JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.
Method Article
여기에서는 인간 만능 줄기 세포 유래 소장 및 결장 오가노이드를 생성, 유지 및 특성화하는 자세한 방법에 대해 설명합니다. 이러한 방법은 재현성을 개선하고, 확장성을 확장하며, 오가노이드의 도금 및 패시징에 필요한 작업 시간을 단축하도록 설계되었습니다.
장 부위 사양은 발달 중인 위장관(GI)의 지정된 영역에 고유한 형태와 기능이 부여되는 과정을 설명합니다. 장의 부위 사양화는 뼈 형태 유전 단백질(BMP) 경로를 포함한 여러 발달 경로에 의해 주도됩니다. 정상적인 지역 규격에 기반하여 인간 배아 줄기 세포(hES)와 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 포함하는 인간 만능 줄기 세포(hPSC)에서 인간 결장 오가노이드(HCO)를 생성하는 방법을 개발했습니다. BMP 신호전달의 3일 유도는 중간/뒷장 배양을 인간 결장에 존재하는 모든 주요 상피 세포 유형과 공동 발달 중간엽 세포를 포함하는 특수 AT가 풍부한 염기서열 결합 단백질 2(SATB2) 발현 HCO로 충분히 패턴화합니다. 이 중요한 패터닝 기간 동안 BMP의 누락(또는 BMP 억제제 NOGGIN의 추가)은 인간 장 오가노이드(HIO)의 형성을 초래했습니다. HIO와 HCO는 형태학적으로나 분자학적으로 각각 인간이 발달하는 소장과 결장과 유사합니다. 인간의 장 발달을 연구하기 위한 HIO 및 HCO의 유용성에도 불구하고 HIO 및 HCO의 생성은 도전적입니다. 이 백서에서는 HIO 및 HCO를 생성, 유지 관리 및 특성화하는 방법을 제시합니다. 또한 프로토콜의 중요한 단계 및 문제 해결 권장 사항이 제공됩니다.
인간 대장 발달을 연구하는 것은 인간 태아 조직의 사용에 대한 제한으로 인해 어렵습니다. 동물 모델은 매우 중요하며 역사적으로 장 발달을 연구하기 위해 생쥐의 유전적 접근에 사용되었습니다. 그러나 마우스와 인간의 장 발달 간의 차이로 인해 모델 시스템으로서의 마우스의 적용 가능성은 제한적입니다. 예를 들어, 생쥐의 소장과 결장에서 소낭선 형성은 출생 후에 일어나지만, 인간은 완전히 형성된 소낭선1을 가지고 태어난다. 또한, 인간의 소장과 결장에는 소장에서 모틸린(MLN)을 발현하는 장내분비세포(MLN)를 포함하여 마우스에서 발견되지 않는 세포 유형이 포함되어 있습니다 2 및 결장에서 뮤신 5B(MUC5B)를 발현하는 배상세포 3,4. 이러한 이유로 결장 발달의 초기 단계를 정의하는 동적 분자 이벤트를 정확하게 모델링하는 세포 배양 시스템을 갖추는 것이 중요합니다. 따라서 hPSC가 결장 특성을 가진 세포를 생성하도록 지시하는 것은 인간 결장 발달 연구를 위한 강력한 모델을 제공합니다.
프로토콜은 hPSC로부터 장 유사 오가노이드6 및 결장 유사 오가노이드7의재현 가능5, 동기식 및 효율적인 형성을 촉진하기 위해 개발되었습니다. 이러한 프로토콜은 태아의 장과 결장의 발달을 모방하는 단계적 분화 절차를 사용합니다(그림 1). 첫째, 인간 만능 줄기세포에서 결절(Nodal) 모방물질인 Activin A를 처리하여 최종 내배엽을 생성합니다. 최종 내배엽을 높은 수준의 WNT 및 섬유아세포 성장 인자(FGF)에 노출시키면 CDX2+ 중장/후견인 스페로이드에 형태 형성이 유도됩니다. 그런 다음 중장/뒷장 스페로이드는 세포외 기질(ECM)에 삽입되고 BMP 신호의 일시적인 조작을 통해 HIO 또는 HCO로 패터닝됩니다. NOGGIN을 사용하여 BMP 신호 전달을 억제하거나 성장 배지를 단독으로 추가하면 인간 근위 소장과 유사한 HIO가 형성됩니다.
BMP2를 사용하여 BMP 신호를 활성화함으로써 중장/후장 스페로이드는 상피와 중간엽7에서 패터닝을 유지하는 HCO로 패터닝됩니다. HCO는 결장이 풍부한 MUC5B 발현 배상세포를 함유하고 있으며 결장 특이적 인슐린 유사 5(INSL5) 발현 장내분비세포를 생성할 수 있습니다. HCO에서 분리된 간엽은 호메오박스 A13(HOXA13) 및 HOXD13을 발현하며, 이는 인간 1차 결장 간엽8에서도 발현됩니다. 패터닝 단계는 차별화 프로토콜의 7-10일 동안 발생한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 3일의 기간은 확장된 체외 배양 후에도 유지되는 결장 패턴화를 유도하기에 충분합니다.
아래에 설명된 프로토콜은 피더가 없는 hPSC 배양에 익숙한 연구자를 위한 것입니다. 이러한 유형의 hPSC 배양에 익숙하지 않은 연구자의 경우, Stem Cell Technologies 또는 Cincinnati Children's Hospital의 Prupotent Stem Cell Facility(PSCF)에서 제공하는 것과 같은 hPSC에 대한 교육 과정을 수강하는 것이 좋습니다. 시작 hPSC의 품질은 매우 중요하며 모든 다운스트림 단계에 영향을 미칠 수 있습니다. 다음 프로토콜은 4일 동안 배양되어 분리할 준비가 된 hPSC로 시작합니다.
1. 인간 장 및 결장 오가노이드의 생성
2. 역전사 정량 중합효소연쇄반응(RT-qPCR)에 의한 오가노이드의 패터닝 검증
3. 면역형광에 의한 오가노이드의 패터닝 검증
중기/후장 유도 단계에서 스페로이드의 성공적인 생성은 성공적인 패터닝을 나타냅니다. 부유 스페로이드 및 단층에서 CDX2에 대한 IF 염색을 수행하여 패터닝이 올바른지 확인합니다. 최종 내배엽(DE) 단계에서의 염색은 DE 유도의 효과를 나타낼 수 있지만, 효율적인 DE 유도 없이는 스페로이드 생성이 불가능합니다. DE 유도의 효율성을 테스트하려면 FOXA2 및 SOX17에 대해 IF ?...
hPSC를 HIO와 HCO로 구별하는 것은 각 단계에서 품질 관리가 필요한 복잡한 프로세스입니다. 시작 hPSC는 DE로 분화를 시작하기 전에 최소한의 분화가 있어야 합니다. DE 분화를 위해 도금된 hPSC의 밀도를 최적화하는 것은 프로토콜의 성공에 매우 중요합니다. DE 차별화의 품질을 보장하려면 FOXA2 및 SOX17에 대해 IF를 수행하여 DE 차별화의 효율성을 결정합니다. DE 분화로 인해 처?...
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Múnera 실험실은 NIH/NCI 5U54CA210962-02 South Carolina Cancer Disparities Research Center (SC CADRE), NIH/NIGMS P20 GM130457-01A1 COBRE in Digestive and Liver Disease, NIH/NIDDK 1P30 DK123704-01 MUSC Digestive Disease Research Core Center의 지원을 받습니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1% Bovine serum albumin (BSA) solution | N/A | N/A | N/A |
15 mL Corning tube | Falcon | 21008-918 | N/A |
30% Sucrose | N/A | N/A | Made in PBS. |
5% Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 017-000-121 | N/A |
50 mL Corning tube | Falcon | 21008-951 | N/A |
Accutase | Thermo Scientific | A1110501 | Cell detachment solution; aliquot 5 mL of Accutase into 10 mL tubes totaling 20 tubes and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use. |
Activin A | Cell guidance Systems | GFH6-100x10 | Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Aliquot 38 µL of Activin A into prechilled microcentrifuge tubes and store at -80 °C (Tubes expire 12 months from date of receipt). |
Activin Day 1 medium (RPMI 1640) | Corning | MT10041CV | Use nonessential amino acids (NEAA, Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 1 medium: 500 mL of RPMI 1640 and 500 mL of NEAA. When preparing Activin Day 1 medium, add 13 mL of basic day 1 medium, 13 µl of Activin A (100 µg/mL), and 2 µl of BMP4 (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors. |
Activin Day 2 medium (RPMI 1640, 0.2% FBS vol/vol) | Hyclone | SH30070.03T | Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 2 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL of NEAA, and 1 mL of 0.2% serum. When preparing Activin Day 2 medium, add 12.5 mL of basic day 2 medium and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors. |
Activin Day 3 medium (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol) | Hyclone | SH30070.03T | Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 3 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL NEAA, and 10 mL of 2% serum. When preparing Activin Day 3 medium, add 12.5 mL of basic day 3 and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors. |
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Goat | Thermo Scientific | A11055 | 1:500 dilution (Secondary antibody) |
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit | Thermo Scientific | A21206 | 1:500 dilution (Secondary antibody) |
Alexa Fluor 546 Donkey anti-Mouse | Thermo Scientific | A10036 | 1:500 dilution (Secondary antibody) |
Alexa Fluor 647 Donkey anti-Mouse | Thermo Scientific | A31571 | 1:500 dilution (Secondary antibody) |
Base mold | Fisher | 22-363-552 | N/A |
Basic gut medium (advanced DMEM) | Gibco | 12491015 | When preparing Basic gut medium, add 500 mL of DMEM, 500 mL of N2 (Gibco 17-502-048), 500 mL of B27 (Gibco), 500 mL of L-Glutamine to get 2 mM L-Glutamine (Corning A2916801), 5 mL of 100 U/mL Penicillin-Streptomycin (Gibco 15-140-122), and 7.5 mL of 1 M HEPES to get 15 mM HEPES. The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors. |
Biorad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | N/A | Other qRT-PCR systems can be used. |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | ECM-degrading solution |
CHIR99021 | Reprocell | 4000410 | Reconstitute by adding 2.15 mL of DMSO at 10 mM. Prepare 50 µL aliquots and store at -20 °C. Store powder at 4 °C, protected from light. |
CTRL HIO patterning medium | N/A | N/A | Basic gut medium and 100 ng/mL EGF. |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:100 dilution (Secondary antibody) |
DE monolayer | N/A | N/A | Monolayer was generated in prior steps (Section 4.4). |
Dispase | Gibco | 17105041 | Resuspend lyophilized powder in Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) to a 1 mg/mL final concentration. Filter the solution for sterilization by vacuuming using a Millipore filter sterilization tube. Make 10 mL aliquots (1 mg/mL) and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use. |
EGF | Thermo Scientific | 236-EG-01M | When preparing 100 ng/mL EGF reconstitute 500 µg/mL in sterile PBS. Next add 2 mL of sterile PBS to 1 mg EGF and make 500 µg/mL EGF solution. Aliquot 100 µL of EGF in 20 tubes. |
Fisherbrand 6 cm Petri Dishes with Clear Lid | Fisher | FB0875713A | N/A |
Fisherbrand Cell Lifter | Fisher | 08-100-240 | N/A |
Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials with Closures Attached | Fisher | 03-338B | N/A |
Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipette | Fisher | 13-678-2D0 | N/A |
Fluoromount G Slide Mounting Medium | VWR | 100241-874 | N/A |
Gibco advanced DMEM | Gibco | 12-491-023 | N/A |
Goat anti-E-Cadherin | R&D systems | AF648 | 1:400 dilution (Primary antibody) |
Goat anti-SOX17 | R&D systems | AF1924 | 1:500 dilution (Primary antibody) |
HCOs patterning medium | N/A | N/A | Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL BMP2. When preparing BMP2, add 1 mL of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to BMP2 vials (100 µg). Aliquot 25 µL of BMP4 solution in 4 tubes. The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors. |
Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | N/A |
Human Pluripotent Stem Cells (hPSC) | Pluripotent Stem Cell Facility | N/A | Cells seeded in a Matrigel coated 24-well plate (Thermo Scientific 73520-906). |
Ice-cold 4% Paraformaldehyde solution (PFA) | N/A | N/A | N/A |
Ice-cold Phosphate Buffered Saline (PBS) | N/A | N/A | The pH must be 7.4. |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | 101098-065 | N/A |
Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) | Pluripotent Stem Cell Facility (Cincinnati Children's Hospital Medical Center) | N/A | Other hESC or iPSC lines can be used, but the protocol needs to be optimized for each cell line. |
Leica microtome | N/A | N/A | N/A |
LSM 880 | confocal microscope | ||
Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | N/A |
Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | Prepare 4 x Matrigel aliquots which corresponds to volumes sufficient to make enough diluted Matrigel for 4 x 6-well dishes. |
Mid-hindgut induction medium (RPMI 1640) | Corning | MT10041CV | Nonessential amino acids (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 µM CHIR99021 and 500 ng/mL FGF4. The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors. |
Mid-hindgut spheroids | N/A | N/A | N/A |
MilliporeSigma Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | MilliporeSigma | SCGP00525 | N/A |
Mouse anti-CDX2 | BioGenex | MU392-UC | 1:300 dilution (Primary antibody) |
Mouse anti-FOXA2 | Abnova/Novus | H00003170-M01 | 1:500 dilution |
mTeSR1 complete growth medium | Stem Cell technologies | 85870 | Add 100-mL of mTeSR supplement (85870) into one 400-mL mTeSR medium (85870) and aliquot into 50-mL tubes while avoiding contamination. Store at 4°C until use. |
Murray's Clear solution (Also known as BABB) | Murray's | N/A | 1:2 benzyl benzoate and benzyl alcohol. |
NOG HIO patterning medium | N/A | N/A | Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL NOGGIN (Dispense 25 µg of NOGGIN in 250 µl sterile PBS with 0.1% BSA). |
NucleoSpin RNA | Takara | 740955.25 | Other RNA isolation kits may be used. |
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells (Nunc) | Thermo Scientific | 73521-004 | N/A |
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells coated with Matrigel | Thermo Scientific | 73521-004 | N/A |
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells (Nunc) | Thermo Scientific | 73520-906 | N/A |
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells coated with Matrigel. | Thermo Scientific | 73520-906 | N/A |
Outgrowth medium for HIOs, CTRL HIOs, and HCOs | N/A | N/A | Basic gut medium and 100 ng/mL EGF (Final concentration) |
Phosphate Buffer Saline, 0.5% Triton X (PBS-T) | N/A | N/A | N/A |
Primers | Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT) | N/A | The primers are listed in Table 2 on the protocol. |
Rabbit anti-CDX2 | Cell Marque | EPR22764Y | 1:100 dilution (Primary antibody) |
Rabbit anti-SATB2 | Cell Marque | EP281 | 1:100 dilution (Primary antibody) |
Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D systems | 314-BP-010 | Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile 4 mM HCl containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Add 4.17 mL HCl solution to 45.83 mL molecular water totaling to 50 mL of 1 M HCl. Then add 200 µL of 1 M HCl to 49.8 mL of molecular grade water totaling to 50 mL of 4 mM HCl. Next add 0.05 g BSA to 50 mL of 4 mM HCl and filter to make sterile. Aliquot sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to 33 microcentrifuge tube totaling and store at -20 °C. Add 100 µl of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to the BMP4 vials (10 µg) to make BMP4 solution at 100 µg/mL. |
Recombinant Human FGF-4 Protein | R&D systems | 235-F4-01M | Reconstitute at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin. Add 0.05 g of BSA in 50 mL of PBS to make 0.1% BSA. Filter 0.22 µM BSA to sterilize the BSA. Aliquot 10 mL of 0.1% BSA in 5 tubes. Add 1 mg FGF-4 in 10 mL of sterile 0.1% BSA. Aliquot 250 µL into prechilled 40 microcentrifuge tubes and store at -80 °C. |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | The final concentration is 10 mM (10 mmol/L). Resuspend in DMSO at 10 mM and filter sterilize. Add 3 mL of sterile PBS to each vial. Aliqout 100 µL of ROCK inhibitor in 30 tubes and store at -20 °C. |
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | 11-754-250 | N/A |
SuperFrost Plus microscope slides | |||
Tissue Tek O.C.T Compound | VWR | 25608-930 | N/A |
JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기
허가 살펴보기This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유