توليد وصيانة وتوصيف العضيات المعوية والقولونية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

Summary

هنا ، يتم وصف طرق مفصلة لتوليد والحفاظ على وتوصيف العضيات المعوية الدقيقة والقولونية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. تم تصميم هذه الطرق لتحسين قابلية التكاثر وتوسيع قابلية التوسع وتقليل وقت العمل المطلوب لطلاء ومرور العضيات.

Abstract

تصف المواصفات الإقليمية المعوية عملية يتم من خلالها نقل التشكل والوظيفة الفريدة إلى مناطق محددة من الجهاز الهضمي النامي (GI). يتم تشغيل المواصفات الإقليمية في الأمعاء من خلال مسارات نمو متعددة ، بما في ذلك مسار البروتين المورفوجيني للعظام (BMP). بناء على المواصفات الإقليمية العادية ، تم تطوير طريقة لتوليد عضيات القولون البشري (HCOs) من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) ، والتي تشمل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hES) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs). تحريض لمدة ثلاثة أيام لإشارات BMP يضع أنماط كافية لثقافات أنبوب الأمعاء الوسطى / الخلفية في بروتين خاص غني بالتسلسل الغني ب AT 2 (SATB2) - يعبر عن HCOs التي تحتوي على جميع أنواع الخلايا الظهارية الرئيسية الموجودة في القولون البشري بالإضافة إلى الخلايا الوسيطة النامية المشتركة. أدى إغفال BMP (أو إضافة مثبط BMP NOGGIN) خلال فترة الزخرفة الحرجة هذه إلى تكوين عضيات معوية بشرية (HIOs). تشبه HIOs و HCOs شكليا وجزيئيا الأمعاء الدقيقة والقولون النامية للإنسان ، على التوالي. على الرغم من فائدة HIOs و HCOs لدراسة نمو الأمعاء البشرية ، فإن إنشاء HIOs و HCOs يمثل تحديا. تقدم هذه الورقة طرقا لتوليد والحفاظ على وتوصيف HIOs و HCOs. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير الخطوات الحاسمة في البروتوكول وتوصيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

Introduction

من الصعب دراسة نمو القولون البشري بسبب القيود المفروضة على استخدام أنسجة الجنين البشري. كانت النماذج الحيوانية لا تقدر بثمن واستخدمت تاريخيا للأساليب الجينية في الفئران لدراسة نمو الأمعاء. ومع ذلك ، فإن الاختلافات بين نمو الفأر والأمعاء البشرية تحد من قابلية تطبيق الفئران كنظام نموذجي. على سبيل المثال ، على الرغم من أن تكوين القبو في الأمعاء الدقيقة والقولون للفئران يحدث بعد الولادة ، إلا أن البشر يولدون بخبايا كاملة^{التكوين 1}. علاوة على ذلك ، تحتوي الأمعاء الدقيقة والقولون البشري على أنواع خلايا غير موجودة في الفئران ، بما في ذلك خلايا الغدد الصماء المعوية التي تعبر عن الموتيلين (MLN) في الأمعاء^{الدقيقة 2} وخلايا الكأس التي تعبر عن الميوسين 5B (MUC5B) في القولون^3،4. لهذا السبب ، من المهم أن يكون لديك نظام زراعة خلايا يقوم بنمذجة الأحداث الجزيئية الديناميكية التي تحدد المراحل المبكرة من تطور القولون بدقة. لذلك ، فإن توجيه hPSCs لتوليد خلايا ذات خصائص القولون يوفر نموذجا قويا لدراسة تطور القولون البشري.

تم تطوير بروتوكولات لتسهيل التكوين^{القابل للتكرار 5} والمتزامن والفعال للعضيات الشبيهة^{بالأمعاء 6} والعضويات الشبيهة بالقولون⁷ من hPSCs. تستخدم هذه البروتوكولات إجراء تمايز تدريجي يحاكي تطور الأمعاء والقولون الجنينية (الشكل 1). أولا ، يتم إنشاء الأديم الباطن النهائي من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات عن طريق العلاج باستخدام Activin A ، وهو محاكي عقدي. يؤدي تعرض الأديم الباطن النهائي لمستويات عالية من WNT وعامل نمو الخلايا الليفية (FGF) إلى التشكل في CDX2 ⁺ كرويات أنبوب المعى الأوسط / الخلفي. ثم يتم تضمين الأمعاء الوسطى / الأمعاء الكروية في المصفوفة خارج الخلية (ECM) ويتم تصميمها إما في HIOs أو HCOs من خلال معالجة عابرة لإشارات BMP. يؤدي تثبيط إشارات BMP باستخدام NOGGIN أو إضافة وسط النمو وحده إلى تكوين HIOs ، والتي تشبه الأمعاء الدقيقة القريبة من الإنسان.

من خلال تنشيط إشارات BMP باستخدام BMP2 ، يتم تصميم الأمعاء الوسطى / الخلفية في HCOs ، والتي تحتفظ بالزخرفة في الظهارة واللحمة^{المتوسطة 7}. تحتوي HCOs على خلايا كأس غنية بالقولون والتي تعبر عن MUC5B وهي مؤهلة لتوليد خلايا الغدد الصم المعوية الشبيهة بالأنسولين 5 (INSL5) الخاصة بالقولون. يعبر اللحمة المتوسطة المعزولة من HCOs عن الوسيط A13 (HOXA13) و HOXD13 ، والتي يتم التعبير عنها أيضا في اللحمة المتوسطة للقولون الأولية^{البشرية 8}. من المهم أن تتذكر أن خطوة الزخرفة تحدث خلال الأيام 7-10 من بروتوكول التمايز. هذه الفترة التي تبلغ ثلاثة أيام كافية للحث على زخرفة القولون التي يتم الحفاظ عليها بعد الثقافة الممتدة في المختبر .

البروتوكولات الموضحة أدناه مخصصة للباحثين الذين هم على دراية بثقافة hPSC الخالية من المغذيات. بالنسبة للباحثين الذين ليسوا على دراية بهذا النوع من ثقافة hPSC ، يوصى بدورة تدريبية حول hPSCs مثل تلك التي تقدمها Stem Cells Technologies أو مرفق الخلايا الجذعية متعدد القدرات (PSCF) في مستشفى سينسيناتي للأطفال. تعد جودة hPSCs البادئة أمرا بالغ الأهمية ويمكن أن تؤثر على جميع خطوات المصب. سيبدأ البروتوكول التالي ب hPSCs التي نمت لمدة 4 أيام وجاهزة للانقسام.

Protocol

1. توليد العضيات المعوية والقولونية البشرية

1. تحضير الألواح المطلية ب ECM
   1. أضف 50 مل من وسط DMEM البارد في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
   2. قم بإزالة كمية من 4x ECM المؤهل hESC (انظر جدول المواد) من الفريزر -80 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج.
      ملاحظة: ارجع إلى شهادة تحليل المنتج لتحديد حجم ECM المؤهل ESC المطلوب لإعداد مخزون 4x.
   3. إذا لم يتم إذابة ECM المؤهل من hESC بالكامل ، فخذ 750 ميكرولتر من DMEM من الأنبوب المخروطي سعة 50 مل واخلطه مع ECM.
   4. انقل خليط ECM المؤهل من DMEM / hESC إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مل مع DMEM واخلطه جيدا. أضف 0.5 مل لكل بئر في كل من ألواح زراعة الخلايا المكونة من 4 × 24 بئر.
   5. رج الألواح لتوزيع ECM بالتساوي في جميع أنحاء البئر لضمان تغطية السطح بالكامل. باستخدام البارافيلم ، أغلق الألواح المطلية ب ECM واتركها في درجة حرارة الغرفة في خزانة السلامة الحيوية لمدة 1 ساعة على الأقل. قم بتخزين الأطباق المطلية ب ECM في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين أو حتى الحاجة.
2. hPSCs طلاء أحادي الخلية
   1. ضع صفيحة 24 بئرا مطلية ب ECM داخل خزانة السلامة الحيوية لمدة 30 دقيقة للسماح لها بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة.
   2. ضع mTeSR1 المتوسط الكامل ، ومحلول انفصال الخلايا ، و DMEM المتقدم داخل حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية واتركها تسخن لمدة 30 دقيقة.
   3. تحقق من أن hPSCs متقاء بنسبة 85٪ على الأقل مع الحد الأدنى من التمايز. قم بإزالة أي خلايا متمايزة إذا لزم الأمر.
   4. قم بإعداد وسط الطلاء في أنبوب مخروطي سعة 50 مل على النحو التالي: 13 مل من mTeSR1 و 13 ميكرولتر من مثبط بروتين كيناز Y-27632 المرتبط ب Rho (ROCK) 10 مليمتر.
      ملاحظة: Y-27632 يمنع anoikis ويزيد من بقاء الخلايا المفردة.
   5. لجمع الخلايا من صفيحة مكونة من 6 آبار ، قم بشفط الوسط من 3 إلى 4 آبار واغسلها مرة واحدة ب 2 مل من DMEM المتقدم لكل بئر.
   6. استنشق DMEM المتقدم وقم بتوزيع 1 مل من محلول تفكك الخلايا في كل بئر. احتضن اللوحة لمدة 5-7 دقائق داخل حاضنة 5٪ CO₂ ، 37 درجة مئوية. تحقق تحت المجهر من أن الخلايا معلقة.
   7. افصل أي كتل متبقية من الخلايا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 4-5 مرات باستخدام ماصة سعة 5 مل.
   8. أضف 2 مل من DMEM المتقدم في كل بئر، ثم قم برفع الماصة برفق لأعلى ولأسفل 4-5 مرات، ثم انقله إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   9. استنشق الوسط من الأنبوب دون شفط حبيبات الخلية وأضف 6 مل من الوسط المحضر من mTeSR1 بالإضافة إلى مثبط الصخور. أعد تعليق الخلايا برفق عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل 3-4 مرات ثم انقل التعليق إلى باقي وسيط مثبط mTeSR1/ROCK داخل الأنبوب سعة 50 مل. قم بتعليق الخلايا بقوة 4-5 مرات وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
   10. قم بشفط ECM من اللوحة المكونة من 24 بئرا قبل طلاء الخلايا مباشرة. أعد تعليق الخلايا مرة أخرى عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 2-3 مرات وتوزيع 0.5 مل من تعليق الخلية في كل بئر.
       ملاحظة: يجب تحديد كثافة الطلاء المثلى من قبل المجري. هنا ، رقم الخلية الأمثل هو 80,000-200,000 خلية لكل بئر.
   11. قم بهز اللوحة برفق 3 مرات في اتجاه عقارب الساعة ، و 3 مرات عكس اتجاه عقارب الساعة ، و 3 مرات للأمام والخلف ، و 3 مرات جنبا إلى جنب لتفريق الخلايا بالتساوي.
   12. انقل اللوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ واحتضانها لمدة 24 ساعة.
       ملاحظة: لا تزعج اللوحة في الساعات القليلة الأولى لضمان التشتت المناسب للخلايا داخل الآبار.
   13. بعد 24 ساعة (الشكل 2 أ) ، استنشق الوسط المستهلك ، وأضف 0.5 مل لكل بئر من mTeSR1 ، واحتضن مرة أخرى عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 24 ساعة (الشكل 2 ب) ، ثم انتقل إلى الخطوة التالية.
3. التمايز بين الأديم الباطن النهائي (DE) والخلايا الجذعية المزمنة
   1. في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، أضف 13 مل من وسط Activin Day 1 (انظر جدول المواد) ، و 13 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل Activin A ، و 1.95 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل BMP4. قم بتسخين الوسط في حمام مائي 37 درجة مئوية.
   2. استنشق وسط mTeSR1 من اللوحة المكونة من 24 بئرا وأضف 0.5 مل من وسط Activin Day 1 لكل بئر. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ واحتضانها لمدة 24 ساعة. افحص الخلايا بعد 24 ساعة.
      ملاحظة: يجب أن يكون موت الخلايا على نطاق واسع واضحا ، كما هو موضح في الشكل 2 ج. على الرغم من أن الطبقة الأحادية ستظهر متناثرة ، إلا أن مستعمرات الخلايا قد توسعت.
   3. قم بإعداد وسيط Activin Day 2 الكامل عن طريق إضافة 12.5 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل Activin A إلى 12.5 مل من وسط Activin Day 2 في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية.
   4. أخرج لوحة التمايز المكونة من 24 بئرا من حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ وقم بإزالة الوسط المستهلك. قم بتوزيع 0.5 مل من وسط Activin Day 2 المسخن مسبقا لكل بئر وضع الطبق مرة أخرى داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: يجب توخي الحذر عند الاستغناء عن الوسيط. لا تقم بتوزيع الوسيط مباشرة في وسط البئر ، لأن هذا سيؤدي إلى فصل الخلايا في الطبقة الأحادية. قم بتوزيع الوسط بعناية أسفل جانب البئر. في اليوم التالي ، تتشكل طبقة أحادية من الخلايا مع موت الخلايا بشكل ضئيل. يجب أن تكون الخلايا الآن ~ 90 إلى 95٪ ملتقية (الشكل 2 د).
   5. قم بإعداد وسط Activin Day 3 الكامل عن طريق إضافة 12.5 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل Activin A إلى 12.5 مل من وسط Activin Day 3 في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية.
   6. قم بإزالة الوسط المستهلك وقم بتوزيع 0.5 مل من وسط Activin Day 3 لكل بئر.
      ملاحظة: يجب توخي الحذر عند الاستغناء عن الوسط. لا تقم بتوزيع الوسيط مباشرة في وسط البئر لأن هذا سيؤدي إلى فصل الخلايا في الطبقة الأحادية. قم بتوزيع الوسط بعناية أسفل جانب البئر. في اليوم التالي ، يجب أن تصل الطبقة الأحادية إلى التقاء كامل مع القليل من موت الخلايا أو معدوما في هذه المرحلة. لا تحاول توليد كرويات في منتصف المعى الخلفي إذا لم تكن الطبقة الأحادية متقاربة بعد 24 ساعة من إضافة وسط Activin Day 3. ارجع إلى الشكل 2E للحصول على التشكل المثالي للطبقة الأحادية DE قبل الشروع في توليد الأمعاء الكروية في منتصف الأمعاء الخلفية.
   7. قم بإجراء تلطيخ التألق المناعي (IF) للطبقة الأحادية للتعبير عن بروتين A2 صندوق الشوكة (FOXA2) ومنطقة تحديد الجنس Y (SRY) - عامل النسخ 17 (SOX17) عند تحسين تمايز DE.
4. تمايز DE إلى كرويات منتصف الأمعاء الخلفية
   1. في أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، أضف 25 مل من وسط الحث في منتصف الأمعاء الخلفية مع FGF4 (بدون CHIR99021) وضعه في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   2. لتحضير وسط الحث الكامل في منتصف المعاء الخلفي ، أضف 7.5 ميكرولتر من CHIR99021 بعد أن يصبح الوسط دافئا.
   3. قم بإزالة الوسط المستهلك ، وقم بتوزيع 0.5 مل من وسط الحث في منتصف الأمعاء الخلفية لكل بئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 24 ساعة.
   4. بعد حدوث تكثيف الخلايا داخل الطبقة الأحادية في اليوم التالي (الشكل 3 أ) ، استبدل الوسط المستهلك بوسط تحريض جديد في منتصف الأمعاء الخلفية وضع اللوحة مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: ستكون الهياكل الأنبوبية ملحوظة بعد 48 ساعة من تحريض منتصف الأمعاء الخلفية ، كما هو موضح في الشكل 3 ب. ستبدأ الأمعاء الكروية في منتصف الأمعاء الخلفية في التبرعم من الطبقة الأحادية في اليوم 3 ، كما هو موضح في الشكل 3C.
   5. لتجنب التخلص من الكرويات العائمة أثناء تغيير الوسط ، انقل الوسط القديم إلى أنبوب سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 1 دقيقة. أعد تعليق الكرات في 12.5 مل من وسط الحث الطازج في منتصف الأمعاء الخلفية ، وأضف 0.5 مل لكل بئر في نفس اللوحة المكونة من 24 بئرا ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 24 ساعة.
   6. في اليوم 4 من تحريض الأمعاء الخلفية (الشكل 3 د) ، قم بحصاد الكرات الكروية العائمة من آبار الصفائح عن طريق جمع الوسط في أنبوب سعة 15 مل متبوعا بالطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 1 دقيقة. انتقل إلى الخطوة التالية لتضمين الأمعاء الكروية في منتصف الأمعاء الخلفية في ECM.
5. طلاء ونقوش الأمعاء الكروية الوسطى / الخلفية في ECM
   1. قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي ECM عند 4 درجات مئوية طوال الليل قبل التضمين.
      ملاحظة: يختلف ECM هذا عن ECM المؤهل من hESC. يجب وضع ECM على الجليد ، ويمكن تقسيم الحجم المناسب من ECM إلى أنابيب طرد مركزي دقيق مبردة مسبقا سعة 1.5 مل على الجليد. يحتوي الجدول 1 على معلومات عن حجم ECM. تأكد من أن حجم ECM لا يقل عن 75٪ في القطرة التي سيتم تضمين الكرويات فيها.
   2. قم بتسخين طبق 24 بئرا في حاضنة 37 درجة مئوية.
   3. اجمع الكرات الكروية العائمة من جميع البئر ال 24 باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. قم بتدوير الكرات عند 300 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استنشق معظم الوسط ولكن اترك الحجم المطلوب للطلاء (الجدول 1).
   4. قم بإعداد 1000 ميكرولتر و200 ميكرولتر من أطراف الماصة عن طريق قص أطرافها. أخرج الطبق الدافئ مسبقا المكون من 24 بئرا.
   5. امزج الكرات العائمة ، وانقل الحجم المناسب إلى أنبوب ECM الموجود على الجليد ، ثم أعد تعليق الكرويات و ECM عن طريق سحب العينة لخلطها جيدا.
   6. خذ 65 ميكرولتر من خليط الكرويات و ECM مع أطراف الماصة المقطوعة 200 ميكرولتر وقم بتحميلها إلى وسط كل بئر في اللوحة المكونة من 24 بئرا. للتأكد من تكوين قطرة جيدة من ECM ، ارفع الماصة برفق وببطء أثناء توزيع الخليط.
      ملاحظة: لوحة 30-100 كروية لكل بئر.
   7. انقل اللوحة برفق إلى حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ واحتضانها لمدة 5 دقائق.
   8. اقلب اللوحة رأسا على عقب واحتضنها لمدة 15-25 دقيقة ، مما سيساعد قطرات ECM على الحفاظ على هيكل يشبه القبة.
   9. أثناء الحضانة ، قم بإعداد الوسيط المطلوب وتسخينه. بمجرد ترسيخ ECM ، أضف 0.5 مل من وسط نمط HIO أو HCO في كل بئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. انظر الشكل 3E للحصول على صورة للمركبات الكروية في ECM.
   10. استزراع الكرويات في وسط الزخرفة لمدة 3 أيام.
   11. بعد 3 أيام ، قم بتغيير وسط نمط HIO أو HCO إلى وسط النمو الطبيعي واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
       ملاحظة: العضيات في هذه المرحلة الزمنية (اليوم 10) هي عضيات في مرحلة مبكرة. بناء على هدف المشروع ، يمكن استخدام بعض العضيات في المراحل المبكرة لتحليل الزخرفة المبكر ، كما هو مفصل في القسم 2.
6. نمو ومرور العضيات المعوية والقولونية البشرية
   1. بعد اليوم 10 ، قم بتغيير وسط النمو كل 3 أيام.
      ملاحظة: اعتمادا على كثافة الطلاء ونمو العضيات ، قد تكون هناك حاجة إلى تغييرات أكثر تكرارا في الوسائط. يجب إجراء تغييرات متوسطة قبل أن يصبح الفينول الأحمر (مؤشر الأس الهيدروجيني) في الوسط أصفر.
   2. احتضان العضيات حتى اليوم 21 (الشكل 3F).
      ملاحظة: سيؤدي علاج BMP2 إلى تقليل عدد العضيات (~ 3 أضعاف أقل من HIOs) التي تنمو من الكرويات. لذلك ، يجب طلاء عدد أكبر من المركبات لتوليد HCOs.
7. انقسام العضيات في اليوم 21
   1. افحص العضيات.
      ملاحظة: يجب تقسيم العضيات في اليوم 21 حيث يكاد يكون ECM متدهورا بحلول اليوم 21 بسبب نمو العضوية وتوسعها.
   2. قم بإعداد أطراف الماصة سعة 1000 ميكرولتر و200 ميكرولتر عن طريق قص أطرافها.
   3. قم بتسخين طبق Nunc سعة 24 بئرا في حاضنة 37 درجة مئوية.
   4. اقتبس الحجم المناسب من ECM في أنابيب 1.5 مل المبردة مسبقا (الجدول 1).
   5. اكشط قطرة ECM برفق باستخدام العضيات بطرف ماصة 1000 ميكرولتر وقم بتحريك الخليط لأعلى ولأسفل عدة مرات لتفتيت وحدة التحكم في المؤسسة.
   6. انقل الخليط إلى طبق بتري 60 مم وتحقق من العضيات تحت المجهر. إذا لزم الأمر ، افصل العضيات عن بعضها البعض باستخدام ملقط معقم. تأكد من أن الفصل لا يضر بظهارة العضيات.
   7. انقل العضيات إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 30 ثانية. استنشق المادة الطافية واترك ~ 1 مل من الوسط في الأنبوب.
      ملاحظة: يمكن تغيير حجم الوسيط بناء على الغرض من التجربة. إذا كانت هناك حاجة إلى المزيد من العضيات لكل قطرة ECM ، فيمكن تقليل الحجم المتوسط. ومع ذلك ، إذا كانت هناك حاجة إلى عدد أقل من العضيات ، فيمكن زيادة الحجم المتوسط.
   8. امزج العضيات جيدا ، وانقل الحجم المناسب إلى أنبوب ECM الموجود على الجليد ، ثم أعد تعليق العضيات و ECM عن طريق سحب العينات لخلطها جيدا.
   9. أضف 65 ميكرولتر من خليط الكرويات ووحدة التحكم في المحرك إلى وسط كل بئر من الصفيحة المكونة من 24 بئرا باستخدام أطراف الماصة المقطوعة سعة 200 ميكرولتر.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان تناول العضيات أولا ثم ECM أثناء سحب العينات. وبالتالي ، أثناء توزيع الخليط ، تكون العضيات في الجزء العلوي من قطرة ECM.
   10. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 5 دقائق.
   11. اقلب اللوحة رأسا على عقب لمدة 15-25 دقيقة أخرى لمساعدة قطرات ECM في الحفاظ على هيكل يشبه القبة.
   12. أضف 0.5 مل من وسط نمو HIO / HCO في كل بئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
       ملاحظة: وسط النمو هو نفسه لكل من HIOs و HCOs بعد الزخرفة.
   13. قم بتغيير الوسيط كل 2-3 أيام حتى اليوم 35 (الشكل 3G).

2. التحقق من زخرفة العضيات عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR)

1. قبل جمع الحمض النووي الريبي ، قم بإعداد 1x مخزن مؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
2. تخلص من الوسط المستهلك وأضف 350 ميكرولتر من محلول التحلل إلى كل بئر من اللوحة المكونة من 24 بئرا. قم بتحليل العضيات عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 1 مل. للحصول على تحلل أفضل ، قم بالدوامة لفترة وجيزة بأقصى سرعة لمدة 5 ثوان.
3. احتفظ بجميع العينات عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لاستخراج الحمض النووي الريبي. بمجرد أن تصبح جاهزا ، قم بإزالة عينات الحمض النووي الريبي من الفريزر -80 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج على الجليد لمدة 10 دقائق. دوامة الأنابيب بقوة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة لضمان التحلل الكامل للعينات.
4. ضع العينات على الجليد مرة أخرى وانتقل إلى استخراج الحمض النووي الريبي حسب تعليمات الشركة المصنعة. انقل عينات الحمض النووي الريبي إلى فريزر -80 درجة مئوية إذا لم تكن جاهزة للمتابعة إلى الخطوة التالية.
5. إجراء استخراج الحمض النووي الريبي ومعالجة الحمض النووي وتخليق الحمض النووي (كدنا) وRT-qPCR باستخدام المنهجية القياسية. راجع الجدول 2 للحصول على قائمة بأسماء التمهيدي والتسلسلات.

3. التحقق من زخرفة العضيات عن طريق التألق المناعي

1. جمع وتثبيت العضيات
   1. قم بشفط وسط HIO أو HCO من الآبار المناسبة وأضف 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج (PBS) إلى كل بئر. افصل العضيات عن وحدة التحكم في المحرك باستخدام طرف ماصة مقطوعة سعة 200 ميكرولتر. الماصة لأعلى ولأسفل لفصل أجزاء كبيرة من ECM عن العضيات.
   2. انقل العضيات إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل واملأ باقي الأنبوب ب PBS المثلج واخلطه برفق عن طريق قلب الأنبوب. اسمح للعضيات بالاستقرار عن طريق الجاذبية واستنشاق PBS.
      ملاحظة: إذا لم تستقر العضيات عن طريق الجاذبية ، فقم بجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 1 دقيقة.
   3. قم بشفط PBS وأضف 1 مل من محلول تحلل ECM المثلج. احتفظ بالأنبوب على الجليد لمدة 10-15 دقيقة على منصة دوارة مع اهتزاز لطيف.
      ملاحظة: قم بإمالة الأنبوب بزاوية 45 درجة للسماح بالخلط السليم للعضويات ومحلول استعادة الخلايا. بعد 10-15 دقيقة ، يجب أن تستقر العضيات في قاع الأنبوب ، مما يشير إلى الهضم الكامل ل ECM.
   4. أضف PBS باردا في الأنبوب حتى 15 مل ؛ تخلط جيدا عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. عندما تستقر العضيات في قاع الأنبوب ، قم بشفط PBS وأضف 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد المبرد مسبقا لإصلاح العضيات. احتضان العضيات مع 4٪ بارافورمالدهيد على الجليد لمدة 1 ساعة.
   5. املأ باقي الأنبوب بنظام PBS المثلج وضعه أفقيا على منصة هزازة عند 4 درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، تخلص من بارافورمالدهايد / PBS في حاوية النفايات المحددة واغسلها مرة واحدة ب 15 مل من PBS المثلج ، كما هو موضح في الخطوة 3.1.2.
   6. استنشق PBS واملأ الأنبوب بنسبة 30٪ سكروز في PBS. ضع الأنبوب أفقيا على منصة هزازة عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
   7. في اليوم التالي ، قم بتضمين العضيات في نموذج أساسي 7 مم × 7 مم × 5 مم مع وسيط OCT وتجميد سريع باستخدام حمام ثلج جاف / إيثانول.
   8. جفف الكتل بمناديل مبللة للمعملية ، ولفها بمنشفة ورقية ، واحتفظ بها في فريزر -80 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بقص أقسام 5 ميكرومتر على شرائح المجهر باستخدام ناظم التبريد. قم بتخزين الشرائح عند -80 درجة مئوية.
2. تلطيخ التألق المناعي للعضيات
   1. قم بمعالجة الشرائح من الفريزر -80 درجة مئوية وقم بإجراء تلطيخ IF باستخدام البروتوكولات القياسية.
   2. ضع أغطية على الشرائح وجففها في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء لمدة ساعتين على الأقل أو طوال الليل قبل التصوير.
   3. قم بتصوير الشرائح باستخدام هدف 25x من المجهر متحد البؤر.

النتائج

يدل التوليد الناجح للكبوتات الكروية خلال مرحلة تحريض الأمعاء الوسطى / الخلفية على الزخرفة الناجحة. قم بإجراء تلطيخ IF ل CDX2 على الكرات الكروية العائمة وعلى الطبقة الأحادية للتأكد من صحة الزخرفة. على الرغم من أن التلوين في مرحلة الأديم الباطن النهائي (DE) يمكن أن يشير إلى فعا...

Discussion

يعد تمايز hPSCs إلى HIOs و HCOs عملية معقدة تتطلب ضوابط الجودة في كل خطوة. تحتاج hPSCs البادئة إلى الحد الأدنى من التمايز قبل بدء التمايز في DE. يعد تحسين كثافة hPSCs المطلية لتمايز DE أمرا بالغ الأهمية لنجاح البروتوكول. لضمان جودة تمايز DE ، قم بإجراء IF ل FOXA2 و SOX17 لتحديد كفاءة تمايز DE. يج?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Bovine serum albumin (BSA) solution	N/A	N/A	N/A
15 mL Corning tube	Falcon	21008-918	N/A
30% Sucrose	N/A	N/A	Made in PBS.
5% Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Lab	017-000-121	N/A
50 mL Corning tube	Falcon	21008-951	N/A
Accutase	Thermo Scientific	A1110501	Cell detachment solution; aliquot 5 mL of Accutase into 10 mL tubes totaling 20 tubes and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use.
Activin A	Cell guidance Systems	GFH6-100x10	Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Aliquot 38 µL of Activin A into prechilled microcentrifuge tubes and store at -80 °C (Tubes expire 12 months from date of receipt).
Activin Day 1 medium (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Use nonessential amino acids (NEAA, Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 1 medium: 500 mL of RPMI 1640 and 500 mL of NEAA. When preparing Activin Day 1 medium, add 13 mL of basic day 1 medium, 13 µl of Activin A (100 µg/mL), and 2 µl of BMP4 (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Activin Day 2 medium (RPMI 1640, 0.2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03T	Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 2 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL of NEAA, and 1 mL of 0.2% serum. When preparing Activin Day 2 medium, add 12.5 mL of basic day 2 medium and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Activin Day 3 medium (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03T	Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 3 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL NEAA, and 10 mL of 2% serum. When preparing Activin Day 3 medium, add 12.5 mL of basic day 3 and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Goat	Thermo Scientific	A11055	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit	Thermo Scientific	A21206	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 546 Donkey anti-Mouse	Thermo Scientific	A10036	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 647 Donkey anti-Mouse	Thermo Scientific	A31571	1:500 dilution (Secondary antibody)
Base mold	Fisher	22-363-552	N/A
Basic gut medium (advanced DMEM)	Gibco	12491015	When preparing Basic gut medium, add 500 mL of DMEM, 500 mL of N2 (Gibco 17-502-048), 500 mL of B27 (Gibco), 500 mL of L-Glutamine to get 2 mM L-Glutamine (Corning A2916801), 5 mL of 100 U/mL Penicillin-Streptomycin (Gibco 15-140-122), and 7.5 mL of  1 M HEPES to get 15 mM HEPES.  The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Biorad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Biorad	N/A	Other qRT-PCR systems can be used.
Cell Recovery Solution	Corning	354253	ECM-degrading solution
CHIR99021	Reprocell	4000410	Reconstitute by adding 2.15 mL of DMSO at 10 mM. Prepare 50 µL aliquots and store at -20 °C.  Store powder at 4 °C, protected from light.
CTRL HIO patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium and 100 ng/mL EGF.
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	1:100 dilution (Secondary antibody)
DE monolayer	N/A	N/A	Monolayer was generated in prior steps (Section 4.4).
Dispase	Gibco	17105041	Resuspend lyophilized powder in Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) to a 1 mg/mL final concentration. Filter the solution for sterilization by vacuuming using a Millipore filter sterilization tube. Make 10 mL aliquots (1 mg/mL) and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use.
EGF	Thermo Scientific	236-EG-01M	When preparing 100 ng/mL EGF reconstitute 500 µg/mL in sterile PBS. Next add 2 mL of sterile PBS to 1 mg EGF and make 500 µg/mL EGF solution. Aliquot 100 µL of EGF in 20 tubes.
Fisherbrand 6 cm Petri Dishes with Clear Lid	Fisher	FB0875713A	N/A
Fisherbrand Cell Lifter	Fisher	08-100-240	N/A
Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials with Closures Attached	Fisher	03-338B	N/A
Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipette	Fisher	13-678-2D0	N/A
Fluoromount G Slide Mounting Medium	VWR	100241-874	N/A
Gibco advanced DMEM	Gibco	12-491-023	N/A
Goat anti-E-Cadherin	R&D systems	AF648	1:400 dilution (Primary antibody)
Goat anti-SOX17	R&D systems	AF1924	1:500 dilution (Primary antibody)
HCOs patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL BMP2. When preparing BMP2, add 1 mL of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to BMP2 vials (100 µg). Aliquot 25 µL of BMP4 solution in 4 tubes.  The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	N/A
Human Pluripotent Stem Cells (hPSC)	Pluripotent Stem Cell Facility	N/A	Cells seeded in a Matrigel coated 24-well plate (Thermo Scientific 73520-906).
Ice-cold 4% Paraformaldehyde solution (PFA)	N/A	N/A	N/A
Ice-cold Phosphate Buffered Saline (PBS)	N/A	N/A	The pH must be 7.4.
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	101098-065	N/A
Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)	Pluripotent Stem Cell Facility (Cincinnati Children's Hospital Medical Center)	N/A	Other hESC or iPSC lines can be used, but the protocol needs to be optimized for each cell line.
Leica microtome	N/A	N/A	N/A
LSM 880			confocal microscope
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	N/A
Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	Prepare 4 x Matrigel aliquots which corresponds to volumes sufficient to make enough diluted Matrigel for 4 x 6-well dishes.
Mid-hindgut induction medium (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Nonessential amino acids (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 µM CHIR99021 and 500 ng/mL FGF4. The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Mid-hindgut spheroids	N/A	N/A	N/A
MilliporeSigma Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	MilliporeSigma	SCGP00525	N/A
Mouse anti-CDX2	BioGenex	MU392-UC	1:300 dilution (Primary antibody)
Mouse anti-FOXA2	Abnova/Novus	H00003170-M01	1:500 dilution
mTeSR1 complete growth medium	Stem Cell technologies	85870	Add 100-mL of mTeSR supplement (85870) into one 400-mL mTeSR medium (85870) and aliquot into 50-mL tubes while avoiding contamination. Store at 4°C until use.
Murray's Clear solution (Also known as BABB)	Murray's	N/A	1:2 benzyl benzoate and benzyl alcohol.
NOG HIO patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL NOGGIN (Dispense 25 µg of NOGGIN in 250 µl sterile PBS with 0.1% BSA).
NucleoSpin RNA	Takara	740955.25	Other RNA isolation kits may be used.
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells (Nunc)	Thermo Scientific	73521-004	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells coated with Matrigel	Thermo Scientific	73521-004	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells (Nunc)	Thermo Scientific	73520-906	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells coated with  Matrigel.	Thermo Scientific	73520-906	N/A
Outgrowth medium for HIOs, CTRL HIOs, and HCOs	N/A	N/A	Basic gut medium and 100 ng/mL EGF (Final concentration)
Phosphate Buffer Saline, 0.5% Triton X (PBS-T)	N/A	N/A	N/A
Primers	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT)	N/A	The primers are listed in Table 2 on the protocol.
Rabbit anti-CDX2	Cell Marque	EPR22764Y	1:100 dilution (Primary antibody)
Rabbit anti-SATB2	Cell Marque	EP281	1:100 dilution (Primary antibody)
Recombinant Human BMP-4 Protein	R&D systems	314-BP-010	Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile 4 mM HCl containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Add 4.17 mL HCl solution to 45.83 mL molecular water totaling to 50 mL of 1 M HCl. Then add 200 µL of 1 M HCl to 49.8 mL of molecular grade water totaling to 50 mL of 4 mM HCl. Next add 0.05 g BSA to 50 mL of 4 mM HCl and filter to make sterile. Aliquot sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to 33 microcentrifuge tube totaling and store at -20 °C. Add 100 µl of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to the BMP4 vials (10 µg) to make BMP4 solution at 100 µg/mL.
Recombinant Human FGF-4 Protein	R&D systems	235-F4-01M	Reconstitute at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin. Add 0.05 g of BSA in 50 mL of PBS to make 0.1% BSA. Filter 0.22 µM BSA to sterilize the BSA. Aliquot 10 mL of 0.1% BSA in 5 tubes. Add 1 mg FGF-4 in 10 mL of sterile 0.1% BSA. Aliquot 250 µL into prechilled 40 microcentrifuge tubes and store at -80 °C.
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris	1254	The final concentration is 10 mM (10 mmol/L). Resuspend in DMSO at 10 mM and filter sterilize. Add 3 mL of sterile PBS to each vial. Aliqout 100 µL of ROCK inhibitor in 30 tubes and store at -20 °C.
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Thermo Scientific	11-754-250	N/A
SuperFrost Plus microscope slides
Tissue Tek O.C.T Compound	VWR	25608-930	N/A