 6 cm Petri Dishes with Clear Lid | Fisher | FB0875713A | N/A |
Fisherbrand Cell Lifter | Fisher | 08-100-240 | N/A |
Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials with Closures Attached | Fisher | 03-338B | N/A |
Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipette | Fisher | 13-678-2D0 | N/A |
Fluoromount G Slide Mounting Medium | VWR | 100241-874 | N/A |
Gibco advanced DMEM | Gibco | 12-491-023 | N/A |
Goat anti-E-Cadherin | R&D systems | AF648 | 1:400 dilution (Primary antibody) |
Goat anti-SOX17 | R&D systems | AF1924 | 1:500 dilution (Primary antibody) |
HCOs patterning medium | N/A | N/A | Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL BMP2. When preparing BMP2, add 1 mL of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to BMP2 vials (100 µg). Aliquot 25 µL of BMP4 solution in 4 tubes. The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors. |
Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | N/A |
Human Pluripotent Stem Cells (hPSC) | Pluripotent Stem Cell Facility | N/A | Cells seeded in a Matrigel coated 24-well plate (Thermo Scientific 73520-906). |
Ice-cold 4% Paraformaldehyde solution (PFA) | N/A | N/A | N/A |
Ice-cold Phosphate Buffered Saline (PBS) | N/A | N/A | The pH must be 7.4. |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | 101098-065 | N/A |
Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) | Pluripotent Stem Cell Facility (Cincinnati Children's Hospital Medical Center) | N/A | Other hESC or iPSC lines can be used, but the protocol needs to be optimized for each cell line. |
Leica microtome | N/A | N/A | N/A |
LSM 880 | confocal microscope | ||
Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | N/A |
Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | Prepare 4 x Matrigel aliquots which corresponds to volumes sufficient to make enough diluted Matrigel for 4 x 6-well dishes. |
Mid-hindgut induction medium (RPMI 1640) | Corning | MT10041CV | Nonessential amino acids (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 µM CHIR99021 and 500 ng/mL FGF4. The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors. |
Mid-hindgut spheroids | N/A | N/A | N/A |
MilliporeSigma Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | MilliporeSigma | SCGP00525 | N/A |
Mouse anti-CDX2 | BioGenex | MU392-UC | 1:300 dilution (Primary antibody) |
Mouse anti-FOXA2 | Abnova/Novus | H00003170-M01 | 1:500 dilution |
mTeSR1 complete growth medium | Stem Cell technologies | 85870 | Add 100-mL of mTeSR supplement (85870) into one 400-mL mTeSR medium (85870) and aliquot into 50-mL tubes while avoiding contamination. Store at 4°C until use. |
Murray's Clear solution (Also known as BABB) | Murray's | N/A | 1:2 benzyl benzoate and benzyl alcohol. |
NOG HIO patterning medium | N/A | N/A | Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL NOGGIN (Dispense 25 µg of NOGGIN in 250 µl sterile PBS with 0.1% BSA). |
NucleoSpin RNA | Takara | 740955.25 | Other RNA isolation kits may be used. |
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells (Nunc) | Thermo Scientific | 73521-004 | N/A |
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells coated with Matrigel | Thermo Scientific | 73521-004 | N/A |
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells (Nunc) | Thermo Scientific | 73520-906 | N/A |
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells coated with Matrigel. | Thermo Scientific | 73520-906 | N/A |
Outgrowth medium for HIOs, CTRL HIOs, and HCOs | N/A | N/A | Basic gut medium and 100 ng/mL EGF (Final concentration) |
Phosphate Buffer Saline, 0.5% Triton X (PBS-T) | N/A | N/A | N/A |
Primers | Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT) | N/A | The primers are listed in Table 2 on the protocol. |
Rabbit anti-CDX2 | Cell Marque | EPR22764Y | 1:100 dilution (Primary antibody) |
Rabbit anti-SATB2 | Cell Marque | EP281 | 1:100 dilution (Primary antibody) |
Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D systems | 314-BP-010 | Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile 4 mM HCl containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Add 4.17 mL HCl solution to 45.83 mL molecular water totaling to 50 mL of 1 M HCl. Then add 200 µL of 1 M HCl to 49.8 mL of molecular grade water totaling to 50 mL of 4 mM HCl. Next add 0.05 g BSA to 50 mL of 4 mM HCl and filter to make sterile. Aliquot sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to 33 microcentrifuge tube totaling and store at -20 °C. Add 100 µl of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to the BMP4 vials (10 µg) to make BMP4 solution at 100 µg/mL. |
Recombinant Human FGF-4 Protein | R&D systems | 235-F4-01M | Reconstitute at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin. Add 0.05 g of BSA in 50 mL of PBS to make 0.1% BSA. Filter 0.22 µM BSA to sterilize the BSA. Aliquot 10 mL of 0.1% BSA in 5 tubes. Add 1 mg FGF-4 in 10 mL of sterile 0.1% BSA. Aliquot 250 µL into prechilled 40 microcentrifuge tubes and store at -80 °C. |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | The final concentration is 10 mM (10 mmol/L). Resuspend in DMSO at 10 mM and filter sterilize. Add 3 mL of sterile PBS to each vial. Aliqout 100 µL of ROCK inhibitor in 30 tubes and store at -20 °C. |
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | 11-754-250 | N/A |
SuperFrost Plus microscope slides | |||
Tissue Tek O.C.T Compound | VWR | 25608-930 | N/A |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved