Génération, maintenance et caractérisation d’organoïdes intestinaux et coliques dérivés de cellules souches pluripotentes humaines

Résumé

Ici, des méthodes détaillées pour générer, maintenir et caractériser des organoïdes de l’intestin grêle et du côlon dérivés de cellules souches pluripotentes humaines sont décrites. Ces méthodes sont conçues pour améliorer la reproductibilité, étendre l’évolutivité et réduire le temps de travail nécessaire au placage et au passage des organoïdes.

Résumé

La spécification régionale intestinale décrit un processus par lequel une morphologie et une fonction uniques sont transmises à des zones définies du tractus gastro-intestinal (GI) en développement. La spécification régionale dans l’intestin est déterminée par de multiples voies de développement, y compris la voie des protéines morphogénétiques osseuses (BMP). Sur la base de spécifications régionales normales, une méthode permettant de générer des organoïdes du côlon humain (HCO) à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC), qui comprennent des cellules souches embryonnaires humaines (hES) et des cellules souches pluripotentes induites (iPSC), a été développée. Une induction de trois jours de la signalisation BMP permet de structurer suffisamment les cultures de tubes moyens/postérieurs en HCO spéciaux exprimant la protéine de liaison à la séquence 2 riche en AT (SATB2) contenant tous les principaux types de cellules épithéliales présentes dans le côlon humain ainsi que des cellules mésenchymateuses en co-développement. L’omission de BMP (ou l’ajout de l’inhibiteur de BMP NOGGIN) au cours de cette période critique a entraîné la formation d’organoïdes intestinaux humains (HIO). Les HIO et les HCO ressemblent morphologiquement et moléculairement au développement de l’intestin grêle et du côlon humains, respectivement. Malgré l’utilité des DOI et des OCS pour l’étude du développement intestinal humain, il est difficile de les générer et de les ORS. Le présent document présente des méthodes de production, de maintien et de caractérisation des DOI et des OSC. En outre, les étapes critiques du protocole et les recommandations de dépannage sont fournies.

Introduction

L’étude du développement du côlon humain est difficile en raison des restrictions sur l’utilisation du tissu fœtal humain. Les modèles animaux ont été inestimables et historiquement utilisés pour les approches génétiques chez la souris afin d’étudier le développement intestinal. Cependant, les différences entre le développement intestinal de la souris et de l’homme limitent l’applicabilité des souris en tant que système modèle. Par exemple, bien que la formation de cryptes dans l’intestin grêle et le côlon des souris se produise après la naissance, les humains naissent avec des cryptes entièrement formées¹. De plus, l’intestin grêle et le côlon humains contiennent des types de cellules que l’on ne trouve pas chez la souris, y compris les cellules entéroendocrines exprimant la motiline (MLN) dans l’intestin grêle² et les cellules caliciformes exprimant la mucine 5B (MUC5B) dans le côlon ^3,4. Pour cette raison, il est important d’avoir un système de culture cellulaire qui modélise avec précision les événements moléculaires dynamiques qui définissent les premiers stades du développement du côlon. Par conséquent, le fait de diriger les hPSC pour générer des cellules ayant des caractéristiques du côlon fournit un modèle puissant pour l’étude du développement du côlon humain.

Des protocoles ont été développés pour faciliter la formation reproductible⁵, synchrone et efficace d’organoïdes⁶ semblables à l’intestin et d’organoïdes⁷ semblables au côlon à partir de CSPh. Ces protocoles utilisent une procédure de différenciation par étapes qui imite le développement de l’intestin et du côlon fœtaux (Figure 1). Tout d’abord, l’endoderme définitif est généré à partir de cellules souches pluripotentes humaines par traitement avec de l’Activine A, un mimétique nodal. L’exposition de l’endoderme définitif à des niveaux élevés de WNT et de facteur de croissance des fibroblastes (FGF) induit la morphogenèse en sphéroïdes du tube CDX2⁺ de l’intestin moyen/postérieur. Les sphéroïdes de l’intestin moyen et de l’intestin postérieur sont ensuite intégrés dans une matrice extracellulaire (MEC) et structurés en HIO ou en HCO par une manipulation transitoire de la signalisation BMP. L’inhibition de la signalisation BMP à l’aide de NOGGIN ou de l’ajout d’un milieu de croissance seul entraîne la formation de HIO, qui ressemblent à l’intestin grêle proximal humain.

En activant la signalisation BMP à l’aide de BMP2, les sphéroïdes de l’intestin moyen/postérieur sont structurés en HCO, qui conservent la structuration dans l’épithélium et le mésenchyme⁷. Les HCO contiennent des cellules caliciformes enrichies du côlon, exprimant MUC5B, et sont capables de générer des cellules entéroendocrines spécifiques de l’insuline 5 (INSL5) spécifiques du côlon. Le mésenchyme isolé des HCO exprime l’homéobox A13 (HOXA13) et HOXD13, qui sont également exprimés dans le mésenchyme primaire du côlon^{humain 8}. Il est important de se rappeler que l’étape de structuration se produit pendant les jours 7 à 10 du protocole de différenciation. Cette période de trois jours est suffisante pour induire la formation du côlon qui se maintient après une culture in vitro prolongée.

Les protocoles décrits ci-dessous s’adressent aux chercheurs qui connaissent bien la culture de CSPh sans nourrisseur. Pour les chercheurs qui ne sont pas familiers avec ce type de culture de hPSC, une formation sur les hPSC telle que celles proposées par Stem Cell Technologies ou le Pluripotent Stem Cell Facility (PSCF) de l’hôpital pour enfants de Cincinnati est recommandée. La qualité des hPSC de départ est critique et peut affecter toutes les étapes en aval. Le protocole qui suit commencerait avec des hPSC qui ont été cultivées pendant 4 jours et qui sont prêtes à se diviser.

Protocole

1. Génération d’organoïdes intestinaux et côliques humains

1. Préparation de plaques revêtues d’ECM
   1. Ajouter 50 ml de milieu DMEM froid dans un tube conique de 50 ml.
   2. Retirez une aliquote de 4x hESC qualifiée ECM (voir le tableau des matériaux) du congélateur à -80 °C et décongelez-la sur de la glace.
      REMARQUE : Reportez-vous au certificat d’analyse du produit pour déterminer le volume d’ECM qualifié ESC nécessaire pour préparer une crosse 4x.
   3. Si l’ECM qualifié hESC n’est pas complètement décongelé, prélever 750 μL de DMEM dans le tube conique de 50 mL et le mélanger avec l’ECM.
   4. Transférez le mélange ECM qualifié DMEM/hESC dans le tube conique de 50 mL avec DMEM et mélangez bien. Ajouter 0,5 mL par puits dans chacune des 4 plaques de culture cellulaire de 24 puits.
   5. Secouez les plaques pour répartir uniformément l’ECM dans tout le puits afin de vous assurer que toute la surface est couverte. À l’aide d’un parafilm, scellez les plaques recouvertes d’ECM et laissez-les à température ambiante dans une enceinte de biosécurité pendant au moins 1 h. Stockez les plaques revêtues d’ECM à 4 °C jusqu’à 2 semaines ou jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
2. Placage unicellulaire des hPSC
   1. Placez une plaque à 24 puits recouverte d’ECM à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité pendant 30 minutes pour lui permettre d’atteindre la température ambiante.
   2. Placez le milieu complet mTeSR1, la solution de détachement cellulaire et le DMEM avancé dans un bain-marie à 37 °C et laissez-les se réchauffer pendant 30 min.
   3. Vérifiez que les hPSC sont confluents à au moins 85 % avec une différenciation minimale. Retirez toutes les cellules différenciées si nécessaire.
   4. Préparez le milieu de placage dans un tube conique de 50 mL comme suit : 13 mL de mTeSR1 et 13 μL de 10 mM Y-27632 inhibiteur de la protéine kinase associée à la Rho (ROCK).
      REMARQUE : L’Y-27632 inhibe l’anoikis et augmente la survie des cellules individuelles.
   5. Pour prélever des cellules à partir d’une plaque à 6 puits, aspirez le milieu de 3 à 4 puits et lavez-le une fois avec 2 ml de DMEM avancé par puits.
   6. Aspirez le DMEM avancé et distribuez 1 mL de la solution de dissociation cellulaire dans chaque puits. Incuber la plaque pendant 5 à 7 min à l’intérieur d’un incubateur à 5 % de CO₂, 37 °C. Vérifiez au microscope que les cellules sont en suspension.
   7. Dissociez les amas de cellules restants en pipetant de haut en bas 4 à 5 fois à l’aide d’une pipette de 5 ml.
   8. Ajoutez 2 ml de DMEM avancé dans chaque puits, pipetez doucement de haut en bas 4 à 5 fois et transférez dans un tube conique de 15 ml. Faites tourner les cellules à 300 × g pendant 3 min à température ambiante.
   9. Aspirez le milieu du tube sans aspirer la pastille cellulaire et ajoutez 6 ml du milieu préparé de mTeSR1 plus l’inhibiteur de ROCK. Remettez doucement les cellules en suspension en pipetant de haut en bas 3 à 4 fois, puis transférez la suspension dans le reste du milieu inhibiteur de mTeSR1/ROCK à l’intérieur du tube de 50 ml. Remettez vigoureusement en suspension 4 à 5 fois et comptez les cellules à l’aide d’un hémacytomètre.
   10. Aspirez l’ECM de la plaque à 24 puits juste avant de plaquer les cellules. Remettez les cellules en suspension en pipetant de haut en bas 2 à 3 fois et distribuez 0,5 ml de la suspension cellulaire dans chaque puits.
       REMARQUE : La densité de placage optimale doit être déterminée par l’expérimentateur. Ici, le nombre optimal de cellules est de 80 000 à 200 000 cellules par puits.
   11. Basculez doucement la plaque 3 fois dans le sens des aiguilles d’une montre, 3 fois dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, 3 fois vers l’avant et vers l’arrière et 3 fois d’un côté à l’autre pour disperser uniformément les cellules.
   12. Transférez la plaque dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ et incubez pendant 24 h.
       REMARQUE : Ne dérangez pas la plaque pendant les premières heures pour assurer une bonne dispersion des cellules dans les puits.
   13. Après 24 h (figure 2A), aspirer le milieu usé, ajouter 0,5 mL par puits de mTeSR1, incuber à nouveau à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 24 h (figure 2B), puis passer à l’étape suivante.
3. Différenciation de l’endoderme définitif (DE) des hPSC
   1. Dans un tube conique de 15 ml, ajouter 13 ml de milieu Activin Day 1 (voir le tableau des matières), 13 μL d’Activin A à 100 μg/mL et 1,95 μL de BMP4 à 100 μg/mL. Réchauffez le milieu dans un bain-marie à 37 °C.
   2. Aspirez le milieu mTeSR1 de la plaque à 24 puits et ajoutez 0,5 mL de milieu Activin Day 1 par puits. Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C, 5 % CO₂ et incubez pendant 24 h. Vérifiez les cellules après 24 h.
      REMARQUE : Une mort cellulaire étendue devrait être apparente, comme illustré à la figure 2C. Bien que la monocouche apparaisse clairsemée, les colonies de cellules se sont développées.
   3. Préparez le milieu complet Activin Jour 2 en ajoutant 12,5 μL de 100 μg/mL d’Activin A dans 12,5 ml de milieu Activin Jour 2 dans un tube conique de 15 ml. Placez le tube dans un bain-marie à 37 °C.
   4. Sortez la plaque de différenciation à 24 puits de l’incubateur de CO₂ et retirez le milieu usé. Versez 0,5 mL de milieu Activin Day 2 préchauffé par puits et remettez la plaque à l’intérieur de l’incubateur de CO₂ pendant 24 h.
      REMARQUE : Des précautions doivent être prises lors de la distribution du fluide. Ne distribuez pas le fluide directement au centre du puits, car cela détacherait les cellules de la monocouche. Répartissez soigneusement le fluide sur le côté du puits. Le lendemain, une monocouche de cellules se forme avec une mort cellulaire négligeable. Les cellules devraient maintenant être confluentes de ~90 à 95 % (Figure 2D).
   5. Préparez le milieu complet Activin Jour 3 en ajoutant 12,5 μL de 100 μg/mL d’Activin A dans 12,5 mL de milieu Activin Jour 3 dans un tube conique de 15 mL. Placez le tube dans un bain-marie à 37 °C.
   6. Retirer le milieu épuisé et distribuer 0,5 mL de milieu Activin Day 3 par puits.
      REMARQUE : Des précautions doivent être prises lors de la distribution du fluide. Ne distribuez pas le fluide directement au centre du puits car cela détacherait les cellules de la monocouche. Répartissez soigneusement le fluide sur le côté du puits. Le lendemain, la monocouche devrait atteindre sa pleine confluence avec peu ou pas de mort cellulaire à ce stade. N’essayez pas de générer des sphéroïdes de l’intestin moyen si la monocouche n’est pas confluente 24 h après l’ajout du milieu Activin Day 3. Reportez-vous à la figure 2E pour la morphologie idéale de la monocouche DE avant de procéder à la génération de sphéroïdes de l’intestin moyen.
   7. Effectuer une coloration par immunofluorescence (IF) de la monocouche pour l’expression de la protéine de la boîte de fourche A2 (FOXA2) et du facteur de transcription de la boîte 17 de la région Y déterminant le sexe (SRY) (SOX17) lors de l’optimisation de la différenciation DE.
4. Différenciation de l’ED, en sphéroïdes de l’intestin moyen postérieur
   1. Dans un tube conique de 50 ml, ajoutez 25 ml de milieu d’induction de l’intestin moyen postérieur avec FGF4 (sans CHIR99021) et placez-le dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 min.
   2. Pour préparer le milieu d’induction complet de l’intestin moyen, ajoutez 7,5 μL de CHIR99021 une fois que le milieu est chaud.
   3. Retirer le milieu usé, distribuer 0,5 mL de milieu d’induction de l’intestin postérieur moyen par puits et incuber à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 24 h.
   4. Une fois que la condensation des cellules à l’intérieur de la monocouche s’est produite le lendemain (figure 3A), remplacez le milieu épuisé par un milieu d’induction frais de l’intestin postérieur moyen et replacez la plaque dans un incubateur à 37 °C à 5 % de CO₂ pendant 24 h.
      REMARQUE : Les structures tubulaires seront perceptibles après 48 h d’induction de l’intestin postérieur, comme le montre la figure 3B. Les sphéroïdes de l’intestin postérieur commenceront à bourgeonner de la monocouche le jour 3, comme le montre la figure 3C.
   5. Pour éviter de jeter les sphéroïdes flottants lors du changement de milieu, transférez l’ancien milieu dans un tube de 15 ml et centrifugez-le à 300 × g pendant 1 min. Remettre les sphéroïdes en suspension dans 12,5 mL de milieu d’induction frais pour l’intestin moyen, ajouter 0,5 mL par puits dans la même plaque à 24 puits et incuber à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 24 h.
   6. Au 4e jour de l’induction de l’intestin postérieur (figure 3D), récolter les sphéroïdes flottants dans les puits de la plaque en recueillant le milieu dans un tube de 15 mL, suivi d’une centrifugation à 300 × g pendant 1 min. Passez à l’étape suivante pour l’intégration des sphéroïdes de l’intestin moyen postérieur dans la MEC.
5. Placage et structuration des sphéroïdes de l’intestin moyen et postérieur dans la MEC
   1. Décongeler la matrice de la membrane basale ECM à 4 °C pendant la nuit avant l’enrobage.
      REMARQUE : Cet ECM est différent de l’ECM qualifié hESC. L’ECM doit être placé sur de la glace, et le volume approprié d’ECM peut être aliquote dans des tubes de microcentrifugation pré-refroidis de 1,5 mL sur de la glace. Le tableau 1 contient des informations sur le volume ECM. Assurez-vous que le volume de la MEC est d’au moins 75 % dans la gouttelette dans laquelle les sphéroïdes seront intégrés.
   2. Réchauffez une plaque de 24 puits dans un incubateur à 37 °C.
   3. Prélever les sphéroïdes flottants de tous les 24 puits à l’aide d’une pipette de 1000 μL et les transférer dans un tube conique de 15 mL. Faites tourner les sphéroïdes à 300 × g pendant 1 min à température ambiante. Aspirez la majeure partie du milieu mais laissez le volume nécessaire au placage (tableau 1).
   4. Préparez les pointes de pipette de 1000 μL et 200 μL en coupant leurs extrémités. Sortez l’assiette préchauffée à 24 puits.
   5. Mélangez les sphéroïdes flottants, transférez le volume approprié dans le tube ECM placé sur de la glace, puis remettez en suspension les sphéroïdes et l’ECM en pipetant pour bien les mélanger.
   6. Prélever 65 μL du mélange de sphéroïdes et d’ECM avec les pointes de pipette coupées de 200 μL et charger au centre de chaque puits dans la plaque à 24 puits. Pour vous assurer qu’une bonne gouttelette ECM se forme, soulevez la pipette doucement et lentement pendant que le mélange est distribué.
      REMARQUE : Plaquez 30-100 sphéroïdes par puits.
   7. Transférez délicatement la plaque dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ et incubez pendant 5 min.
   8. Retournez la plaque et incubez pendant 15 à 25 minutes, ce qui aidera les gouttelettes ECM à maintenir une structure en forme de dôme.
   9. Pendant l’incubation, préparez le milieu requis et réchauffez-le. Une fois que l’ECM est solidifié, ajouter 0,5 mL de milieu de structuration HIO ou HCO dans chaque puits et incuber à 37 °C, 5 % de CO₂. Voir la figure 3E pour une image des sphéroïdes en ECM.
   10. Cultivez les sphéroïdes dans le milieu de culture pendant 3 jours.
   11. Après 3 jours, remplacer le milieu de croissance HIO ou HCO par un milieu de croissance normal et incuber à 37 °C, 5 % de CO₂.
       REMARQUE : Les organoïdes à ce stade (jour 10) sont des organoïdes à un stade précoce. En fonction de l’objectif du projet, certains organoïdes à un stade précoce peuvent être utilisés pour l’analyse précoce des motifs, comme détaillé à la section 2.
6. Excroissance et passage d’organoïdes intestinaux et côliques humains
   1. Après le 10e jour, changez le milieu de culture tous les 3 jours.
      REMARQUE : Selon la densité de placage et la croissance des organoïdes, des changements de milieu plus fréquents peuvent être nécessaires. Les changements de milieu doivent être effectués avant que le rouge de phénol (indicateur de pH) dans le milieu ne devienne jaune.
   2. Incuber les organoïdes jusqu’au jour 21 (Figure 3F).
      REMARQUE : Le traitement BMP2 entraînera une réduction du nombre d’organoïdes (~3 fois moins que les HIO) qui poussent à partir des sphéroïdes. Par conséquent, un plus grand nombre de sphéroïdes doit être plaqué pour la génération de HCOs.
7. Séparation des organoïdes au jour 21
   1. Inspectez les organoïdes.
      REMARQUE : Les organoïdes doivent être divisés le jour 21 car l’ECM est presque dégradé au jour 21 en raison de la croissance et de l’expansion des organoïdes.
   2. Préparez les pointes de pipette de 1000 μL et 200 μL en coupant leurs extrémités.
   3. Réchauffez une plaque Nunc de 24 puits dans un incubateur à 37 °C.
   4. Aliquote le volume approprié de MEC dans les tubes prérefroidis de 1,5 mL (tableau 1).
   5. Grattez doucement la gouttelette ECM avec les organoïdes avec une pointe de pipette de 1000 μL et pipetez le mélange de haut en bas plusieurs fois pour briser l’ECM.
   6. Transférez le mélange dans une boîte de Pétri de 60 mm et vérifiez les organoïdes au microscope. Si nécessaire, séparez les organoïdes les uns des autres à l’aide d’une pince stérile. Assurez-vous que la séparation n’endommage pas l’épithélium des organoïdes.
   7. Transvaser les organoïdes dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 300 × g pendant 30 s. Aspirer le surnageant et laisser ~1 mL de milieu dans le tube.
      REMARQUE : Le volume du milieu peut être modifié en fonction de l’objectif de l’expérience. Si plus d’organoïdes sont nécessaires par gouttelette ECM, le volume moyen peut être diminué. Cependant, si moins d’organoïdes sont nécessaires, le volume moyen peut être augmenté.
   8. Mélangez bien les organoïdes, transférez le volume approprié dans le tube ECM posé sur de la glace, puis remettez en suspension les organoïdes et l’ECM en pipetant pour bien les mélanger.
   9. Ajoutez 65 μL du mélange de sphéroïdes et d’ECM au centre de chaque puits de la plaque de 24 puits à l’aide des pointes de pipette coupées de 200 μL.
      REMARQUE : Il est essentiel de prélever d’abord les organoïdes, puis l’ECM pendant le pipetage. Ainsi, lors de la distribution du mélange, les organoïdes se trouvent au sommet de la gouttelette ECM.
   10. Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 5 min.
   11. Retournez la plaque pendant encore 15 à 25 minutes pour aider les gouttelettes ECM à maintenir une structure en forme de dôme.
   12. Ajouter 0,5 mL de milieu de croissance HIO/HCO dans chaque puits et incuber à 37 °C, 5 % CO₂.
       REMARQUE : Le milieu de croissance est le même pour les HIO et les HCO après la structuration.
   13. Changez de support tous les 2-3 jours jusqu’au jour 35 (Figure 3G).

2. Vérification de la structuration des organoïdes par réaction en chaîne par polymérase quantitative à transcription inverse (RT-qPCR)

1. Avant de prélever l’ARN, préparez 1x tampon de lyse de l’ARN en suivant les instructions du fabricant.
2. Jeter le milieu usé et ajouter 350 μL de tampon de lyse dans chaque puits de la plaque à 24 puits. Lyser les organoïdes en pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette de 1 ml. Pour une meilleure lyse, agiter brièvement à vitesse maximale pendant 5 s.
3. Conservez tous les échantillons à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’extraction de l’ARN. Une fois prêts, sortez les échantillons d’ARN du congélateur à -80 °C et décongelez-les sur de la glace pendant 10 min. Agiter vigoureusement les tubes à température ambiante pendant 10 à 15 minutes pour assurer une lyse complète des échantillons.
4. Placez à nouveau les échantillons sur de la glace et procédez à l’extraction de l’ARN selon les instructions du fabricant. Transférez les échantillons d’ARN dans un congélateur à -80 °C si vous n’êtes pas prêt à passer à l’étape suivante.
5. Effectuez l’extraction d’ARN, le traitement de l’ADNe, la synthèse d’ADNc et la RT-qPCR à l’aide d’une méthodologie standard. Voir le tableau 2 pour une liste des noms et des séquences d’amorces.

3. Vérification de la structuration des organoïdes par immunofluorescence

1. Collecte et fixation d’organoïdes
   1. Aspirer le milieu HIO ou HCO des puits appropriés et ajouter 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée dans chaque puits. Dissociez les organoïdes de l’ECM à l’aide d’une pointe de pipette coupée de 200 μL. Pipette de haut en bas pour dissocier les gros morceaux d’ECM des organoïdes.
   2. Transférez les organoïdes dans un tube conique de 15 mL et remplissez le reste du tube de PBS glacé et mélangez doucement en inversant le tube. Laisser les organoïdes se déposer par gravité et aspirer le PBS.
      REMARQUE : Si les organoïdes ne se déposent pas par gravité, centrifuger à 300 × g pendant 1 min.
   3. Aspirez le PBS et ajoutez 1 mL de solution glacée de dégradation de l’ECM. Gardez le tube sur de la glace pendant 10 à 15 minutes sur une plate-forme rotative en secouant doucement.
      REMARQUE : Inclinez le tube à un angle de 45° pour permettre un bon mélange des organoïdes et de la solution de récupération cellulaire. Après 10-15 min, les organoïdes devraient se déposer au fond du tube, indiquant la digestion complète de l’ECM.
   4. Ajouter du PBS froid dans le tube jusqu’à 15 ml ; Bien mélanger en retournant le tube plusieurs fois. Lorsque les organoïdes se déposent au fond du tube, aspirez le PBS et ajoutez 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % pré-refroidi pour fixer les organoïdes. Incuber les organoïdes avec 4 % de paraformaldéhyde sur de la glace pendant 1 h.
   5. Remplissez le reste du tube avec du PBS glacé et placez-le horizontalement sur une plate-forme à bascule à 4 °C pendant la nuit. Le lendemain, jeter le paraformaldéhyde/PBS dans le contenant à déchets spécifié et laver une fois avec 15 ml de PBS glacé, comme décrit à l’étape 3.1.2.
   6. Aspirez le PBS et remplissez le tube avec 30 % de saccharose dans du PBS. Placez le tube horizontalement sur une plate-forme basculante à 4 °C pendant la nuit.
   7. Le lendemain, intégrez les organoïdes dans un modèle de base de 7 mm x 7 mm x 5 mm avec un milieu OCT et congelez-les à l’aide d’un bain de glace carbonique et d’éthanol.
   8. Séchez les blocs avec des lingettes de laboratoire, enveloppez-les dans une serviette en papier et conservez-les dans un congélateur à -80 °C pendant la nuit. Le lendemain, découpez des coupes de 5 μm sur des lames de microscope à l’aide d’un cryostat. Stockez les lames à -80 °C.
2. Coloration par immunofluorescence des organoïdes
   1. Traitez les lames à partir du congélateur à -80 °C et effectuez la coloration IF en utilisant les protocoles standard.
   2. Appliquez des lamelles sur les lames et séchez-les à température ambiante, à l’abri de la lumière pendant au moins 2 h ou toute la nuit avant l’imagerie.
   3. Imagez les lames à l’aide d’un objectif 25x d’un microscope confocal.

Résultats

La génération réussie de sphéroïdes au cours de la phase d’induction de l’intestin moyen et postérieur est révélatrice d’un modèle réussi. Effectuer une coloration IF pour CDX2 sur des sphéroïdes flottants et sur la monocouche pour confirmer que le motif est correct. Bien que la coloration au stade définitif de l’endoderme (DE) puisse indiquer l’efficacité de l’induction DE, la génération de sphéroïdes n’est pas possible sans une induction efficace de DE. ...

Discussion

La différenciation des CSP en DOI et en OSS est un processus complexe qui nécessite des contrôles de qualité à chaque étape. Les hPSC de départ doivent avoir une différenciation minimale avant d’initier la différenciation en DE. L’optimisation de la densité des hPSC plaqués pour la différenciation DE est essentielle au succès du protocole. Pour garantir la qualité de la différenciation DE, effectuez une FI pour FOXA2 et SOX17 afin de déterminer l’efficacité de la d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Bovine serum albumin (BSA) solution	N/A	N/A	N/A
15 mL Corning tube	Falcon	21008-918	N/A
30% Sucrose	N/A	N/A	Made in PBS.
5% Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Lab	017-000-121	N/A
50 mL Corning tube	Falcon	21008-951	N/A
Accutase	Thermo Scientific	A1110501	Cell detachment solution; aliquot 5 mL of Accutase into 10 mL tubes totaling 20 tubes and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use.
Activin A	Cell guidance Systems	GFH6-100x10	Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Aliquot 38 µL of Activin A into prechilled microcentrifuge tubes and store at -80 °C (Tubes expire 12 months from date of receipt).
Activin Day 1 medium (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Use nonessential amino acids (NEAA, Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 1 medium: 500 mL of RPMI 1640 and 500 mL of NEAA. When preparing Activin Day 1 medium, add 13 mL of basic day 1 medium, 13 µl of Activin A (100 µg/mL), and 2 µl of BMP4 (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Activin Day 2 medium (RPMI 1640, 0.2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03T	Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 2 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL of NEAA, and 1 mL of 0.2% serum. When preparing Activin Day 2 medium, add 12.5 mL of basic day 2 medium and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Activin Day 3 medium (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03T	Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 3 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL NEAA, and 10 mL of 2% serum. When preparing Activin Day 3 medium, add 12.5 mL of basic day 3 and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Goat	Thermo Scientific	A11055	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit	Thermo Scientific	A21206	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 546 Donkey anti-Mouse	Thermo Scientific	A10036	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 647 Donkey anti-Mouse	Thermo Scientific	A31571	1:500 dilution (Secondary antibody)
Base mold	Fisher	22-363-552	N/A
Basic gut medium (advanced DMEM)	Gibco	12491015	When preparing Basic gut medium, add 500 mL of DMEM, 500 mL of N2 (Gibco 17-502-048), 500 mL of B27 (Gibco), 500 mL of L-Glutamine to get 2 mM L-Glutamine (Corning A2916801), 5 mL of 100 U/mL Penicillin-Streptomycin (Gibco 15-140-122), and 7.5 mL of  1 M HEPES to get 15 mM HEPES.  The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Biorad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Biorad	N/A	Other qRT-PCR systems can be used.
Cell Recovery Solution	Corning	354253	ECM-degrading solution
CHIR99021	Reprocell	4000410	Reconstitute by adding 2.15 mL of DMSO at 10 mM. Prepare 50 µL aliquots and store at -20 °C.  Store powder at 4 °C, protected from light.
CTRL HIO patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium and 100 ng/mL EGF.
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	1:100 dilution (Secondary antibody)
DE monolayer	N/A	N/A	Monolayer was generated in prior steps (Section 4.4).
Dispase	Gibco	17105041	Resuspend lyophilized powder in Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) to a 1 mg/mL final concentration. Filter the solution for sterilization by vacuuming using a Millipore filter sterilization tube. Make 10 mL aliquots (1 mg/mL) and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use.
EGF	Thermo Scientific	236-EG-01M	When preparing 100 ng/mL EGF reconstitute 500 µg/mL in sterile PBS. Next add 2 mL of sterile PBS to 1 mg EGF and make 500 µg/mL EGF solution. Aliquot 100 µL of EGF in 20 tubes.
Fisherbrand 6 cm Petri Dishes with Clear Lid	Fisher	FB0875713A	N/A
Fisherbrand Cell Lifter	Fisher	08-100-240	N/A
Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials with Closures Attached	Fisher	03-338B	N/A
Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipette	Fisher	13-678-2D0	N/A
Fluoromount G Slide Mounting Medium	VWR	100241-874	N/A
Gibco advanced DMEM	Gibco	12-491-023	N/A
Goat anti-E-Cadherin	R&D systems	AF648	1:400 dilution (Primary antibody)
Goat anti-SOX17	R&D systems	AF1924	1:500 dilution (Primary antibody)
HCOs patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL BMP2. When preparing BMP2, add 1 mL of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to BMP2 vials (100 µg). Aliquot 25 µL of BMP4 solution in 4 tubes.  The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	N/A
Human Pluripotent Stem Cells (hPSC)	Pluripotent Stem Cell Facility	N/A	Cells seeded in a Matrigel coated 24-well plate (Thermo Scientific 73520-906).
Ice-cold 4% Paraformaldehyde solution (PFA)	N/A	N/A	N/A
Ice-cold Phosphate Buffered Saline (PBS)	N/A	N/A	The pH must be 7.4.
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	101098-065	N/A
Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)	Pluripotent Stem Cell Facility (Cincinnati Children's Hospital Medical Center)	N/A	Other hESC or iPSC lines can be used, but the protocol needs to be optimized for each cell line.
Leica microtome	N/A	N/A	N/A
LSM 880			confocal microscope
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	N/A
Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	Prepare 4 x Matrigel aliquots which corresponds to volumes sufficient to make enough diluted Matrigel for 4 x 6-well dishes.
Mid-hindgut induction medium (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Nonessential amino acids (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 µM CHIR99021 and 500 ng/mL FGF4. The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Mid-hindgut spheroids	N/A	N/A	N/A
MilliporeSigma Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	MilliporeSigma	SCGP00525	N/A
Mouse anti-CDX2	BioGenex	MU392-UC	1:300 dilution (Primary antibody)
Mouse anti-FOXA2	Abnova/Novus	H00003170-M01	1:500 dilution
mTeSR1 complete growth medium	Stem Cell technologies	85870	Add 100-mL of mTeSR supplement (85870) into one 400-mL mTeSR medium (85870) and aliquot into 50-mL tubes while avoiding contamination. Store at 4°C until use.
Murray's Clear solution (Also known as BABB)	Murray's	N/A	1:2 benzyl benzoate and benzyl alcohol.
NOG HIO patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL NOGGIN (Dispense 25 µg of NOGGIN in 250 µl sterile PBS with 0.1% BSA).
NucleoSpin RNA	Takara	740955.25	Other RNA isolation kits may be used.
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells (Nunc)	Thermo Scientific	73521-004	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells coated with Matrigel	Thermo Scientific	73521-004	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells (Nunc)	Thermo Scientific	73520-906	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells coated with  Matrigel.	Thermo Scientific	73520-906	N/A
Outgrowth medium for HIOs, CTRL HIOs, and HCOs	N/A	N/A	Basic gut medium and 100 ng/mL EGF (Final concentration)
Phosphate Buffer Saline, 0.5% Triton X (PBS-T)	N/A	N/A	N/A
Primers	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT)	N/A	The primers are listed in Table 2 on the protocol.
Rabbit anti-CDX2	Cell Marque	EPR22764Y	1:100 dilution (Primary antibody)
Rabbit anti-SATB2	Cell Marque	EP281	1:100 dilution (Primary antibody)
Recombinant Human BMP-4 Protein	R&D systems	314-BP-010	Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile 4 mM HCl containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Add 4.17 mL HCl solution to 45.83 mL molecular water totaling to 50 mL of 1 M HCl. Then add 200 µL of 1 M HCl to 49.8 mL of molecular grade water totaling to 50 mL of 4 mM HCl. Next add 0.05 g BSA to 50 mL of 4 mM HCl and filter to make sterile. Aliquot sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to 33 microcentrifuge tube totaling and store at -20 °C. Add 100 µl of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to the BMP4 vials (10 µg) to make BMP4 solution at 100 µg/mL.
Recombinant Human FGF-4 Protein	R&D systems	235-F4-01M	Reconstitute at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin. Add 0.05 g of BSA in 50 mL of PBS to make 0.1% BSA. Filter 0.22 µM BSA to sterilize the BSA. Aliquot 10 mL of 0.1% BSA in 5 tubes. Add 1 mg FGF-4 in 10 mL of sterile 0.1% BSA. Aliquot 250 µL into prechilled 40 microcentrifuge tubes and store at -80 °C.
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris	1254	The final concentration is 10 mM (10 mmol/L). Resuspend in DMSO at 10 mM and filter sterilize. Add 3 mL of sterile PBS to each vial. Aliqout 100 µL of ROCK inhibitor in 30 tubes and store at -20 °C.
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Thermo Scientific	11-754-250	N/A
SuperFrost Plus microscope slides
Tissue Tek O.C.T Compound	VWR	25608-930	N/A