Geração, manutenção e caracterização de organoides intestinais e colônicos derivados de células-tronco pluripotentes humanas

Resumo

Aqui, são descritos métodos detalhados para gerar, manter e caracterizar organoides do intestino delgado e do cólon derivados de células-tronco pluripotentes humanas. Esses métodos são projetados para melhorar a reprodutibilidade, expandir a escalabilidade e diminuir o tempo de trabalho necessário para o revestimento e passagem de organoides.

Resumo

A especificação regional intestinal descreve um processo pelo qual morfologia e função únicas são transmitidas a áreas definidas do trato gastrointestinal (GI) em desenvolvimento. A especificação regional no intestino é impulsionada por várias vias de desenvolvimento, incluindo a via da proteína morfogenética óssea (BMP). Com base na especificação regional normal, foi desenvolvido um método para gerar organoides colônicos humanos (HCOs) a partir de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs), que incluem células-tronco embrionárias humanas (hES) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Uma indução de três dias de sinalização de BMP padroniza suficientemente as culturas de tubos do intestino médio / posterior em HCOs especiais que expressam a proteína de ligação à sequência rica em AT 2 (SATB2) contendo todos os principais tipos de células epiteliais presentes no cólon humano, bem como células mesenquimais em co-desenvolvimento. A omissão de BMP (ou adição do inibidor de BMP NOGGIN) durante este período crítico de padronização resultou na formação de organoides intestinais humanos (HIOs). HIOs e HCOs se assemelham morfologicamente e molecularmente ao intestino delgado e cólon em desenvolvimento humano, respectivamente. Apesar da utilidade de HIOs e HCOs para estudar o desenvolvimento intestinal humano, a geração de HIOs e HCOs é desafiadora. Este artigo apresenta métodos para gerar, manter e caracterizar HIOs e HCOs. Além disso, as etapas críticas no protocolo e as recomendações de solução de problemas são fornecidas.

Introdução

Estudar o desenvolvimento do cólon humano é difícil devido às restrições ao uso de tecido fetal humano. Os modelos animais têm sido inestimáveis e historicamente usados para abordagens genéticas em camundongos para estudar o desenvolvimento intestinal. No entanto, as diferenças entre o desenvolvimento intestinal de camundongos e humanos limitam a aplicabilidade de camundongos como sistema modelo. Por exemplo, embora a formação de criptas no intestino delgado e no cólon de camundongos ocorra no pós-natal^{, os humanos} nascem com criptas totalmente formadas. Além disso, o intestino delgado e o cólon humanos contêm tipos de células que não são encontrados em camundongos, incluindo células enteroendócrinas que expressam motilina (MLN) no intestino delgado² e células caliciformes que expressam mucina 5B (MUC5B) no cólon ^3,4. Por esse motivo, é importante ter um sistema de cultura de células que modele com precisão os eventos moleculares dinâmicos que definem os estágios iniciais do desenvolvimento do cólon. Portanto, direcionar as hPSCs para gerar células com características do cólon fornece um modelo poderoso para o estudo do desenvolvimento do cólon humano.

Protocolos foram desenvolvidos para facilitar a formação reprodutível⁵, síncrona e eficiente de organoides semelhantes ao intestino⁶ e semelhantes ao cólon⁷ a partir de hPSCs. Esses protocolos usam um procedimento de diferenciação gradual que imita o desenvolvimento do intestino e cólon fetal (Figura 1). Primeiro, o endoderma definitivo é gerado a partir de células-tronco pluripotentes humanas por tratamento com Activin A, um mimético nodal. A exposição do endoderma definitivo a altos níveis de WNT e fator de crescimento de fibroblastos (FGF) induz morfogênese em esferoides do ^{tubo médio/} posterior CDX2+. Os esferoides do intestino médio / posterior são então incorporados na matriz extracelular (ECM) e padronizados em HIOs ou HCOs por meio de uma manipulação transitória da sinalização BMP. Inibir a sinalização de BMP usando NOGGIN ou adicionando apenas meio de crescimento resulta na formação de HIOs, que se assemelham ao intestino delgado proximal humano.

Ao ativar a sinalização BMP usando BMP2, os esferóides do intestino médio / posterior são padronizados em HCOs, que retêm padrões no epitélio e no mesênquima⁷. Os HCOs contêm células caliciformes enriquecidas com MUC5B e são competentes para gerar células enteroendócrinas que expressam insulina 5 (INSL5) específicas do cólon. O mesênquima isolado de HCOs expressa homeobox A13 (HOXA13) e HOXD13, que também são expressos no mesênquima primário do cólon humano⁸. É importante lembrar que a etapa de padronização ocorre durante os dias 7 a 10 do protocolo de diferenciação. Este período de três dias é suficiente para induzir o padrão colônico que é mantido após a cultura in vitro estendida.

Os protocolos descritos abaixo são para pesquisadores familiarizados com a cultura de hPSC livre de alimentadores. Para pesquisadores que não estão familiarizados com esse tipo de cultura de hPSC, recomenda-se um curso de treinamento em hPSCs, como os oferecidos pela Stem Cell Technologies ou pela Pluripotent Stem Cell Facility (PSCF) do Cincinnati Children's Hospital. A qualidade dos hPSCs iniciais é crítica e pode afetar todas as etapas a jusante. O protocolo a seguir começaria com hPSCs que foram cultivados por 4 dias e estão prontos para se dividir.

Protocolo

1. Geração de organoides intestinais e colônicos humanos

1. Preparação de placas revestidas com ECM
   1. Adicione 50 mL de meio DMEM frio em um tubo cônico de 50 mL.
   2. Remova uma alíquota de 4x ECM qualificado para hESC (consulte a Tabela de Materiais) do freezer a -80 ° C e descongele no gelo.
      NOTA: Consulte o certificado de análise do produto para determinar o volume de ECM qualificado pela ESC necessário para preparar um estoque 4x.
   3. Se o ECM qualificado para hESC não estiver totalmente descongelado, pegue 750 μL de DMEM do tubo cônico de 50 mL e misture-o com o ECM.
   4. Transfira a mistura ECM qualificada para DMEM/hESC para o tubo cônico de 50 mL com DMEM e misture bem. Adicione 0,5 mL por poço em cada uma das placas de cultura de células de 4 x 24 poços.
   5. Agite as placas para espalhar o ECM uniformemente por todo o poço para garantir que toda a superfície seja coberta. Usando parafilme, sele as placas revestidas com ECM e deixe-as em temperatura ambiente em um gabinete de biossegurança por pelo menos 1 h. Armazene as placas revestidas com ECM a 4 °C por até 2 semanas ou até que seja necessário.
2. hPSCs de revestimento de célula única
   1. Coloque uma placa de 24 poços revestida com ECM dentro de um gabinete de biossegurança por 30 minutos para permitir que ela atinja a temperatura ambiente.
   2. Coloque o meio completo mTeSR1, a solução de descolamento celular e o DMEM avançado dentro de um banho-maria a 37 °C e deixe-os aquecer por 30 min.
   3. Verifique se as hPSCs são pelo menos 85% confluentes com diferenciação mínima. Remova todas as células diferenciadas, se necessário.
   4. Prepare o meio de plaqueamento em um tubo cônico de 50 mL da seguinte forma: 13 mL de mTeSR1 e 13 μL de inibidor da proteína quinase associada a Rho (ROCK) 10 mM.
      NOTA: Y-27632 inibe o anoikis e aumenta a sobrevivência de células individuais.
   5. Para coletar células de uma placa de 6 poços, aspire o meio de 3 a 4 poços e lave uma vez com 2 mL de DMEM avançado por poço.
   6. Aspire o DMEM avançado e dispense 1 mL da solução de dissociação celular em cada poço. Incubar a placa durante 5-7 min dentro de uma incubadora a 5% de CO₂, 37 °C. Verifique ao microscópio se as células estão em suspensão.
   7. Dissocie quaisquer aglomerados de células restantes pipetando para cima e para baixo 4-5 vezes usando uma pipeta de 5 mL.
   8. Adicione 2 mL de DMEM avançado em cada poço, pipete suavemente para cima e para baixo 4-5 vezes e transfira para um tubo cônico de 15 mL. Gire as células a 300 × g por 3 min em temperatura ambiente.
   9. Aspirar o meio do tubo sem aspirar o sedimento celular e adicionar 6 ml do meio preparado de mTeSR1 mais inibidor de ROCK. Ressuspenda suavemente as células pipetando para cima e para baixo 3-4 vezes e, em seguida, transfira a suspensão para o resto do meio inibidor de mTeSR1 / ROCK dentro do tubo de 50 mL. Ressuspenda vigorosamente 4-5 vezes e conte as células usando um hemacitómetro.
   10. Aspire o ECM da placa de 24 poços antes de plaquear as células. Ressuspenda as células novamente pipetando para cima e para baixo 2-3 vezes e dispense 0,5 mL da suspensão celular em cada poço.
       NOTA: A densidade ideal de revestimento precisa ser determinada pelo experimentador. Aqui, o número ideal de células é de 80.000 a 200.000 células por poço.
   11. Balance suavemente a placa 3 vezes no sentido horário, 3 vezes no sentido anti-horário, 3 vezes para frente e para trás e 3 vezes de um lado para o outro para dispersar uniformemente as células.
   12. Transferir a placa para uma incubadora a 37 °C e CO₂ a 5% e incubar durante 24 h.
       NOTA: Não perturbe a placa nas primeiras horas para garantir a dispersão adequada das células dentro dos poços.
   13. Após 24 h ( Figura 2A ), aspire o meio gasto, adicione 0,5 mL por poço de mTeSR1, incube novamente a 37 ° C, 5% de CO₂ por 24 h ( Figura 2B ) e, em seguida, prossiga para a próxima etapa.
3. Diferenciação do endoderma definitivo (DE) das hPSCs
   1. Em um tubo cônico de 15 mL, adicione 13 mL de meio Activin Day 1 (consulte a Tabela de Materiais), 13 μL de 100 μg / mL de Activin A e 1,95 μL de 100 μg / mL BMP4. Aquecer o meio num banho-maria a 37 °C.
   2. Aspire o meio mTeSR1 da placa de 24 poços e adicione 0,5 mL de meio Activin Day 1 por poço. Colocar a placa numa incubadora a 37 °C, CO_{5% 2} e incubar durante 24 h. Verifique as células após 24 h.
      NOTA: A morte celular extensa deve ser aparente, conforme ilustrado na Figura 2C. Embora a monocamada pareça esparsa, as colônias de células terão se expandido.
   3. Prepare o meio completo de Activin Day 2 adicionando 12,5 μL de 100 μg / mL de Activin A em 12,5 mL de meio Activin Day 2 em um tubo cônico de 15 mL. Coloque o tubo em banho-maria a 37 °C.
   4. Retire a placa de diferenciação de 24 poços da incubadora de CO₂ e remova o meio gasto. Dispense 0,5 mL de meio Activin Day 2 pré-aquecido por poço e coloque a placa de volta dentro da incubadora de CO₂ por 24 h.
      NOTA: Deve-se ter cuidado ao dispensar o meio. Não dispense o meio diretamente no centro do poço, pois isso desprenderá as células da monocamada. Dispense cuidadosamente o meio na lateral do poço. No dia seguinte, uma monocamada de células é formada com morte celular insignificante. As células agora devem ser ~ 90 a 95% confluentes (Figura 2D).
   5. Prepare o meio completo Activin Day 3 adicionando 12,5 μL de 100 μg / mL de Activin A em 12,5 mL de meio Activin Day 3 em um tubo cônico de 15 mL. Coloque o tubo em banho-maria a 37 °C.
   6. Remova o meio gasto e dispense 0,5 mL de meio Activin Day 3 por poço.
      NOTA: Deve-se ter cuidado ao dispensar o meio. Não dispense o meio diretamente no centro do poço, pois isso desprenderá as células da monocamada. Dispense cuidadosamente o meio na lateral do poço. No dia seguinte, a monocamada deve atingir a confluência total com pouca ou nenhuma morte celular neste estágio. Não tente gerar esferóides do intestino médio se a monocamada não for confluente 24 h após a adição do meio Activin Day 3. Consulte a Figura 2E para obter a morfologia ideal da monocamada DE antes de prosseguir para a geração de esferóides do intestino médio.
   7. Realize a coloração por imunofluorescência (IF) da monocamada para a expressão da proteína A2 da caixa de garfo (FOXA2) e do fator de transcrição 17 da caixa da região determinante do sexo (SRY) (SOX17) ao otimizar a diferenciação DE.
4. Diferenciação de DE em esferoides do intestino grosso
   1. Em um tubo cônico de 50 mL, adicione 25 mL de meio de indução do intestino médio com FGF4 (sem CHIR99021) e coloque-o em banho-maria a 37 ° C por 30 min.
   2. Para preparar o meio de indução completo do intestino médio, adicione 7,5 μL de CHIR99021 depois que o meio estiver quente.
   3. Remova o meio gasto, dispense 0,5 mL de meio de indução do intestino médio por poço e incube a 37 ° C, 5% de CO₂ por 24 h.
   4. Após a condensação das células dentro da monocamada ter ocorrido no dia seguinte (Figura 3A), substitua o meio gasto por meio de indução fresco do intestino médio e coloque a placa de volta em uma incubadora de CO₂ a 37 ° C e 5% por 24 h.
      NOTA: As estruturas tubulares serão perceptíveis após 48 h de indução do intestino médio, conforme mostrado na Figura 3B. Os esferoides do intestino grosso começarão a brotar da monocamada no dia 3, conforme ilustrado na Figura 3C.
   5. Para evitar descartar os esferóides flutuantes durante a troca do meio, transfira o meio antigo para um tubo de 15 mL e centrifugue a 300 × g por 1 min. Ressuspenda os esferóides em 12,5 mL de meio de indução do intestino médio fresco, adicione 0,5 mL por alvéolo na mesma placa de 24 poços e incube a 37 ° C, 5% de CO₂ por 24 h.
   6. No dia 4 da indução do intestino grosso (Figura 3D), colha esferóides flutuantes dos poços da placa coletando o meio em um tubo de 15 mL seguido de centrifugação a 300 × g por 1 min. Prossiga para a próxima etapa para incorporar esferoides do intestino médio na ECM.
5. Plaqueamento e padronização de esferoides do intestino médio/posterior em ECM
   1. Descongele a matriz da membrana basal ECM a 4 °C durante a noite antes da incorporação.
      NOTA: Este ECM é diferente do ECM qualificado para hESC. O ECM deve ser colocado em gelo e o volume apropriado de ECM pode ser aliquotado em tubos de microcentrífuga pré-resfriados de 1,5 mL no gelo. A Tabela 1 contém informações sobre o volume do ECM. Certifique-se de que o volume de ECM seja de pelo menos 75% na gotícula na qual os esferoides serão incorporados.
   2. Aquecer uma placa de 24 poços numa incubadora a 37 °C.
   3. Colete os esferóides flutuantes de todos os 24 poços usando uma pipeta de 1000 μL e transfira-os para um tubo cônico de 15 mL. Gire os esferóides a 300 × g por 1 min em temperatura ambiente. Aspirar a maior parte do meio, mas deixar o volume necessário para o plaqueamento (Tabela 1).
   4. Prepare ponteiras de pipeta de 1000 μL e 200 μL cortando suas extremidades. Retire a placa pré-aquecida de 24 poços.
   5. Misture os esferóides flutuantes, transfira o volume apropriado para o tubo ECM colocado no gelo e, em seguida, ressuspenda os esferóides e o ECM pipetando para misturá-los bem.
   6. Pegue 65 μL da mistura de esferoides e ECM com as pontas de pipeta cortadas de 200 μL e carregue no centro de cada poço na placa de 24 poços. Para garantir que uma boa gota de ECM seja formada, levante a pipeta suave e lentamente enquanto a mistura é dispensada.
      NOTA: Placa 30-100 esferóides por poço.
   7. Transfira suavemente a placa para uma incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ e incube por 5 min.
   8. Vire a placa de cabeça para baixo e incube por 15-25 min, o que ajudará as gotículas de ECM a manter uma estrutura semelhante a uma cúpula.
   9. Durante a incubação, prepare o meio necessário e aqueça-o. Assim que o ECM estiver solidificado, adicione 0,5 mL de meio de padronização HIO ou HCO em cada poço e incube a 37 °C, 5% de CO₂. Consulte a Figura 3E para obter uma imagem de esferoides no ECM.
   10. Cultive os esferóides no meio de padronização por 3 dias.
   11. Após 3 dias, troque o meio de padronização HIO ou HCO para o meio de crescimento normal e incube a 37 °C, 5% CO₂.
       NOTA: Os organoides neste momento (Dia 10) são organoides em estágio inicial. Com base no objetivo do projeto, alguns organoides em estágio inicial podem ser usados para análise de padronização inicial, conforme detalhado na seção 2.
6. Crescimento e passagem de organoides intestinais e colônicos humanos
   1. Após o dia 10, troque o meio de crescimento a cada 3 dias.
      NOTA: Dependendo da densidade de revestimento e do crescimento dos organoides, podem ser necessárias mudanças de mídia mais frequentes. As mudanças do meio devem ser feitas antes que o vermelho de fenol (indicador de pH) no meio fique amarelo.
   2. Incube os organoides até o dia 21 (Figura 3F).
      NOTA: O tratamento com BMP2 resultará em um número reduzido de organoides (~ 3 vezes menos que os HIOs) que crescem a partir de esferóides. Portanto, um número maior de esferoides precisa ser plaqueado para a geração de HCOs.
7. Divisão de organoides no dia 21
   1. Inspecione os organoides.
      NOTA: Os organoides precisam ser divididos no dia 21, pois o ECM está quase degradado no dia 21 devido ao crescimento e expansão dos organoides.
   2. Prepare as pontas da pipeta de 1000 μL e 200 μL cortando suas extremidades.
   3. Aquecer uma placa Nunc de 24 poços numa incubadora a 37 °C.
   4. Alíquota do volume apropriado de ECM nos tubos pré-resfriados de 1,5 mL (Tabela 1).
   5. Raspe suavemente a gota de ECM com os organoides com uma ponta de pipeta de 1000 μL e pipete a mistura para cima e para baixo várias vezes para quebrar o ECM.
   6. Transferir a mistura para uma placa de Petri de 60 mm e verificar os organoides ao microscópio. Se necessário, separe os organoides uns dos outros usando uma pinça estéril. Certifique-se de que a separação não danifique o epitélio dos organoides.
   7. Transferir os organoides para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 300 × g durante 30 s. Aspire o sobrenadante e deixe ~ 1 mL de meio no tubo.
      NOTA: O volume do meio pode ser alterado com base no objetivo do experimento. Se forem necessários mais organoides por gotícula de ECM, o volume do meio pode ser diminuído. No entanto, se menos organoides forem necessários, o volume do meio pode ser aumentado.
   8. Misture bem os organoides, transfira o volume apropriado para o tubo ECM colocado no gelo e, em seguida, ressuspenda os organoides e o ECM pipetando para misturá-los bem.
   9. Adicione 65 μL da mistura de esferoides e ECM ao centro de cada poço da placa de 24 poços usando as pontas de pipeta cortadas de 200 μL.
      NOTA: É fundamental pegar os organoides primeiro e depois o ECM durante a pipetagem. Assim, ao dispensar a mistura, os organoides estão no topo da gota da MEC.
   10. Coloque a placa em uma incubadora a 37 °C, 5% CO₂ por 5 min.
   11. Vire a placa de cabeça para baixo por mais 15-25 min para ajudar as gotículas de ECM a manter uma estrutura semelhante a uma cúpula.
   12. Adicione 0,5 mL de meio de crescimento HIO/HCO em cada poço e incube a 37 °C, 5% de CO₂.
       NOTA: O meio de crescimento é o mesmo para HIOs e HCOs após a padronização.
   13. Troque o meio a cada 2-3 dias até o dia 35 (Figura 3G).

2. Verificação da padronização de organoides por reação em cadeia da polimerase quantitativa de transcrição reversa (RT-qPCR)

1. Antes de coletar o RNA, prepare 1x tampão de lise de RNA seguindo as instruções do fabricante.
2. Descarte o meio gasto e adicione 350 μL de tampão de lise a cada poço da placa de 24 poços. Lise os organoides pipetando para cima e para baixo usando uma pipeta de 1 mL. Para uma melhor lise, vórtice brevemente na velocidade máxima por 5 s.
3. Manter todas as amostras a -80 °C até estarem prontas para a extração de ARN. Quando estiver pronto, remova as amostras de RNA do freezer a -80 ° C e descongele-as no gelo por 10 min. Vortex os tubos vigorosamente à temperatura ambiente por 10-15 min para garantir a lise completa das amostras.
4. Coloque as amostras no gelo novamente e prossiga para a extração de RNA conforme as instruções do fabricante. Transferir as amostras de ARN para um congelador a -80 °C se não estiverem prontas para avançar para o passo seguinte.
5. Realize extração de RNA, tratamento de DNAse, síntese de cDNA e RT-qPCR usando metodologia padrão. Consulte a Tabela 2 para obter uma lista de nomes e sequências de primers.

3. Verificação da padronização de organoides por imunofluorescência

1. Coleta e fixação de organoides
   1. Aspire o meio HIO ou HCO dos poços apropriados e adicione 1 mL de solução salina tamponada com fosfato gelado (PBS) a cada poço. Dissocie os organoides do ECM usando uma ponta de pipeta cortada de 200 μL. Pipete para cima e para baixo para dissociar grandes pedaços de ECM dos organoides.
   2. Transfira os organoides para um tubo cônico de 15 mL e encha o resto do tubo com PBS gelado e misture delicadamente invertendo o tubo. Permita que os organoides se assentem por gravidade e aspire o PBS.
      NOTA: Se os organoides não assentarem por gravidade, centrifugue a 300 × g por 1 min.
   3. Aspire o PBS e adicione 1 mL de solução gelada de degradação de ECM. Mantenha o tubo no gelo por 10-15 min em uma plataforma giratória com agitação suave.
      NOTA: Incline o tubo em um ângulo de 45° para permitir a mistura adequada dos organoides e da solução de recuperação celular. Após 10-15 min, os organoides devem assentar no fundo do tubo, indicando a digestão completa da MEC.
   4. Adicione PBS frio no tubo até 15 mL; Misture bem invertendo o tubo várias vezes. Quando os organoides se depositarem no fundo do tubo, aspire o PBS e adicione 1 mL de paraformaldeído a 4% pré-resfriado para fixar os organoides. Incube os organoides com paraformaldeído a 4% em gelo por 1 h.
   5. Encher o resto do tubo com PBS gelado e colocá-lo horizontalmente sobre uma plataforma de baloiço a 4 °C durante a noite. No dia seguinte, descarte o paraformaldeído / PBS no recipiente de lixo especificado e lave uma vez com 15 mL de PBS gelado, conforme descrito na etapa 3.1.2.
   6. Aspire o PBS e encha o tubo com sacarose a 30% em PBS. Colocar o tubo horizontalmente numa plataforma de baloiço a 4 °C durante a noite.
   7. No dia seguinte, incorpore os organoides em um modelo básico de 7 mm x 7 mm x 5 mm com meio OCT e congele rapidamente usando um banho de gelo seco/etanol.
   8. Seque os blocos com lenços umedecidos, embrulhe-os em uma toalha de papel e mantenha-os em um freezer a -80 °C durante a noite. No dia seguinte, corte cortes de 5 μm nas lâminas do microscópio utilizando um criostato. Armazene as lâminas a -80 °C.
2. Coloração por imunofluorescência dos organoides
   1. Processe as lâminas do freezer a -80 °C e execute a coloração IF usando protocolos padrão.
   2. Aplique lamínulas nas lâminas e seque-as à temperatura ambiente, protegidas da luz durante pelo menos 2 h ou durante a noite antes da obtenção de imagens.
   3. Visualize as lâminas usando uma objetiva de 25x de um microscópio confocal.

Resultados

A geração bem-sucedida de esferoides durante o estágio de indução do intestino médio / posterior é indicativa de padronização bem-sucedida. Execute a coloração IF para CDX2 em esferoides flutuantes e na monocamada para confirmar se o padrão está correto. Embora a coloração no estágio de endoderme definitiva (DE) possa indicar a eficácia da indução de ED, a geração de esferoides não é possível sem uma indução eficiente de ED. Para testar a eficiência da induçã...

Discussão

A diferenciação de hPSCs em HIOs e HCOs é um processo complexo que requer controles de qualidade em cada etapa. As hPSCs iniciais precisam ter diferenciação mínima antes de iniciar a diferenciação em DE. Otimizar a densidade de hPSCs plaqueadas para diferenciação DE é fundamental para o sucesso do protocolo. Para garantir a qualidade da diferenciação DE, execute IF para FOXA2 e SOX17 para determinar a eficiência da diferenciação DE. A diferenciação de DE deve resultar e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Bovine serum albumin (BSA) solution	N/A	N/A	N/A
15 mL Corning tube	Falcon	21008-918	N/A
30% Sucrose	N/A	N/A	Made in PBS.
5% Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Lab	017-000-121	N/A
50 mL Corning tube	Falcon	21008-951	N/A
Accutase	Thermo Scientific	A1110501	Cell detachment solution; aliquot 5 mL of Accutase into 10 mL tubes totaling 20 tubes and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use.
Activin A	Cell guidance Systems	GFH6-100x10	Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Aliquot 38 µL of Activin A into prechilled microcentrifuge tubes and store at -80 °C (Tubes expire 12 months from date of receipt).
Activin Day 1 medium (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Use nonessential amino acids (NEAA, Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 1 medium: 500 mL of RPMI 1640 and 500 mL of NEAA. When preparing Activin Day 1 medium, add 13 mL of basic day 1 medium, 13 µl of Activin A (100 µg/mL), and 2 µl of BMP4 (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Activin Day 2 medium (RPMI 1640, 0.2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03T	Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 2 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL of NEAA, and 1 mL of 0.2% serum. When preparing Activin Day 2 medium, add 12.5 mL of basic day 2 medium and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Activin Day 3 medium (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03T	Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 3 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL NEAA, and 10 mL of 2% serum. When preparing Activin Day 3 medium, add 12.5 mL of basic day 3 and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Goat	Thermo Scientific	A11055	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit	Thermo Scientific	A21206	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 546 Donkey anti-Mouse	Thermo Scientific	A10036	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 647 Donkey anti-Mouse	Thermo Scientific	A31571	1:500 dilution (Secondary antibody)
Base mold	Fisher	22-363-552	N/A
Basic gut medium (advanced DMEM)	Gibco	12491015	When preparing Basic gut medium, add 500 mL of DMEM, 500 mL of N2 (Gibco 17-502-048), 500 mL of B27 (Gibco), 500 mL of L-Glutamine to get 2 mM L-Glutamine (Corning A2916801), 5 mL of 100 U/mL Penicillin-Streptomycin (Gibco 15-140-122), and 7.5 mL of  1 M HEPES to get 15 mM HEPES.  The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Biorad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Biorad	N/A	Other qRT-PCR systems can be used.
Cell Recovery Solution	Corning	354253	ECM-degrading solution
CHIR99021	Reprocell	4000410	Reconstitute by adding 2.15 mL of DMSO at 10 mM. Prepare 50 µL aliquots and store at -20 °C.  Store powder at 4 °C, protected from light.
CTRL HIO patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium and 100 ng/mL EGF.
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	1:100 dilution (Secondary antibody)
DE monolayer	N/A	N/A	Monolayer was generated in prior steps (Section 4.4).
Dispase	Gibco	17105041	Resuspend lyophilized powder in Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) to a 1 mg/mL final concentration. Filter the solution for sterilization by vacuuming using a Millipore filter sterilization tube. Make 10 mL aliquots (1 mg/mL) and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use.
EGF	Thermo Scientific	236-EG-01M	When preparing 100 ng/mL EGF reconstitute 500 µg/mL in sterile PBS. Next add 2 mL of sterile PBS to 1 mg EGF and make 500 µg/mL EGF solution. Aliquot 100 µL of EGF in 20 tubes.
Fisherbrand 6 cm Petri Dishes with Clear Lid	Fisher	FB0875713A	N/A
Fisherbrand Cell Lifter	Fisher	08-100-240	N/A
Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials with Closures Attached	Fisher	03-338B	N/A
Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipette	Fisher	13-678-2D0	N/A
Fluoromount G Slide Mounting Medium	VWR	100241-874	N/A
Gibco advanced DMEM	Gibco	12-491-023	N/A
Goat anti-E-Cadherin	R&D systems	AF648	1:400 dilution (Primary antibody)
Goat anti-SOX17	R&D systems	AF1924	1:500 dilution (Primary antibody)
HCOs patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL BMP2. When preparing BMP2, add 1 mL of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to BMP2 vials (100 µg). Aliquot 25 µL of BMP4 solution in 4 tubes.  The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	N/A
Human Pluripotent Stem Cells (hPSC)	Pluripotent Stem Cell Facility	N/A	Cells seeded in a Matrigel coated 24-well plate (Thermo Scientific 73520-906).
Ice-cold 4% Paraformaldehyde solution (PFA)	N/A	N/A	N/A
Ice-cold Phosphate Buffered Saline (PBS)	N/A	N/A	The pH must be 7.4.
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	101098-065	N/A
Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)	Pluripotent Stem Cell Facility (Cincinnati Children's Hospital Medical Center)	N/A	Other hESC or iPSC lines can be used, but the protocol needs to be optimized for each cell line.
Leica microtome	N/A	N/A	N/A
LSM 880			confocal microscope
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	N/A
Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	Prepare 4 x Matrigel aliquots which corresponds to volumes sufficient to make enough diluted Matrigel for 4 x 6-well dishes.
Mid-hindgut induction medium (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Nonessential amino acids (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 µM CHIR99021 and 500 ng/mL FGF4. The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Mid-hindgut spheroids	N/A	N/A	N/A
MilliporeSigma Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	MilliporeSigma	SCGP00525	N/A
Mouse anti-CDX2	BioGenex	MU392-UC	1:300 dilution (Primary antibody)
Mouse anti-FOXA2	Abnova/Novus	H00003170-M01	1:500 dilution
mTeSR1 complete growth medium	Stem Cell technologies	85870	Add 100-mL of mTeSR supplement (85870) into one 400-mL mTeSR medium (85870) and aliquot into 50-mL tubes while avoiding contamination. Store at 4°C until use.
Murray's Clear solution (Also known as BABB)	Murray's	N/A	1:2 benzyl benzoate and benzyl alcohol.
NOG HIO patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL NOGGIN (Dispense 25 µg of NOGGIN in 250 µl sterile PBS with 0.1% BSA).
NucleoSpin RNA	Takara	740955.25	Other RNA isolation kits may be used.
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells (Nunc)	Thermo Scientific	73521-004	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells coated with Matrigel	Thermo Scientific	73521-004	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells (Nunc)	Thermo Scientific	73520-906	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells coated with  Matrigel.	Thermo Scientific	73520-906	N/A
Outgrowth medium for HIOs, CTRL HIOs, and HCOs	N/A	N/A	Basic gut medium and 100 ng/mL EGF (Final concentration)
Phosphate Buffer Saline, 0.5% Triton X (PBS-T)	N/A	N/A	N/A
Primers	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT)	N/A	The primers are listed in Table 2 on the protocol.
Rabbit anti-CDX2	Cell Marque	EPR22764Y	1:100 dilution (Primary antibody)
Rabbit anti-SATB2	Cell Marque	EP281	1:100 dilution (Primary antibody)
Recombinant Human BMP-4 Protein	R&D systems	314-BP-010	Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile 4 mM HCl containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Add 4.17 mL HCl solution to 45.83 mL molecular water totaling to 50 mL of 1 M HCl. Then add 200 µL of 1 M HCl to 49.8 mL of molecular grade water totaling to 50 mL of 4 mM HCl. Next add 0.05 g BSA to 50 mL of 4 mM HCl and filter to make sterile. Aliquot sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to 33 microcentrifuge tube totaling and store at -20 °C. Add 100 µl of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to the BMP4 vials (10 µg) to make BMP4 solution at 100 µg/mL.
Recombinant Human FGF-4 Protein	R&D systems	235-F4-01M	Reconstitute at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin. Add 0.05 g of BSA in 50 mL of PBS to make 0.1% BSA. Filter 0.22 µM BSA to sterilize the BSA. Aliquot 10 mL of 0.1% BSA in 5 tubes. Add 1 mg FGF-4 in 10 mL of sterile 0.1% BSA. Aliquot 250 µL into prechilled 40 microcentrifuge tubes and store at -80 °C.
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris	1254	The final concentration is 10 mM (10 mmol/L). Resuspend in DMSO at 10 mM and filter sterilize. Add 3 mL of sterile PBS to each vial. Aliqout 100 µL of ROCK inhibitor in 30 tubes and store at -20 °C.
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Thermo Scientific	11-754-250	N/A
SuperFrost Plus microscope slides
Tissue Tek O.C.T Compound	VWR	25608-930	N/A