İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Bağırsak ve Kolonik Organoidlerin Üretimi, Bakımı ve Karakterizasyonu

Özet

Burada, insan pluripotent kök hücre kaynaklı ince bağırsak ve kolonik organoidlerin üretilmesi, sürdürülmesi ve karakterize edilmesi için ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. Bu yöntemler, tekrarlanabilirliği artırmak, ölçeklenebilirliği genişletmek ve organoidlerin kaplanması ve geçirilmesi için gereken çalışma süresini azaltmak için tasarlanmıştır.

Özet

Bağırsak bölgesel spesifikasyonu, gelişmekte olan gastrointestinal (GI) sistemin tanımlanmış alanlarına benzersiz morfoloji ve fonksiyonun verildiği bir süreci tanımlar. Bağırsaktaki bölgesel spesifikasyon, kemik morfogenetik protein (BMP) yolu da dahil olmak üzere çoklu gelişimsel yollar tarafından yönlendirilir. Normal bölgesel spesifikasyona dayanarak, insan embriyonik kök hücrelerini (hES) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreleri (iPSC'ler) içeren insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) insan kolonik organoidleri (HCO'lar) üretmek için bir yöntem geliştirilmiştir. BMP sinyalinin üç günlük bir indüksiyonu, orta / arka bağırsak tüp kültürlerini, insan kolonunda bulunan tüm ana epitel hücre tiplerini ve birlikte gelişen mezenkimal hücreleri içeren özel AT açısından zengin dizi bağlayıcı protein 2 (SATB2) eksprese eden HCO'lara yeterince modeller. Bu kritik modelleme döneminde BMP'nin ihmal edilmesi (veya BMP inhibitörü NOGGIN'in eklenmesi) insan bağırsak organoidlerinin (HIO'lar) oluşumuna neden oldu. HIO'lar ve HCO'lar morfolojik ve moleküler olarak sırasıyla insan gelişmekte olan ince bağırsak ve kolona benzer. İnsan bağırsak gelişimini incelemek için HIO'ların ve HCO'ların faydasına rağmen, HIO'ların ve HCO'ların üretilmesi zordur. Bu makale, HIO'ları ve HCO'ları oluşturmak, sürdürmek ve karakterize etmek için yöntemler sunar. Ek olarak, protokoldeki kritik adımlar ve sorun giderme önerileri sağlanır.

Giriş

İnsan kolon gelişimini incelemek, insan fetal dokusunun kullanımındaki kısıtlamalar nedeniyle zordur. Hayvan modelleri paha biçilmez olmuştur ve tarihsel olarak farelerde bağırsak gelişimini incelemek için genetik yaklaşımlar için kullanılmıştır. Bununla birlikte, fare ve insan bağırsak gelişimi arasındaki farklılıklar, farelerin bir model sistem olarak uygulanabilirliğini sınırlar. Örneğin, farelerin ince bağırsaklarında ve kolonunda kript oluşumu doğum sonrası meydana gelse de, insanlar tam olarak oluşmuş kriptlerle doğarlar¹. Ayrıca, insan ince bağırsağı ve kolonu, ince bağırsakta^motilin (MLN) eksprese eden enteroendokrin hücreler 2 ve kolonda müsin 5B (MUC5B) eksprese eden goblet hücreleri ^3,4 dahil olmak üzere farelerde bulunmayan hücre tiplerini içerir. Bu nedenle, kolon gelişiminin erken aşamalarını tanımlayan dinamik moleküler olayları doğru bir şekilde modelleyen bir hücre kültürü sistemine sahip olmak önemlidir. Bu nedenle, hPSC'leri kolon özelliklerine sahip hücreler üretmeye yönlendirmek, insan kolon gelişiminin incelenmesi için güçlü bir model sağlar.

hPSC'lerden bağırsak benzeri⁶ ve kolon benzeri organoidlerin⁷ tekrarlanabilir⁵, senkron ve verimli oluşumunu kolaylaştırmak için protokoller geliştirilmiştir. Bu protokoller, fetal bağırsak ve kolonun gelişimini taklit eden aşamalı bir farklılaşma prosedürü kullanır (Şekil 1). İlk olarak, kesin endoderm, bir Nodal taklitçisi olan Activin A ile muamele edilerek insan pluripotent kök hücrelerinden üretilir. Kesin endodermin yüksek seviyelerde WNT ve fibroblast büyüme faktörüne (FGF) maruz kalması, CDX2 ⁺ orta / arka bağırsak tüp sferoidlerine morfogenezi indükler. Midgut / hindgut sferoidleri daha sonra hücre dışı matrise (ECM) gömülür ve BMP sinyalinin geçici bir manipülasyonu yoluyla HIO'lara veya HCO'lara modellenir. NOGGIN kullanarak BMP sinyalini inhibe etmek veya tek başına büyüme ortamı eklemek, insan proksimal ince bağırsağına benzeyen HIO'ların oluşumuna neden olur.

BMP2 kullanılarak BMP sinyalini aktive ederek, orta/arka bağırsak sferoidleri, epitel ve mezenkim^7'deki desenlenmeyi koruyan HCO'lara modellenir. HCO'lar kolonla zenginleştirilmiş, MUC5B eksprese eden goblet hücreleri içerir ve kolona özgü insülin benzeri 5 (INSL5) eksprese eden enteroendokrin hücreler üretme yeteneğine sahiptir. HCO'lardan izole edilen mezenşim, insan primer kolon mezenşimi^8'de de eksprese edilen homeobox A13 (HOXA13) ve HOXD13'ü eksprese eder. Modelleme adımının, farklılaşma protokolünün 7-10. günlerinde gerçekleştiğini hatırlamak önemlidir. Bu üç günlük süre, uzun süreli in vitro kültürü takiben sürdürülen kolonik desenlenmeyi indüklemek için yeterlidir.

Aşağıda açıklanan protokoller, besleyici içermeyen hPSC kültürüne aşina olan araştırmacılar içindir. Bu tür hPSC kültürüne aşina olmayan araştırmacılar için, Cincinnati Çocuk Hastanesi'ndeki Kök Hücre Teknolojileri veya Pluripotent Kök Hücre Tesisi (PSCF) tarafından sunulanlar gibi hPSC'ler hakkında bir eğitim kursu önerilir. Başlangıç hPSC'lerinin kalitesi kritik öneme sahiptir ve tüm aşağı akış adımlarını etkileyebilir. Takip eden protokol, 4 gün boyunca büyütülen ve bölünmeye hazır olan hPSC'lerle başlayacaktır.

Protokol

1. İnsan bağırsağı ve kolonik organoidlerin oluşumu

1. ECM kaplı plakaların hazırlanması
   1. 50 mL'lik konik bir tüpe 50 mL soğuk DMEM ortamı ekleyin.
   2. -4 °C dondurucudan 80x hESC onaylı ECM'nin bir kısmını ( Malzeme Tablosuna bakın) çıkarın ve buz üzerinde çözdürün.
      NOT: 4x stok hazırlamak için gereken ESC onaylı ECM hacmini belirlemek için ürünün analiz sertifikasına bakın.
   3. ESC onaylı ECM tam olarak çözülmezse, 50 mL konik tüpten 750 μL DMEM alın ve ECM ile karıştırın.
   4. DMEM/hESC onaylı ECM karışımını DMEM ile 50 mL konik tüpe aktarın ve iyice karıştırın. 4 x 24 oyuklu hücre kültürü plakalarının her birine oyuk başına 0.5 mL ekleyin.
   5. Tüm yüzeyin kaplandığından emin olmak için ECM'yi kuyuya eşit şekilde yaymak için plakaları sallayın. Parafilm kullanarak, ECM kaplı plakaları kapatın ve en az 1 saat boyunca bir biyogüvenlik kabininde oda sıcaklığında bırakın. ECM kaplı plakaları 4 °C'de 2 haftaya kadar veya ihtiyaç duyulana kadar saklayın.
2. hPSC'nin tek hücreli kaplaması
   1. Oda sıcaklığına ulaşmasını sağlamak için ECM kaplı 24 delikli bir plakayı 30 dakika boyunca bir biyogüvenlik kabininin içine yerleştirin.
   2. mTeSR1 tam ortamı, hücre ayırma solüsyonunu ve gelişmiş DMEM'i 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin ve 30 dakika ısınmalarına izin verin.
   3. hPSC'lerin minimum farklılaşma ile en az %85 oranında birleştiğini doğrulayın. Gerekirse farklılaşmış hücreleri çıkarın.
   4. Kaplama ortamını 50 mL'lik konik bir tüpte aşağıdaki gibi hazırlayın: 13 mL mTeSR1 ve 13 μL 10 mM Y-27632 Rho ile ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü.
      NOT: Y-27632, anoikis'i inhibe eder ve tek hücrelerin hayatta kalmasını artırır.
   5. 6 oyuklu bir plakadan hücreleri toplamak için, ortamı 3 ila 4 oyuktan aspire edin ve kuyucuk başına 2 mL gelişmiş DMEM ile bir kez yıkayın.
   6. Gelişmiş DMEM'i aspire edin ve her bir oyuğa 1 mL hücre ayrışma solüsyonu dağıtın. Plakayı %5 CO₂, 37 °C inkübatör içinde 5-7 dakika inkübe edin. Mikroskop altında hücrelerin süspansiyonda olup olmadığını kontrol edin.
   7. 5 mL'lik bir pipet kullanarak 4-5 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek kalan hücre kümelerini ayırın.
   8. Her oyuğa 2 mL gelişmiş DMEM ekleyin, 4-5 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 × g'da döndürün.
   9. Hücre peletini aspire etmeden besiyerini tüpten aspire edin ve hazırlanan mTeSR1 artı ROCK inhibitörü ortamından 6 mL ekleyin. 3-4 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri nazikçe yeniden süspanse edin ve ardından süspansiyonu 50 mL'lik tüpün içindeki mTeSR1/ROCK inhibitör ortamının geri kalanına aktarın. 4-5 kez kuvvetlice tekrar askıya alın ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın.
   10. Hücreleri kaplamadan hemen önce ECM'yi 24 oyuklu plakadan aspire edin. 2-3 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri tekrar süspanse edin ve her oyuğa 0.5 mL hücre süspansiyonu dağıtın.
       NOT: Optimum kaplama yoğunluğunun deneyci tarafından belirlenmesi gerekir. Burada optimal hücre sayısı kuyu başına 80.000-200.000 hücredir.
   11. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı saat yönünde 3 kez, saat yönünün tersine 3 kez, 3 kez ileri ve geri ve 3 kez yan yana hafifçe sallayın.
   12. Plakayı 37 °C,% 5 CO₂ inkübatöre aktarın ve 24 saat inkübe edin.
       NOT: Hücrelerin kuyucuklar içinde uygun şekilde dağılmasını sağlamak için ilk birkaç saat plakayı rahatsız etmeyin.
   13. 24 saat sonra (Şekil 2A), harcanan ortamı aspire edin, mTeSR1 oyuğu başına 0.5 mL ekleyin, 37 ° C'de tekrar inkübe edin, 24 saat boyunca% 5 CO₂ (Şekil 2B) ve ardından bir sonraki adıma geçin.
3. Kesin endodermin (DE) hPSC'lerden ayırt edilmesi
   1. 15 mL'lik konik bir tüpe, 13 mL Aktivin Gün 1 ortamı ( Malzeme Tablosuna bakınız), 13 μL 100 μg / mL Aktivin A ve 1.95 μL 100 μg / mL BMP4 ekleyin. Ortamı 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.
   2. mTeSR1 ortamını 24 oyuklu plakadan aspire edin ve oyuk başına 0.5 mL Aktivin Gün 1 ortamı ekleyin. Plakayı 37 °C,% 5 CO₂ inkübatöre yerleştirin ve 24 saat inkübe edin. 24 saat sonra hücreleri kontrol edin.
      NOT: Şekil 2C'de gösterildiği gibi geniş hücre ölümü belirgin olmalıdır. Tek tabaka seyrek görünse de, hücre kolonileri genişlemiş olacaktır.
   3. 15 mL'lik konik bir tüpte 12.5 mL Aktivin Gün 2 ortamına 12.5 μL 100 μg / mL Aktivin A ekleyerek Aktivin Gün 2 tam ortamını hazırlayın. Tüpü 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
   4. 24 oyuklu farklılaşma plakasını CO₂ inkübatörden çıkarın ve harcanan ortamı çıkarın. Kuyucuk başına 0.5 mL önceden ısıtılmış Activin Day 2 ortamını dağıtın ve plakayı 24 saat boyunca CO₂ inkübatörünün içine geri yerleştirin.
      NOT: Ortamı dağıtırken dikkatli olunmalıdır. Ortamı doğrudan kuyu ortasına dağıtmayın, çünkü bu tek tabakadaki hücreleri ayıracaktır. Ortamı kuyunun kenarından dikkatlice dağıtın. Ertesi gün, ihmal edilebilir hücre ölümü ile tek bir hücre tabakası oluşur. Hücreler şimdi ~% 90 ila 95 birleşik olmalıdır (Şekil 2D).
   5. 15 mL'lik konik bir tüpte 12.5 mL Aktivin Gün 3 ortamına 12.5 μL 100 μg / mL Aktivin A ekleyerek Aktivin Gün 3 tam ortamını hazırlayın. Tüpü 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
   6. Harcanan ortamı çıkarın ve kuyucuk başına 0.5 mL Activin Day 3 ortamı dağıtın.
      NOT: Ortamı dağıtırken dikkatli olunmalıdır. Ortamı doğrudan kuyu ortasına dağıtmayın, çünkü bu tek tabakadaki hücreleri ayıracaktır. Ortamı kuyunun kenarından dikkatlice dağıtın. Ertesi gün, tek tabaka bu aşamada çok az hücre ölümü ile veya hiç hücre ölümü olmadan tam birleşmeye ulaşmalıdır. Activin Day 3 medium'u ekledikten 24 saat sonra tek tabaka birleşmezse, orta arka bağırsak sferoidleri oluşturmaya çalışmayın. Orta hindgut sferoidlerinin oluşumuna geçmeden önce DE tek tabakasının ideal morfolojisi için Şekil 2E'ye bakın.
   7. DE farklılaşmasını optimize ederken çatal başlı kutu A2 proteini (FOXA2) ve cinsiyet belirleyici bölge Y (SRY) kutusu transkripsiyon faktörü 17'nin (SOX17) ekspresyonu için tek tabakanın immünofloresan (IF) boyamasını gerçekleştirin.
4. DE'nin orta arka sferoidlere farklılaşması
   1. 50 mL'lik konik bir tüpe, FGF4 (CHIR99021 yok) ile 25 mL orta hindgut indüksiyon ortamı ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
   2. Tam orta hindgut indüksiyon ortamını hazırlamak için, ortam ısındıktan sonra 7,5 μL CHIR99021 ekleyin.
   3. Harcanan ortamı çıkarın, oyuk başına 0.5 mL orta arka bağırsak indüksiyon ortamı dağıtın ve 24 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO_2'de inkübe edin.
   4. Ertesi gün tek tabaka içindeki hücrelerin yoğunlaşması meydana geldikten sonra (Şekil 3A), harcanan ortamı taze orta arka bağırsak indüksiyon ortamı ile değiştirin ve plakayı 24 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO₂ inkübatöre geri yerleştirin.
      NOT: Boru şeklindeki yapılar, Şekil 3B'de gösterildiği gibi, 48 saatlik orta arka bağırsak indüksiyonundan sonra fark edilecektir. Orta arka bağırsak sferoidleri, Şekil 3C'de gösterildiği gibi 3. günde tek tabakadan tomurcuklanmaya başlayacaktır.
   5. Ortamı değiştirirken yüzen sferoidlerin atılmasını önlemek için, eski ortamı 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 300 × g'da 1 dakika santrifüjleyin. Sferoidleri 12.5 mL taze orta hindgut indüksiyon ortamında yeniden süspanse edin, aynı 24 oyuklu plakaya oyuk başına 0.5 mL ekleyin ve 24 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO_2'de inkübe edin.
   6. Hindgut indüksiyonunun 4. gününde (Şekil 3D), ortamı 15 mL'lik bir tüpe toplayarak ve ardından 1 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyerek plaka kuyucuklarından yüzen sferoidleri hasat edin. ECM'ye orta arka bağırsak sferoidlerini gömmek için bir sonraki adıma geçin.
5. ECM'de orta/arka sferoidlerin kaplanması ve modellenmesi
   1. Gömmeden önce ECM bazal membran matrisini gece boyunca 4 °C'de çözdürün.
      NOT: Bu ECM, hESC onaylı ECM'den farklıdır. ECM buz üzerine konulmalıdır ve uygun hacimde ECM, buz üzerinde önceden soğutulmuş 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarılabilir. Tablo 1 , ECM hacmi hakkında bilgi içerir. Sferoidlerin gömüleceği damlacıkta ECM hacminin en az %75 olduğundan emin olun.
   2. 24 oyuklu bir plakayı 37 ° C'lik bir inkübatörde ısıtın.
   3. 1000 μL'lik bir pipet kullanarak 24 oyuğun tümünden yüzen sferoidleri toplayın ve bunları 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Sferoidleri oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Ortamın çoğunu aspire edin, ancak kaplama için gereken hacmi bırakın (Tablo 1).
   4. 1000 μL ve 200 μL pipet uçlarını uçlarını keserek hazırlayın. Önceden ısıtılmış 24 oyuklu plakayı çıkarın.
   5. Yüzen sferoidleri karıştırın, uygun hacmi buz üzerine yerleştirilmiş ECM tüpüne aktarın ve ardından sferoidleri ve ECM'yi iyice karıştırmak için pipetleyerek yeniden süspanse edin.
   6. Kesilmiş 200 μL pipet uçları ile sferoid ve ECM karışımından 65 μL alın ve 24 oyuklu plakadaki her bir oyuğun ortasına yükleyin. İyi bir ECM damlacığı oluştuğundan emin olmak için, karışım dağıtılırken pipeti nazikçe ve yavaşça kaldırın.
      NOT: Plaka kuyu başına 30-100 sferoid.
   7. Plakayı yavaşça 37 °C,% 5 CO₂ inkübatöre aktarın ve 5 dakika inkübe edin.
   8. Plakayı ters çevirin ve 15-25 dakika inkübe edin, bu ECM damlacıklarının kubbe benzeri bir yapıyı korumasına yardımcı olacaktır.
   9. Kuluçka sırasında gerekli ortamı hazırlayın ve ısıtın. ECM katılaştıktan sonra, her bir oyuğa 0,5 mL HIO veya HCO desenli ortam ekleyin ve 37 ° C,% 5 CO_2'de inkübe edin. ECM'deki sferoidlerin bir görüntüsü için Şekil 3E'ye bakın.
   10. Sferoidleri 3 gün boyunca desen ortamında kültürleyin.
   11. 3 gün sonra, HIO veya HCO modelleme ortamını normal büyüme ortamına değiştirin ve 37 ° C,% 5 CO_2'de inkübe edin.
       NOT: Bu zaman noktasındaki (10. gün) organoidler erken evre organoidlerdir. Proje hedefine bağlı olarak, bölüm 2'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, bazı erken aşama organoidler erken modelleme analizi için kullanılabilir.
6. İnsan bağırsağı ve kolonik organoidlerin büyümesi ve geçmesi
   1. 10. günden sonra, büyüme ortamını her 3 günde bir değiştirin.
      NOT: Kaplama yoğunluğuna ve organoidlerin büyümesine bağlı olarak, daha sık ortam değişiklikleri gerekebilir. Ortamdaki fenol kırmızısı (pH indikatörü) sarı hale gelmeden önce ortam değişiklikleri yapılmalıdır.
   2. Organoidleri 21. güne kadar inkübe edin (Şekil 3F).
      NOT: BMP2 tedavisi, sferoidlerden büyüyen organoidlerin sayısının azalmasına (HIO'lardan ~ 3 kat daha az) neden olacaktır. Bu nedenle, HCO'ların üretilmesi için daha fazla sayıda sferoidin kaplanması gerekir.
7. 21. günde organoidlerin bölünmesi
   1. Organoidleri inceleyin.
      NOT: Organoidlerin 21. günde bölünmesi gerekir, çünkü organoid büyümesi ve genişlemesi nedeniyle ECM 21. günde neredeyse bozulur.
   2. 1000 μL ve 200 μL pipet uçlarını uçlarını keserek hazırlayın.
   3. 24 oyuklu bir Nunc plakasını 37 ° C'lik bir inkübatörde ısıtın.
   4. Uygun ECM hacmini önceden soğutulmuş 1,5 mL'lik tüplere alın (Tablo 1).
   5. ECM damlacığını 1000 μL'lik bir pipet ucuyla organoidlerle nazikçe kazıyın ve ECM'yi parçalamak için karışımı birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
   6. Karışımı 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın ve organoidleri mikroskop altında kontrol edin. Gerekirse, steril forseps kullanarak organoidleri birbirinden ayırın. Ayrılmanın organoidlerin epiteline zarar vermediğinden emin olun.
   7. Organoidleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 30 saniye boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve tüpte ~ 1 mL ortam bırakın.
      NOT: Ortamın hacmi, deneyin amacına göre değiştirilebilir. ECM damlası başına daha fazla organoid gerekiyorsa, orta hacim azaltılabilir. Bununla birlikte, daha az organoid gerekiyorsa, orta hacim arttırılabilir.
   8. Organoidleri iyice karıştırın, uygun hacmi buz üzerine yerleştirilmiş ECM tüpüne aktarın ve ardından organoidleri ve ECM'yi iyice karıştırmak için pipetleyerek yeniden süspanse edin.
   9. Kesilen 200 μL'lik pipet uçlarını kullanarak 24 oyuklu plakanın her bir oyuğunun ortasına 65 μL sferoid ve ECM karışımı ekleyin.
      NOT: Pipetleme sırasında önce organoidleri ve ardından ECM'yi almak çok önemlidir. Böylece, karışımı dağıtırken, organoidler ECM damlacığının en üstünde yer alır.
   10. Plakayı 37 °C,% 5 CO₂ inkübatöre 5 dakika boyunca koyun.
   11. ECM damlacıklarının kubbe benzeri bir yapıyı korumasına yardımcı olmak için plakayı 15-25 dakika daha ters çevirin.
   12. Her oyuğa 0.5 mL HIO / HCO büyüme ortamı ekleyin ve 37 ° C,% 5 CO_2'de inkübe edin.
       NOT: Büyüme ortamı, modellemeden sonra hem HIO'lar hem de HCO'lar için aynıdır.
   13. Ortamı 35. güne kadar her 2-3 günde bir değiştirin (Şekil 3G).

2. Ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ile organoidlerin desenlenmesinin doğrulanması

1. RNA'yı toplamadan önce, üreticinin talimatlarını izleyerek 1x RNA lizis tamponu hazırlayın.
2. Harcanan ortamı atın ve 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 350 μL lizis tamponu ekleyin. 1 mL'lik bir pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyerek organoidleri parçalayın. Daha iyi lizis için, 5 saniye boyunca maksimum hızda kısa bir süre girdap.
3. RNA ekstraksiyonu için hazır olana kadar tüm numuneleri -80 °C'de tutun. Hazır olduğunda, RNA örneklerini -80 °C dondurucudan çıkarın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde çözdürün. Numunelerin tamamen parçalanmasını sağlamak için tüpleri oda sıcaklığında 10-15 dakika kuvvetlice vorteksleyin.
4. Numuneleri tekrar buzun üzerine yerleştirin ve üreticinin talimatına göre RNA ekstraksiyonuna devam edin. Bir sonraki adıma geçmeye hazır değilseniz, RNA örneklerini -80 °C'lik bir dondurucuya aktarın.
5. Standart metodolojiyi kullanarak RNA ekstraksiyonu, DNAse tedavisi, cDNA sentezi ve RT-qPCR gerçekleştirin. Primer adlarının ve dizilerinin bir listesi için Tablo 2'ye bakın.

3. İmmünofloresan ile organoidlerin desenlenmesinin doğrulanması

1. Organoidlerin toplanması ve fiksasyonu
   1. Uygun kuyucuklardan HIO veya HCO ortamını aspire edin ve her oyuğa 1 mL buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak organoidleri ECM'den ayırın. ECM'nin büyük parçalarını organoidlerden ayırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
   2. Organoidleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve tüpün geri kalanını buz gibi soğuk PBS ile doldurun ve tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın. Organoidlerin yerçekimi ile yerleşmesine ve PBS'yi aspire etmesine izin verin.
      NOT: Organoidler yerçekimi ile çökelmezse, 300 × g'da 1 dakika santrifüjleyin.
   3. PBS'yi aspire edin ve 1 mL buz gibi soğuk ECM bozundurucu solüsyon ekleyin. Tüpü hafifçe çalkalayarak dönen bir platform üzerinde 10-15 dakika buz üzerinde tutun.
      NOT: Organoidlerin ve Hücre Kurtarma Solüsyonunun uygun şekilde karıştırılmasını sağlamak için tüpü 45 ° 'lik bir açıyla eğin. 10-15 dakika sonra, organoidler tüpün dibine çökmelidir, bu da ECM'nin tam sindirimini gösterir.
   4. Tüpe 15 mL'ye kadar soğuk PBS ekleyin; Tüpü birkaç kez ters çevirerek iyice karıştırın. Organoidler tüpün dibine çöktüğünde, PBS'yi aspire edin ve organoidleri sabitlemek için 1 mL önceden soğutulmuş% 4 paraformaldehit ekleyin. Organoidleri% 4 paraformaldehit ile buz üzerinde 1 saat inkübe edin.
   5. Tüpün geri kalanını buz gibi soğuk PBS ile doldurun ve gece boyunca 4 °C'de sallanan bir platforma yatay olarak yerleştirin. Ertesi gün, paraformaldehit/PBS'yi belirtilen atık kabına atın ve adım 3.1.2'de açıklandığı gibi 15 mL buz gibi soğuk PBS ile bir kez yıkayın.
   6. PBS'yi aspire edin ve tüpü PBS'de% 30 sükroz ile doldurun. Tüpü gece boyunca 4 °C'de sallanan bir platform üzerine yatay olarak yerleştirin.
   7. Ertesi gün, organoidleri OCT ortamı ile 7 mm x 7 mm x 5 mm'lik bir temel modele gömün ve kuru bir buz / etanol banyosu kullanarak hızlı dondurma yapın.
   8. Blokları laboratuvar mendilleriyle kurulayın, bir kağıt havluya sarın ve gece boyunca -80 °C dondurucuda saklayın. Ertesi gün, bir kriyostat kullanarak mikroskop slaytları üzerine 5 μm'lik kesitler kesin. Slaytları -80 °C'de saklayın.
2. Organoidlerin immünofloresan boyanması
   1. Slaytları -80 °C dondurucudan işleyin ve standart protokolleri kullanarak IF boyama yapın.
   2. Lamellere lamel uygulayın ve görüntülemeden önce en az 2 saat veya gece boyunca ışıktan koruyarak oda sıcaklığında kurutun.
   3. Konfokal mikroskobun 25x objektifini kullanarak slaytları görüntüleyin.

Sonuçlar

Orta/arka bağırsak indüksiyon aşaması sırasında başarılı sferoid üretimi, başarılı modellemenin göstergesidir. Desenlemenin doğru olduğunu doğrulamak için yüzen sferoidlerde ve tek katmanda CDX2 için IF boyama gerçekleştirin. Kesin endoderm (DE) aşamasında boyama, DE indüksiyonunun etkinliğini gösterebilse de, verimli DE indüksiyonu olmadan sferoid üretimi mümkün değildir. DE indüksiyonunun etkinliğini test etmek için, FOXA2 ve SOX17 için IF boyama ve...

Tartışmalar

hPSC'lerin HIO'lar ve HCO'lar olarak ayırt edilmesi, her adımda kalite kontrolleri gerektiren karmaşık bir süreçtir. Başlangıç hPSC'lerinin DE'ye farklılaşmayı başlatmadan önce minimum farklılaşmaya sahip olması gerekir. DE farklılaşması için kaplanan hPSC'lerin yoğunluğunu optimize etmek, protokolün başarısı için kritik öneme sahiptir. DE farklılaşmasının kalitesini sağlamak için, DE farklılaşmasının verimliliğini belirlemek için FOXA2 ve SOX17 i...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Bovine serum albumin (BSA) solution	N/A	N/A	N/A
15 mL Corning tube	Falcon	21008-918	N/A
30% Sucrose	N/A	N/A	Made in PBS.
5% Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Lab	017-000-121	N/A
50 mL Corning tube	Falcon	21008-951	N/A
Accutase	Thermo Scientific	A1110501	Cell detachment solution; aliquot 5 mL of Accutase into 10 mL tubes totaling 20 tubes and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use.
Activin A	Cell guidance Systems	GFH6-100x10	Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Aliquot 38 µL of Activin A into prechilled microcentrifuge tubes and store at -80 °C (Tubes expire 12 months from date of receipt).
Activin Day 1 medium (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Use nonessential amino acids (NEAA, Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 1 medium: 500 mL of RPMI 1640 and 500 mL of NEAA. When preparing Activin Day 1 medium, add 13 mL of basic day 1 medium, 13 µl of Activin A (100 µg/mL), and 2 µl of BMP4 (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Activin Day 2 medium (RPMI 1640, 0.2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03T	Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 2 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL of NEAA, and 1 mL of 0.2% serum. When preparing Activin Day 2 medium, add 12.5 mL of basic day 2 medium and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Activin Day 3 medium (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03T	Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 3 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL NEAA, and 10 mL of 2% serum. When preparing Activin Day 3 medium, add 12.5 mL of basic day 3 and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Goat	Thermo Scientific	A11055	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit	Thermo Scientific	A21206	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 546 Donkey anti-Mouse	Thermo Scientific	A10036	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 647 Donkey anti-Mouse	Thermo Scientific	A31571	1:500 dilution (Secondary antibody)
Base mold	Fisher	22-363-552	N/A
Basic gut medium (advanced DMEM)	Gibco	12491015	When preparing Basic gut medium, add 500 mL of DMEM, 500 mL of N2 (Gibco 17-502-048), 500 mL of B27 (Gibco), 500 mL of L-Glutamine to get 2 mM L-Glutamine (Corning A2916801), 5 mL of 100 U/mL Penicillin-Streptomycin (Gibco 15-140-122), and 7.5 mL of  1 M HEPES to get 15 mM HEPES.  The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Biorad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Biorad	N/A	Other qRT-PCR systems can be used.
Cell Recovery Solution	Corning	354253	ECM-degrading solution
CHIR99021	Reprocell	4000410	Reconstitute by adding 2.15 mL of DMSO at 10 mM. Prepare 50 µL aliquots and store at -20 °C.  Store powder at 4 °C, protected from light.
CTRL HIO patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium and 100 ng/mL EGF.
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	1:100 dilution (Secondary antibody)
DE monolayer	N/A	N/A	Monolayer was generated in prior steps (Section 4.4).
Dispase	Gibco	17105041	Resuspend lyophilized powder in Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) to a 1 mg/mL final concentration. Filter the solution for sterilization by vacuuming using a Millipore filter sterilization tube. Make 10 mL aliquots (1 mg/mL) and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use.
EGF	Thermo Scientific	236-EG-01M	When preparing 100 ng/mL EGF reconstitute 500 µg/mL in sterile PBS. Next add 2 mL of sterile PBS to 1 mg EGF and make 500 µg/mL EGF solution. Aliquot 100 µL of EGF in 20 tubes.
Fisherbrand 6 cm Petri Dishes with Clear Lid	Fisher	FB0875713A	N/A
Fisherbrand Cell Lifter	Fisher	08-100-240	N/A
Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials with Closures Attached	Fisher	03-338B	N/A
Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipette	Fisher	13-678-2D0	N/A
Fluoromount G Slide Mounting Medium	VWR	100241-874	N/A
Gibco advanced DMEM	Gibco	12-491-023	N/A
Goat anti-E-Cadherin	R&D systems	AF648	1:400 dilution (Primary antibody)
Goat anti-SOX17	R&D systems	AF1924	1:500 dilution (Primary antibody)
HCOs patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL BMP2. When preparing BMP2, add 1 mL of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to BMP2 vials (100 µg). Aliquot 25 µL of BMP4 solution in 4 tubes.  The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	N/A
Human Pluripotent Stem Cells (hPSC)	Pluripotent Stem Cell Facility	N/A	Cells seeded in a Matrigel coated 24-well plate (Thermo Scientific 73520-906).
Ice-cold 4% Paraformaldehyde solution (PFA)	N/A	N/A	N/A
Ice-cold Phosphate Buffered Saline (PBS)	N/A	N/A	The pH must be 7.4.
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	101098-065	N/A
Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)	Pluripotent Stem Cell Facility (Cincinnati Children's Hospital Medical Center)	N/A	Other hESC or iPSC lines can be used, but the protocol needs to be optimized for each cell line.
Leica microtome	N/A	N/A	N/A
LSM 880			confocal microscope
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	N/A
Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	Prepare 4 x Matrigel aliquots which corresponds to volumes sufficient to make enough diluted Matrigel for 4 x 6-well dishes.
Mid-hindgut induction medium (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Nonessential amino acids (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 µM CHIR99021 and 500 ng/mL FGF4. The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Mid-hindgut spheroids	N/A	N/A	N/A
MilliporeSigma Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	MilliporeSigma	SCGP00525	N/A
Mouse anti-CDX2	BioGenex	MU392-UC	1:300 dilution (Primary antibody)
Mouse anti-FOXA2	Abnova/Novus	H00003170-M01	1:500 dilution
mTeSR1 complete growth medium	Stem Cell technologies	85870	Add 100-mL of mTeSR supplement (85870) into one 400-mL mTeSR medium (85870) and aliquot into 50-mL tubes while avoiding contamination. Store at 4°C until use.
Murray's Clear solution (Also known as BABB)	Murray's	N/A	1:2 benzyl benzoate and benzyl alcohol.
NOG HIO patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL NOGGIN (Dispense 25 µg of NOGGIN in 250 µl sterile PBS with 0.1% BSA).
NucleoSpin RNA	Takara	740955.25	Other RNA isolation kits may be used.
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells (Nunc)	Thermo Scientific	73521-004	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells coated with Matrigel	Thermo Scientific	73521-004	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells (Nunc)	Thermo Scientific	73520-906	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells coated with  Matrigel.	Thermo Scientific	73520-906	N/A
Outgrowth medium for HIOs, CTRL HIOs, and HCOs	N/A	N/A	Basic gut medium and 100 ng/mL EGF (Final concentration)
Phosphate Buffer Saline, 0.5% Triton X (PBS-T)	N/A	N/A	N/A
Primers	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT)	N/A	The primers are listed in Table 2 on the protocol.
Rabbit anti-CDX2	Cell Marque	EPR22764Y	1:100 dilution (Primary antibody)
Rabbit anti-SATB2	Cell Marque	EP281	1:100 dilution (Primary antibody)
Recombinant Human BMP-4 Protein	R&D systems	314-BP-010	Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile 4 mM HCl containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Add 4.17 mL HCl solution to 45.83 mL molecular water totaling to 50 mL of 1 M HCl. Then add 200 µL of 1 M HCl to 49.8 mL of molecular grade water totaling to 50 mL of 4 mM HCl. Next add 0.05 g BSA to 50 mL of 4 mM HCl and filter to make sterile. Aliquot sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to 33 microcentrifuge tube totaling and store at -20 °C. Add 100 µl of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to the BMP4 vials (10 µg) to make BMP4 solution at 100 µg/mL.
Recombinant Human FGF-4 Protein	R&D systems	235-F4-01M	Reconstitute at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin. Add 0.05 g of BSA in 50 mL of PBS to make 0.1% BSA. Filter 0.22 µM BSA to sterilize the BSA. Aliquot 10 mL of 0.1% BSA in 5 tubes. Add 1 mg FGF-4 in 10 mL of sterile 0.1% BSA. Aliquot 250 µL into prechilled 40 microcentrifuge tubes and store at -80 °C.
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris	1254	The final concentration is 10 mM (10 mmol/L). Resuspend in DMSO at 10 mM and filter sterilize. Add 3 mL of sterile PBS to each vial. Aliqout 100 µL of ROCK inhibitor in 30 tubes and store at -20 °C.
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Thermo Scientific	11-754-250	N/A
SuperFrost Plus microscope slides
Tissue Tek O.C.T Compound	VWR	25608-930	N/A