人多能干细胞来源的肠道和结肠类器官的生成、维持和表征

摘要

这里描述了生成、维持和表征人类多能干细胞衍生的小肠和结肠类器官的详细方法。这些方法旨在提高可重复性、扩大可扩展性并减少类器官铺板和传代所需的工作时间。

摘要

肠道区域规范描述了一个过程，通过该过程，独特的形态和功能被赋予发育中的胃肠道 （GI） 的确定区域。肠道中的区域规范由多种发育途径驱动，包括骨形态发生蛋白 （BMP） 途径。基于正常的区域规范，开发了一种从人多能干细胞 （hPSC） 生成人结肠类器官 （HCO） 的方法，其中包括人胚胎干细胞 （hES） 和诱导多能干细胞 （iPSC）。BMP 信号传导的 3 天诱导将中/后肠管培养物充分模式化为特殊的富含 AT 的序列结合蛋白 2 （SATB2） 表达的 HCO，其中包含人结肠中存在的所有主要上皮细胞类型以及共同发育的间充质细胞。在这个关键模式期间省略 BMP（或添加 BMP 抑制剂 NOGGIN）导致人肠道类器官 （HIO） 的形成。HIO 和 HCOs 在形态和分子上分别类似于人类发育中的小肠和结肠。尽管 HIO 和 HCO 可用于研究人类肠道发育，但 HIO 和 HCO 的生成具有挑战性。本文介绍了生成、维护和表征 HIO 和 HCO 的方法。此外，还提供了协议中的关键步骤和故障排除建议。

引言

由于对人类胎儿组织的使用受到限制，研究人类结肠发育很困难。动物模型具有不可估量的价值，历史上曾用于小鼠的遗传方法以研究肠道发育。然而，小鼠和人类肠道发育之间的差异限制了小鼠作为模型系统的适用性。例如，虽然小鼠的小肠和结肠中的隐窝形成发生在出生后，但人类出生时就有完全形成的隐窝¹。此外，人类小肠和结肠包含小鼠中没有的细胞类型，包括小肠中表达胃动素 （MLN） 的肠内分泌细胞² 和结肠中表达粘蛋白 5B （MUC5B） 的杯状细胞 ^3,4。因此，拥有一个能够准确模拟定义结肠发育早期阶段的动态分子事件的细胞培养系统非常重要。因此，指导 hPSCs 产生具有结肠特征的细胞为研究人类结肠发育提供了一个强大的模型。

已经开发了方案，以促进 hPSC 可重现⁵、同步和高效地形成肠样⁶ 和结肠样类器官⁷ 。这些方案使用模拟胎儿肠道和结肠发育的逐步分化程序（图 1）。首先，通过用 Activin A（一种 Nodal 模拟物）处理，从人多能干细胞中产生最终内胚层。最终内胚层暴露于高水平的 WNT 和成纤维细胞生长因子 （FGF） 诱导形态发生为 CDX2 ⁺ 中/后肠管球体。然后将中肠/后肠球体嵌入细胞外基质 （ECM） 中，并通过 BMP 信号转导的瞬时作形成 HIO 或 HCO。使用 NOGGIN 或单独添加生长培养基抑制 BMP 信号传导会导致 HIO 的形成，类似于人类近端小肠。

通过使用 BMP2 激活 BMP 信号传导，中/后肠球体被图案化为 HCO，HCO 保留在上皮和间充质⁷ 中。HCO 包含富含结肠、表达 MUC5B 的杯状细胞，能够产生表达结肠特异性胰岛素样 5 （INSL5） 的肠内分泌细胞。来自 HCO 的分离间充质表达同源框 A13 （HOXA13） 和 HOXD13，它们也在人原代结肠间充质⁸ 中表达。重要的是要记住，图案化步骤发生在分化方案的第 7-10 天。这三天的时间足以诱导结肠模式，该模式在长时间 的体外 培养后得以维持。

下面描述的方案适用于熟悉无饲养层 hPSC 培养的研究人员。对于不熟悉此类 hPSC 培养的研究人员，建议参加 hPSC 培训课程，例如 Stem Cell Technologies 或辛辛那提儿童医院的多能干细胞设施 （PSCF） 提供的培训课程。起始 hPSC 的质量至关重要，会影响所有下游步骤。接下来的方案将从已经生长 4 天并准备分裂的 hPSC 开始。

研究方案

1. 人类肠道和结肠类器官的产生

1. 制备 ECM 涂层板
   1. 将 50 mL 冷 DMEM 培养基加入 50 mL 锥形管中。
   2. 从 -80 °C 冰箱中取出 4x hESC 合格的 ECM 等分试样（参见 材料表），并在冰上解冻。
      注：请参阅产品的分析证书，以确定制备 4x 储备液所需的 ESC 合格 ECM 的体积。
   3. 如果符合 hESC 要求的 ECM 未完全解冻，请从 50 mL 锥形管中取出 750 μL DMEM，并与 ECM 混合。
   4. 将符合 DMEM/hESC 要求的 ECM 混合物转移到含 DMEM 的 50 mL 锥形管中并充分混合。每孔添加 0.5 mL 到 4 x 24 孔细胞培养板中。
   5. 摇动板，将 ECM 均匀地分布在整个孔中，以确保覆盖整个表面。使用封口膜，密封 ECM 涂层板，并在室温下在生物安全柜中放置至少 1 小时。将 ECM 包被的板在 4 °C 下储存长达 2 周或直到需要为止。
2. hPSCs 单细胞铺板
   1. 将 ECM 涂层的 24 孔板放入生物安全柜中 30 分钟，使其达到室温。
   2. 将mTeSR1完全培养基、细胞分离溶液和高级DMEM置于37°C水浴中，让它们预热30分钟。
   3. 验证 hPSC 是否至少达到 85% 汇合且分化最小。如有必要，去除任何分化的细胞。
   4. 在 50 mL 锥形管中制备铺板培养基，如下所示：13 mL mTeSR1 和 13 μL 10 mM Y-27632 Rho 相关蛋白激酶 （ROCK） 抑制剂。
      注意：Y-27632 抑制失巢凋亡并增加单细胞的存活率。
   5. 要从 6 孔板中收集细胞，请从 3 至 4 个孔中吸出培养基，并用每孔 2 mL 高级 DMEM 洗涤一次。
   6. 吸出高级 DMEM，并将 1 mL 细胞解离溶液分配到每个孔中。将板在 5% CO₂、37 °C 培养箱中孵育 5-7 分钟。在显微镜下检查细胞是否处于悬浮状态。
   7. 通过使用 5 mL 移液器上下移液 4-5 次来解离任何剩余的细胞团块。
   8. 向每个孔中加入 2 mL 高级 DMEM，轻轻上下移液 4-5 次，然后转移到 15 mL 锥形管中。在室温下以 300 × g 离心细胞 3 分钟。
   9. 从试管中吸出培养基而不吸出细胞沉淀，并加入 6 mL 制备的 mTeSR1 加 ROCK 抑制剂培养基。通过上下吹打 3-4 次轻轻重悬细胞，然后将悬浮液转移到 50 mL 管内的其余 mTeSR1/ROCK 抑制剂培养基中。剧烈重悬 4-5 次，并使用血细胞计数器计数细胞。
   10. 在铺板细胞之前从 24 孔板中吸出 ECM。通过上下吹打 2-3 次再次重悬细胞，并在每个孔中分配 0.5 mL 细胞悬液。
       注意：最佳电镀密度需要由实验者确定。在这里，最佳细胞数量为每孔 80,000-200,000 个细胞。
   11. 顺时针轻轻摇动板 3 次，逆时针 3 次，前后 3 次，左右 3 次，以均匀分散细胞。
   12. 将板转移到 37 °C、5% CO₂ 培养箱中并孵育 24 小时。
       注：最初几个小时内不要干扰板，以确保细胞在孔内正确分散。
   13. 24 小时后（图 2A），吸出用过的培养基，每孔加入 0.5 mL 的 mTeSR1，在 37 °C、5% CO₂ 下再次孵育 24 小时（图 2B），然后进行下一步。
3. 确定性内胚层 （DE） 与 hPSC 的分化
   1. 在 15 mL 锥形管中，加入 13 mL 激活素第 1 天培养基（参见 材料表）、13 μL 100 μg/mL 激活素 A 和 1.95 μL 100 μg/mL BMP4。在 37 °C 水浴中加热培养基。
   2. 从 24 孔板中吸出 mTeSR1 培养基，每孔加入 0.5 mL Activin Day 1 培养基。将板置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中并孵育 24 小时。24 小时后检查细胞。
      注意：广泛的细胞死亡应该是明显的，如图 2C 所示。虽然单层看起来稀疏，但细胞集落会扩大。
   3. 通过在 15 mL 锥形管中将 12.5 μL 100 μg/mL 激活素 A 添加到 12.5 mL 激活素第 2 天培养基中来制备激活素第 2 天完全培养基。将试管置于 37 °C 水浴中。
   4. 从 CO₂ 培养箱中取出 24 孔分化板，并去除用过的培养基。每孔分配 0.5 mL 预热的 Activin Day 2 培养基，然后将板放回 CO₂ 培养箱中 24 小时。
      注：分配培养基时应小心。不要直接在孔的中心分配培养基，因为这会分离单层中的细胞。小心地沿孔侧面分配培养基。第二天，形成单层细胞，细胞死亡可以忽略不计。细胞现在应该达到 ~90% 至 95% 的汇合度（图 2D）。
   5. 通过在 15 mL 锥形管中将 12.5 μL 100 μg/mL 激活素 A 添加到 12.5 mL 激活素第 3 天培养基中来制备激活素第 3 天完全培养基。将试管置于 37 °C 水浴中。
   6. 去除用过的培养基，每孔分配 0.5 mL Activin Day 3 培养基。
      注意：分配培养基时应小心。不要直接在孔的中心分配培养基，因为这会分离单层中的细胞。小心地沿孔侧面分配培养基。第二天，单层应达到完全汇合，在此阶段几乎没有细胞死亡。如果在添加 Activin Day 3 培养基后 24 小时单层未汇合，请勿尝试生成中后肠球体。在继续生成中后肠球体之前，请参阅 图 2E 以了解 DE 单层的理想形态。
   7. 在优化 DE 分化时，对叉头盒 A2 蛋白 （FOXA2） 和性别决定区 Y （SRY）-盒转录因子 17 （SOX17） 的表达进行单层免疫荧光 （IF） 染色。
4. DE 分化为中后肠球体
   1. 在 50 mL 锥形管中，加入 25 mL 含 FGF4（无CHIR99021）的中后肠诱导培养基，并将其置于 37 °C 水浴中 30 分钟。
   2. 要制备完整的中后肠诱导培养基，请在培养基温热后加入 7.5 μL CHIR99021。
   3. 取出用过的培养基，每孔分配 0.5 mL 中后肠诱导培养基，并在 37 °C、5% CO₂ 下孵育 24 小时。
   4. 第二天单层内细胞浓缩后（图 3A），用新鲜的中后肠诱导培养基替换用过的培养基，并将板放回 37 °C、5% CO₂ 培养箱中 24 小时。
      注意：中后肠诱导 48 小时后，管状结构将很明显，如图 3B 所示。中后肠球体将在第 3 天开始从单层中出芽，如图 3C 所示。
   5. 为避免在更换培养基时丢弃漂浮的球体，请将旧培养基转移到 15 mL 试管中，并以 300 × g 离心 1 分钟。将球体重悬于 12.5 mL 新鲜的中后肠诱导培养基中，每孔加入 0.5 mL 到同一个 24 孔板中，并在 37 °C、5% CO₂ 下孵育 24 小时。
   6. 在后肠诱导的第 4 天（图 3D），通过将培养基收集到 15 mL 管中，然后以 300 × g 离心 1 分钟，从板孔中收获漂浮的球体。继续下一步，将中后肠球体嵌入 ECM 中。
5. ECM 中/后肠球体的电镀和图案化
   1. 包埋前在 4 °C 下解冻 ECM 基底膜基质过夜。
      注意：此 ECM 与经 hESC 认证的 ECM 不同。应将 ECM 置于冰上，并将适当体积的 ECM 分装到冰上预冷的 1.5 mL 微量离心管中。 表 1 包含有关 ECM 卷的信息。确保 ECM 的体积至少为微球将嵌入的液滴中的 75%。
   2. 在 37 °C 培养箱中加热 24 孔板。
   3. 使用 1000 μL 移液器从所有 24 孔中收集浮动球体，并将它们转移到 15 mL 锥形管中。在室温下以 300 × g 离心球体 1 分钟。吸出大部分培养基，但保留铺板所需的体积（表 1）。
   4. 通过切开 1000 μL 和 200 μL 移液器吸头的末端来制备它们。取出预热的 24 孔板。
   5. 混合浮动球体，将适当体积转移到置于冰上的 ECM 管中，然后通过移液重悬球体和 ECM 以充分混合。
   6. 用切割的 200 μL 移液器吸头取 65 μL 球状体和 ECM 混合物，并加载到 24 孔板中每个孔的中心。为确保形成良好的 ECM 液滴，请在分配混合物时轻轻缓慢地提起移液管。
      注意：每孔板 30-100 个球体。
   7. 轻轻地将板转移到 37 °C、5% CO₂ 培养箱中并孵育 5 分钟。
   8. 将板倒置并孵育 15-25 分钟，这将有助于 ECM 液滴保持圆顶状结构。
   9. 在孵育过程中，准备所需的培养基并加热。ECM 固化后，在每个孔中加入 0.5 mL 的 HIO 或 HCO 模式化培养基，并在 37 °C、5% CO₂ 下孵育。有关 ECM 中球体的图像，请参见 图 3E 。
   10. 将球体在图案培养基中培养 3 天。
   11. 3 天后，将 HIO 或 HCO 模式培养基更换为正常生长培养基，并在 37 °C、5% CO₂ 下孵育。
       注意：此时（第 10 天）的类器官是早期类器官。根据项目目标，一些早期类器官可用于早期模式分析，如第 2 节所述。
6. 人肠道和结肠类器官的生长和传代
   1. 第 10 天后，每 3 天更换一次生长培养基。
      注：根据铺板密度和类器官的生长，可能需要更频繁地更换培养基。应在培养基中的酚红（pH 指示剂）变为黄色之前更换培养基。
   2. 孵育类器官直至第 21 天（图 3F）。
      注意：BMP2 处理将导致从球体生长的类器官数量减少（比 HIO 少 ~3 倍）。因此，需要电镀更多的球体来生成 HCO。
7. 第 21 天类器官的分裂
   1. 检查类器官。
      注意：类器官需要在第 21 天分裂，因为由于类器官的生长和扩增，ECM 在第 21 天几乎降解。
   2. 切开 1000 μL 和 200 μL 移液器吸头的末端，准备它们。
   3. 在 37 °C 培养箱中加热 24 孔 Nunc 板。
   4. 将适当体积的 ECM 分装到预冷的 1.5 mL 试管中（表 1）。
   5. 用 1000 μL 移液器吸头轻轻刮擦带有类器官的 ECM 液滴，然后上下移液数次以打碎 ECM。
   6. 将混合物转移到 60 mm 培养皿中，并在显微镜下检查类器官。如有必要，使用无菌镊子将类器官彼此分离。确保分离不会损坏类器官的上皮。
   7. 将类器官转移到 15 mL 锥形管中，并以 300 × g 离心 30 秒。吸出上清液，在试管中留下 ~1 mL 培养基。
      注意：培养基的体积可以根据实验的目的进行更改。如果每个 ECM 液滴需要更多的类器官，则可以减少培养基体积。但是，如果需要较少的类器官，则可以增加培养基体积。
   8. 将类器官充分混合，将适当体积转移到置于冰上的 ECM 管中，然后通过移液重悬类器官和 ECM 以充分混合。
   9. 使用切割的 200 μL 移液器吸头，将 65 μL 球状体和 ECM 混合物添加到 24 孔板的每个孔的中心。
      注意：在移液过程中，首先吸收类器官，然后吸收 ECM 至关重要。因此，在分配混合物时，类器官位于 ECM 液滴的顶部。
   10. 将板放入 37 °C、5% CO₂ 培养箱中 5 分钟。
   11. 将板再倒置 15-25 分钟，以帮助 ECM 液滴保持圆顶状结构。
   12. 在每个孔中加入 0.5 mL 的 HIO/HCO 生长培养基，并在 37 °C、5% CO₂ 下孵育。
       注：图案化后，HIO 和 HCO 的生长培养基相同。
   13. 每 2-3 天更换一次培养基，直到第 35 天（图 3G）。

2. 通过逆转录定量聚合酶链反应 （RT-qPCR） 验证类器官的模式化

1. 在收集 RNA 之前，请按照制造商的说明准备 1x RNA 裂解缓冲液。
2. 丢弃用过的培养基，向 24 孔板的每个孔中加入 350 μL 裂解缓冲液。通过使用 1 mL 移液器上下移液来裂解类器官。为了更好地裂解，以最大速度短暂涡旋 5 秒。
3. 将所有样品保持在 -80 °C，直到准备好进行 RNA 提取。准备好后，从 -80 °C 冰箱中取出 RNA 样品，并在冰上解冻 10 分钟。在室温下剧烈涡旋试管 10-15 分钟，以确保样品完全裂解。
4. 将样品再次放在冰上，然后按照制造商的说明进行 RNA 提取。如果尚未准备好，请将 RNA 样品转移到 -80 °C 冰箱中进行下一步。
5. 使用标准方法进行 RNA 提取、DNAse 处理、cDNA 合成和 RT-qPCR。有关引物名称和序列的列表，请参阅 表 2 。

3. 通过免疫荧光验证类器官的模式

1. 类器官的收集和固定
   1. 从适当的孔中吸出 HIO 或 HCO 培养基，并向每个孔中加入 1 mL 冰冷的磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。使用切割的 200 μL 移液器吸头将类器官从 ECM 上解离。上下移液以将大块 ECM 与类器官分离。
   2. 将类器官转移到 15 mL 锥形管中，用冰冷的 PBS 填充管的其余部分，然后倒置管子轻轻混合。让类器官在重力作用下沉降并吸出 PBS。
      注：如果类器官未因重力而沉降，则以 300 × g 离心 1 分钟。
   3. 吸出 PBS 并加入 1 mL 冰冷的 ECM 降解溶液。将试管在冰上轻轻摇动，在冰上放置 10-15 分钟。
      注：将试管倾斜 45° 角，以使类器官和细胞回收溶液适当混合。10-15 分钟后，类器官应沉降到试管底部，表明 ECM 完全消化。
   4. 在试管中加入冷 PBS，最多 15 mL;将试管倒置数次，充分混匀。当类器官沉降到试管底部时，吸出 PBS 并加入 1 mL 预冷的 4% 多聚甲醛以固定类器官。将类器官与 4% 多聚甲醛在冰上孵育 1 小时。
   5. 用冰冷的PBS填充管的其余部分，并将其水平放置在4°C的摇摆平台上过夜。第二天，将多聚甲醛/PBS 丢弃在指定的废液容器中，并用 15 mL 冰冷的 PBS 洗涤一次，如步骤 3.1.2 所述。
   6. 吸出 PBS 并用 PBS 中的 30% 蔗糖填充试管。将管子水平放置在 4 °C 的摇床平台上过夜。
   7. 第二天，将类器官用 OCT 培养基包埋在 7 mm x 7 mm x 5 mm 的基础模型中，并使用干冰/乙醇浴进行快速冷冻。
   8. 用实验室湿巾擦干块，用纸巾包裹，并在 -80 °C 冰箱中放置过夜。第二天，使用低温恒温器将 5 μm 切片切到显微镜载玻片上。将载玻片储存在 -80 °C。
2. 类器官的免疫荧光染色
   1. 从 -80 °C 冰箱中处理载玻片，并使用标准方案进行 IF 染色。
   2. 将盖玻片套在载玻片上并在室温下干燥，避光至少 2 小时或过夜，然后再成像。
   3. 使用共聚焦显微镜的 25 倍物镜对载玻片进行成像。

结果

在中/后肠诱导阶段成功生成球体表明模式化成功。在浮动球体和单层上对 CDX2 进行 IF 染色，以确认图案化正确。尽管最终内胚层 （DE） 阶段的染色可以表明 DE 诱导的有效性，但如果没有有效的 DE 诱导，就不可能生成球状体。为了测试 DE 诱导的效率，对 FOXA2 和 SOX17 进行 IF 染色和/或 RT-qPCR。

在模式化阶段之后，HOX 因子的表达是模式化成功的最佳指...

讨论

hPSC 分化为 HIO 和 HCO 是一个复杂的过程，需要对每个步骤进行质量控制。在开始分化为 DE 之前，起始 hPSC 需要具有最小的分化。优化用于 DE 分化的 hPSC 的密度对于实验步骤的成功至关重要。为确保 DE 分化的质量，请对 FOXA2 和 SOX17 执行 IF 以确定 DE 分化的效率。DE 分化应导致超过 80% 的处理细胞对 FOXA2 和 SOX17 染色呈阳性。一旦确定了最佳密度，就可以将相同的密度用于?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Bovine serum albumin (BSA) solution	N/A	N/A	N/A
15 mL Corning tube	Falcon	21008-918	N/A
30% Sucrose	N/A	N/A	Made in PBS.
5% Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Lab	017-000-121	N/A
50 mL Corning tube	Falcon	21008-951	N/A
Accutase	Thermo Scientific	A1110501	Cell detachment solution; aliquot 5 mL of Accutase into 10 mL tubes totaling 20 tubes and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use.
Activin A	Cell guidance Systems	GFH6-100x10	Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Aliquot 38 µL of Activin A into prechilled microcentrifuge tubes and store at -80 °C (Tubes expire 12 months from date of receipt).
Activin Day 1 medium (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Use nonessential amino acids (NEAA, Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 1 medium: 500 mL of RPMI 1640 and 500 mL of NEAA. When preparing Activin Day 1 medium, add 13 mL of basic day 1 medium, 13 µl of Activin A (100 µg/mL), and 2 µl of BMP4 (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Activin Day 2 medium (RPMI 1640, 0.2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03T	Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 2 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL of NEAA, and 1 mL of 0.2% serum. When preparing Activin Day 2 medium, add 12.5 mL of basic day 2 medium and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Activin Day 3 medium (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03T	Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 3 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL NEAA, and 10 mL of 2% serum. When preparing Activin Day 3 medium, add 12.5 mL of basic day 3 and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Goat	Thermo Scientific	A11055	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit	Thermo Scientific	A21206	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 546 Donkey anti-Mouse	Thermo Scientific	A10036	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 647 Donkey anti-Mouse	Thermo Scientific	A31571	1:500 dilution (Secondary antibody)
Base mold	Fisher	22-363-552	N/A
Basic gut medium (advanced DMEM)	Gibco	12491015	When preparing Basic gut medium, add 500 mL of DMEM, 500 mL of N2 (Gibco 17-502-048), 500 mL of B27 (Gibco), 500 mL of L-Glutamine to get 2 mM L-Glutamine (Corning A2916801), 5 mL of 100 U/mL Penicillin-Streptomycin (Gibco 15-140-122), and 7.5 mL of  1 M HEPES to get 15 mM HEPES.  The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Biorad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Biorad	N/A	Other qRT-PCR systems can be used.
Cell Recovery Solution	Corning	354253	ECM-degrading solution
CHIR99021	Reprocell	4000410	Reconstitute by adding 2.15 mL of DMSO at 10 mM. Prepare 50 µL aliquots and store at -20 °C.  Store powder at 4 °C, protected from light.
CTRL HIO patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium and 100 ng/mL EGF.
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	1:100 dilution (Secondary antibody)
DE monolayer	N/A	N/A	Monolayer was generated in prior steps (Section 4.4).
Dispase	Gibco	17105041	Resuspend lyophilized powder in Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) to a 1 mg/mL final concentration. Filter the solution for sterilization by vacuuming using a Millipore filter sterilization tube. Make 10 mL aliquots (1 mg/mL) and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use.
EGF	Thermo Scientific	236-EG-01M	When preparing 100 ng/mL EGF reconstitute 500 µg/mL in sterile PBS. Next add 2 mL of sterile PBS to 1 mg EGF and make 500 µg/mL EGF solution. Aliquot 100 µL of EGF in 20 tubes.
Fisherbrand 6 cm Petri Dishes with Clear Lid	Fisher	FB0875713A	N/A
Fisherbrand Cell Lifter	Fisher	08-100-240	N/A
Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials with Closures Attached	Fisher	03-338B	N/A
Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipette	Fisher	13-678-2D0	N/A
Fluoromount G Slide Mounting Medium	VWR	100241-874	N/A
Gibco advanced DMEM	Gibco	12-491-023	N/A
Goat anti-E-Cadherin	R&D systems	AF648	1:400 dilution (Primary antibody)
Goat anti-SOX17	R&D systems	AF1924	1:500 dilution (Primary antibody)
HCOs patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL BMP2. When preparing BMP2, add 1 mL of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to BMP2 vials (100 µg). Aliquot 25 µL of BMP4 solution in 4 tubes.  The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	N/A
Human Pluripotent Stem Cells (hPSC)	Pluripotent Stem Cell Facility	N/A	Cells seeded in a Matrigel coated 24-well plate (Thermo Scientific 73520-906).
Ice-cold 4% Paraformaldehyde solution (PFA)	N/A	N/A	N/A
Ice-cold Phosphate Buffered Saline (PBS)	N/A	N/A	The pH must be 7.4.
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	101098-065	N/A
Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)	Pluripotent Stem Cell Facility (Cincinnati Children's Hospital Medical Center)	N/A	Other hESC or iPSC lines can be used, but the protocol needs to be optimized for each cell line.
Leica microtome	N/A	N/A	N/A
LSM 880			confocal microscope
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	N/A
Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	Prepare 4 x Matrigel aliquots which corresponds to volumes sufficient to make enough diluted Matrigel for 4 x 6-well dishes.
Mid-hindgut induction medium (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Nonessential amino acids (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 µM CHIR99021 and 500 ng/mL FGF4. The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Mid-hindgut spheroids	N/A	N/A	N/A
MilliporeSigma Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	MilliporeSigma	SCGP00525	N/A
Mouse anti-CDX2	BioGenex	MU392-UC	1:300 dilution (Primary antibody)
Mouse anti-FOXA2	Abnova/Novus	H00003170-M01	1:500 dilution
mTeSR1 complete growth medium	Stem Cell technologies	85870	Add 100-mL of mTeSR supplement (85870) into one 400-mL mTeSR medium (85870) and aliquot into 50-mL tubes while avoiding contamination. Store at 4°C until use.
Murray's Clear solution (Also known as BABB)	Murray's	N/A	1:2 benzyl benzoate and benzyl alcohol.
NOG HIO patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL NOGGIN (Dispense 25 µg of NOGGIN in 250 µl sterile PBS with 0.1% BSA).
NucleoSpin RNA	Takara	740955.25	Other RNA isolation kits may be used.
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells (Nunc)	Thermo Scientific	73521-004	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells coated with Matrigel	Thermo Scientific	73521-004	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells (Nunc)	Thermo Scientific	73520-906	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells coated with  Matrigel.	Thermo Scientific	73520-906	N/A
Outgrowth medium for HIOs, CTRL HIOs, and HCOs	N/A	N/A	Basic gut medium and 100 ng/mL EGF (Final concentration)
Phosphate Buffer Saline, 0.5% Triton X (PBS-T)	N/A	N/A	N/A
Primers	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT)	N/A	The primers are listed in Table 2 on the protocol.
Rabbit anti-CDX2	Cell Marque	EPR22764Y	1:100 dilution (Primary antibody)
Rabbit anti-SATB2	Cell Marque	EP281	1:100 dilution (Primary antibody)
Recombinant Human BMP-4 Protein	R&D systems	314-BP-010	Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile 4 mM HCl containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Add 4.17 mL HCl solution to 45.83 mL molecular water totaling to 50 mL of 1 M HCl. Then add 200 µL of 1 M HCl to 49.8 mL of molecular grade water totaling to 50 mL of 4 mM HCl. Next add 0.05 g BSA to 50 mL of 4 mM HCl and filter to make sterile. Aliquot sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to 33 microcentrifuge tube totaling and store at -20 °C. Add 100 µl of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to the BMP4 vials (10 µg) to make BMP4 solution at 100 µg/mL.
Recombinant Human FGF-4 Protein	R&D systems	235-F4-01M	Reconstitute at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin. Add 0.05 g of BSA in 50 mL of PBS to make 0.1% BSA. Filter 0.22 µM BSA to sterilize the BSA. Aliquot 10 mL of 0.1% BSA in 5 tubes. Add 1 mg FGF-4 in 10 mL of sterile 0.1% BSA. Aliquot 250 µL into prechilled 40 microcentrifuge tubes and store at -80 °C.
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris	1254	The final concentration is 10 mM (10 mmol/L). Resuspend in DMSO at 10 mM and filter sterilize. Add 3 mL of sterile PBS to each vial. Aliqout 100 µL of ROCK inhibitor in 30 tubes and store at -20 °C.
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Thermo Scientific	11-754-250	N/A
SuperFrost Plus microscope slides
Tissue Tek O.C.T Compound	VWR	25608-930	N/A