Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Burada, insan pluripotent kök hücre kaynaklı ince bağırsak ve kolonik organoidlerin üretilmesi, sürdürülmesi ve karakterize edilmesi için ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. Bu yöntemler, tekrarlanabilirliği artırmak, ölçeklenebilirliği genişletmek ve organoidlerin kaplanması ve geçirilmesi için gereken çalışma süresini azaltmak için tasarlanmıştır.
Bağırsak bölgesel spesifikasyonu, gelişmekte olan gastrointestinal (GI) sistemin tanımlanmış alanlarına benzersiz morfoloji ve fonksiyonun verildiği bir süreci tanımlar. Bağırsaktaki bölgesel spesifikasyon, kemik morfogenetik protein (BMP) yolu da dahil olmak üzere çoklu gelişimsel yollar tarafından yönlendirilir. Normal bölgesel spesifikasyona dayanarak, insan embriyonik kök hücrelerini (hES) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreleri (iPSC'ler) içeren insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) insan kolonik organoidleri (HCO'lar) üretmek için bir yöntem geliştirilmiştir. BMP sinyalinin üç günlük bir indüksiyonu, orta / arka bağırsak tüp kültürlerini, insan kolonunda bulunan tüm ana epitel hücre tiplerini ve birlikte gelişen mezenkimal hücreleri içeren özel AT açısından zengin dizi bağlayıcı protein 2 (SATB2) eksprese eden HCO'lara yeterince modeller. Bu kritik modelleme döneminde BMP'nin ihmal edilmesi (veya BMP inhibitörü NOGGIN'in eklenmesi) insan bağırsak organoidlerinin (HIO'lar) oluşumuna neden oldu. HIO'lar ve HCO'lar morfolojik ve moleküler olarak sırasıyla insan gelişmekte olan ince bağırsak ve kolona benzer. İnsan bağırsak gelişimini incelemek için HIO'ların ve HCO'ların faydasına rağmen, HIO'ların ve HCO'ların üretilmesi zordur. Bu makale, HIO'ları ve HCO'ları oluşturmak, sürdürmek ve karakterize etmek için yöntemler sunar. Ek olarak, protokoldeki kritik adımlar ve sorun giderme önerileri sağlanır.
İnsan kolon gelişimini incelemek, insan fetal dokusunun kullanımındaki kısıtlamalar nedeniyle zordur. Hayvan modelleri paha biçilmez olmuştur ve tarihsel olarak farelerde bağırsak gelişimini incelemek için genetik yaklaşımlar için kullanılmıştır. Bununla birlikte, fare ve insan bağırsak gelişimi arasındaki farklılıklar, farelerin bir model sistem olarak uygulanabilirliğini sınırlar. Örneğin, farelerin ince bağırsaklarında ve kolonunda kript oluşumu doğum sonrası meydana gelse de, insanlar tam olarak oluşmuş kriptlerle doğarlar1. Ayrıca, insan ince bağırsağı ve kolonu, ince bağırsaktamotilin (MLN) eksprese eden enteroendokrin hücreler 2 ve kolonda müsin 5B (MUC5B) eksprese eden goblet hücreleri 3,4 dahil olmak üzere farelerde bulunmayan hücre tiplerini içerir. Bu nedenle, kolon gelişiminin erken aşamalarını tanımlayan dinamik moleküler olayları doğru bir şekilde modelleyen bir hücre kültürü sistemine sahip olmak önemlidir. Bu nedenle, hPSC'leri kolon özelliklerine sahip hücreler üretmeye yönlendirmek, insan kolon gelişiminin incelenmesi için güçlü bir model sağlar.
hPSC'lerden bağırsak benzeri6 ve kolon benzeri organoidlerin7 tekrarlanabilir5, senkron ve verimli oluşumunu kolaylaştırmak için protokoller geliştirilmiştir. Bu protokoller, fetal bağırsak ve kolonun gelişimini taklit eden aşamalı bir farklılaşma prosedürü kullanır (Şekil 1). İlk olarak, kesin endoderm, bir Nodal taklitçisi olan Activin A ile muamele edilerek insan pluripotent kök hücrelerinden üretilir. Kesin endodermin yüksek seviyelerde WNT ve fibroblast büyüme faktörüne (FGF) maruz kalması, CDX2 + orta / arka bağırsak tüp sferoidlerine morfogenezi indükler. Midgut / hindgut sferoidleri daha sonra hücre dışı matrise (ECM) gömülür ve BMP sinyalinin geçici bir manipülasyonu yoluyla HIO'lara veya HCO'lara modellenir. NOGGIN kullanarak BMP sinyalini inhibe etmek veya tek başına büyüme ortamı eklemek, insan proksimal ince bağırsağına benzeyen HIO'ların oluşumuna neden olur.
BMP2 kullanılarak BMP sinyalini aktive ederek, orta/arka bağırsak sferoidleri, epitel ve mezenkim7'deki desenlenmeyi koruyan HCO'lara modellenir. HCO'lar kolonla zenginleştirilmiş, MUC5B eksprese eden goblet hücreleri içerir ve kolona özgü insülin benzeri 5 (INSL5) eksprese eden enteroendokrin hücreler üretme yeteneğine sahiptir. HCO'lardan izole edilen mezenşim, insan primer kolon mezenşimi8'de de eksprese edilen homeobox A13 (HOXA13) ve HOXD13'ü eksprese eder. Modelleme adımının, farklılaşma protokolünün 7-10. günlerinde gerçekleştiğini hatırlamak önemlidir. Bu üç günlük süre, uzun süreli in vitro kültürü takiben sürdürülen kolonik desenlenmeyi indüklemek için yeterlidir.
Aşağıda açıklanan protokoller, besleyici içermeyen hPSC kültürüne aşina olan araştırmacılar içindir. Bu tür hPSC kültürüne aşina olmayan araştırmacılar için, Cincinnati Çocuk Hastanesi'ndeki Kök Hücre Teknolojileri veya Pluripotent Kök Hücre Tesisi (PSCF) tarafından sunulanlar gibi hPSC'ler hakkında bir eğitim kursu önerilir. Başlangıç hPSC'lerinin kalitesi kritik öneme sahiptir ve tüm aşağı akış adımlarını etkileyebilir. Takip eden protokol, 4 gün boyunca büyütülen ve bölünmeye hazır olan hPSC'lerle başlayacaktır.
1. İnsan bağırsağı ve kolonik organoidlerin oluşumu
2. Ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ile organoidlerin desenlenmesinin doğrulanması
3. İmmünofloresan ile organoidlerin desenlenmesinin doğrulanması
Orta/arka bağırsak indüksiyon aşaması sırasında başarılı sferoid üretimi, başarılı modellemenin göstergesidir. Desenlemenin doğru olduğunu doğrulamak için yüzen sferoidlerde ve tek katmanda CDX2 için IF boyama gerçekleştirin. Kesin endoderm (DE) aşamasında boyama, DE indüksiyonunun etkinliğini gösterebilse de, verimli DE indüksiyonu olmadan sferoid üretimi mümkün değildir. DE indüksiyonunun etkinliğini test etmek için, FOXA2 ve SOX17 için IF boyama ve...
hPSC'lerin HIO'lar ve HCO'lar olarak ayırt edilmesi, her adımda kalite kontrolleri gerektiren karmaşık bir süreçtir. Başlangıç hPSC'lerinin DE'ye farklılaşmayı başlatmadan önce minimum farklılaşmaya sahip olması gerekir. DE farklılaşması için kaplanan hPSC'lerin yoğunluğunu optimize etmek, protokolün başarısı için kritik öneme sahiptir. DE farklılaşmasının kalitesini sağlamak için, DE farklılaşmasının verimliliğini belirlemek için FOXA2 ve SOX17 i...
Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Múnera laboratuvarı, NIH / NCI 5U54CA210962-02 Güney Carolina Kanser Eşitsizlikleri Araştırma Merkezi (SC CADRE), NIH / NIGMS P20 GM130457-01A1 Sindirim ve Karaciğer Hastalığında COBRE ve NIH / NIDDK 1P30 DK123704-01 MUSC Sindirim Hastalığı Araştırma Çekirdek Merkezi tarafından finanse edilmektedir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1% Bovine serum albumin (BSA) solution | N/A | N/A | N/A |
15 mL Corning tube | Falcon | 21008-918 | N/A |
30% Sucrose | N/A | N/A | Made in PBS. |
5% Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 017-000-121 | N/A |
50 mL Corning tube | Falcon | 21008-951 | N/A |
Accutase | Thermo Scientific | A1110501 | Cell detachment solution; aliquot 5 mL of Accutase into 10 mL tubes totaling 20 tubes and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use. |
Activin A | Cell guidance Systems | GFH6-100x10 | Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Aliquot 38 µL of Activin A into prechilled microcentrifuge tubes and store at -80 °C (Tubes expire 12 months from date of receipt). |
Activin Day 1 medium (RPMI 1640) | Corning | MT10041CV | Use nonessential amino acids (NEAA, Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 1 medium: 500 mL of RPMI 1640 and 500 mL of NEAA. When preparing Activin Day 1 medium, add 13 mL of basic day 1 medium, 13 µl of Activin A (100 µg/mL), and 2 µl of BMP4 (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors. |
Activin Day 2 medium (RPMI 1640, 0.2% FBS vol/vol) | Hyclone | SH30070.03T | Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 2 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL of NEAA, and 1 mL of 0.2% serum. When preparing Activin Day 2 medium, add 12.5 mL of basic day 2 medium and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors. |
Activin Day 3 medium (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol) | Hyclone | SH30070.03T | Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 3 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL NEAA, and 10 mL of 2% serum. When preparing Activin Day 3 medium, add 12.5 mL of basic day 3 and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors. |
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Goat | Thermo Scientific | A11055 | 1:500 dilution (Secondary antibody) |
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit | Thermo Scientific | A21206 | 1:500 dilution (Secondary antibody) |
Alexa Fluor 546 Donkey anti-Mouse | Thermo Scientific | A10036 | 1:500 dilution (Secondary antibody) |
Alexa Fluor 647 Donkey anti-Mouse | Thermo Scientific | A31571 | 1:500 dilution (Secondary antibody) |
Base mold | Fisher | 22-363-552 | N/A |
Basic gut medium (advanced DMEM) | Gibco | 12491015 | When preparing Basic gut medium, add 500 mL of DMEM, 500 mL of N2 (Gibco 17-502-048), 500 mL of B27 (Gibco), 500 mL of L-Glutamine to get 2 mM L-Glutamine (Corning A2916801), 5 mL of 100 U/mL Penicillin-Streptomycin (Gibco 15-140-122), and 7.5 mL of 1 M HEPES to get 15 mM HEPES. The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors. |
Biorad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | N/A | Other qRT-PCR systems can be used. |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | ECM-degrading solution |
CHIR99021 | Reprocell | 4000410 | Reconstitute by adding 2.15 mL of DMSO at 10 mM. Prepare 50 µL aliquots and store at -20 °C. Store powder at 4 °C, protected from light. |
CTRL HIO patterning medium | N/A | N/A | Basic gut medium and 100 ng/mL EGF. |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:100 dilution (Secondary antibody) |
DE monolayer | N/A | N/A | Monolayer was generated in prior steps (Section 4.4). |
Dispase | Gibco | 17105041 | Resuspend lyophilized powder in Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) to a 1 mg/mL final concentration. Filter the solution for sterilization by vacuuming using a Millipore filter sterilization tube. Make 10 mL aliquots (1 mg/mL) and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use. |
EGF | Thermo Scientific | 236-EG-01M | When preparing 100 ng/mL EGF reconstitute 500 µg/mL in sterile PBS. Next add 2 mL of sterile PBS to 1 mg EGF and make 500 µg/mL EGF solution. Aliquot 100 µL of EGF in 20 tubes. |
Fisherbrand 6 cm Petri Dishes with Clear Lid | Fisher | FB0875713A | N/A |
Fisherbrand Cell Lifter | Fisher | 08-100-240 | N/A |
Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials with Closures Attached | Fisher | 03-338B | N/A |
Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipette | Fisher | 13-678-2D0 | N/A |
Fluoromount G Slide Mounting Medium | VWR | 100241-874 | N/A |
Gibco advanced DMEM | Gibco | 12-491-023 | N/A |
Goat anti-E-Cadherin | R&D systems | AF648 | 1:400 dilution (Primary antibody) |
Goat anti-SOX17 | R&D systems | AF1924 | 1:500 dilution (Primary antibody) |
HCOs patterning medium | N/A | N/A | Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL BMP2. When preparing BMP2, add 1 mL of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to BMP2 vials (100 µg). Aliquot 25 µL of BMP4 solution in 4 tubes. The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors. |
Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | N/A |
Human Pluripotent Stem Cells (hPSC) | Pluripotent Stem Cell Facility | N/A | Cells seeded in a Matrigel coated 24-well plate (Thermo Scientific 73520-906). |
Ice-cold 4% Paraformaldehyde solution (PFA) | N/A | N/A | N/A |
Ice-cold Phosphate Buffered Saline (PBS) | N/A | N/A | The pH must be 7.4. |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | 101098-065 | N/A |
Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) | Pluripotent Stem Cell Facility (Cincinnati Children's Hospital Medical Center) | N/A | Other hESC or iPSC lines can be used, but the protocol needs to be optimized for each cell line. |
Leica microtome | N/A | N/A | N/A |
LSM 880 | confocal microscope | ||
Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | N/A |
Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | Prepare 4 x Matrigel aliquots which corresponds to volumes sufficient to make enough diluted Matrigel for 4 x 6-well dishes. |
Mid-hindgut induction medium (RPMI 1640) | Corning | MT10041CV | Nonessential amino acids (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 µM CHIR99021 and 500 ng/mL FGF4. The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors. |
Mid-hindgut spheroids | N/A | N/A | N/A |
MilliporeSigma Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | MilliporeSigma | SCGP00525 | N/A |
Mouse anti-CDX2 | BioGenex | MU392-UC | 1:300 dilution (Primary antibody) |
Mouse anti-FOXA2 | Abnova/Novus | H00003170-M01 | 1:500 dilution |
mTeSR1 complete growth medium | Stem Cell technologies | 85870 | Add 100-mL of mTeSR supplement (85870) into one 400-mL mTeSR medium (85870) and aliquot into 50-mL tubes while avoiding contamination. Store at 4°C until use. |
Murray's Clear solution (Also known as BABB) | Murray's | N/A | 1:2 benzyl benzoate and benzyl alcohol. |
NOG HIO patterning medium | N/A | N/A | Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL NOGGIN (Dispense 25 µg of NOGGIN in 250 µl sterile PBS with 0.1% BSA). |
NucleoSpin RNA | Takara | 740955.25 | Other RNA isolation kits may be used. |
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells (Nunc) | Thermo Scientific | 73521-004 | N/A |
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells coated with Matrigel | Thermo Scientific | 73521-004 | N/A |
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells (Nunc) | Thermo Scientific | 73520-906 | N/A |
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells coated with Matrigel. | Thermo Scientific | 73520-906 | N/A |
Outgrowth medium for HIOs, CTRL HIOs, and HCOs | N/A | N/A | Basic gut medium and 100 ng/mL EGF (Final concentration) |
Phosphate Buffer Saline, 0.5% Triton X (PBS-T) | N/A | N/A | N/A |
Primers | Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT) | N/A | The primers are listed in Table 2 on the protocol. |
Rabbit anti-CDX2 | Cell Marque | EPR22764Y | 1:100 dilution (Primary antibody) |
Rabbit anti-SATB2 | Cell Marque | EP281 | 1:100 dilution (Primary antibody) |
Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D systems | 314-BP-010 | Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile 4 mM HCl containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Add 4.17 mL HCl solution to 45.83 mL molecular water totaling to 50 mL of 1 M HCl. Then add 200 µL of 1 M HCl to 49.8 mL of molecular grade water totaling to 50 mL of 4 mM HCl. Next add 0.05 g BSA to 50 mL of 4 mM HCl and filter to make sterile. Aliquot sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to 33 microcentrifuge tube totaling and store at -20 °C. Add 100 µl of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to the BMP4 vials (10 µg) to make BMP4 solution at 100 µg/mL. |
Recombinant Human FGF-4 Protein | R&D systems | 235-F4-01M | Reconstitute at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin. Add 0.05 g of BSA in 50 mL of PBS to make 0.1% BSA. Filter 0.22 µM BSA to sterilize the BSA. Aliquot 10 mL of 0.1% BSA in 5 tubes. Add 1 mg FGF-4 in 10 mL of sterile 0.1% BSA. Aliquot 250 µL into prechilled 40 microcentrifuge tubes and store at -80 °C. |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | The final concentration is 10 mM (10 mmol/L). Resuspend in DMSO at 10 mM and filter sterilize. Add 3 mL of sterile PBS to each vial. Aliqout 100 µL of ROCK inhibitor in 30 tubes and store at -20 °C. |
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | 11-754-250 | N/A |
SuperFrost Plus microscope slides | |||
Tissue Tek O.C.T Compound | VWR | 25608-930 | N/A |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır