Erzeugung, Erhaltung und Charakterisierung von humanen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Darm- und Dickdarm-Organoiden

Zusammenfassung

Hier werden detaillierte Methoden zur Erzeugung, Erhaltung und Charakterisierung von humanen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Dünndarm- und Dickdarm-Organoiden beschrieben. Diese Methoden wurden entwickelt, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern, die Skalierbarkeit zu erweitern und die Arbeitszeit zu verringern, die für die Beschichtung und Passage von Organoiden erforderlich ist.

Zusammenfassung

Die intestinale Regionalspezifizierung beschreibt einen Prozess, durch den definierten Bereichen des sich entwickelnden gastrointestinalen (GI) Trakts eine einzigartige Morphologie und Funktion verliehen wird. Die regionale Spezifizierung im Darm wird durch mehrere Entwicklungswege gesteuert, einschließlich des Knochenmorphogenetischen Proteins (BMP). Basierend auf der normalen regionalen Spezifikation wurde eine Methode zur Erzeugung humaner Dickdarmorganoide (HCOs) aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) entwickelt, zu denen auch humane embryonale Stammzellen (hES) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) gehören. Eine dreitägige Induktion des BMP-Signalwegs strukturiert die Tubenkulturen des Mittel-/Hinterdarms ausreichend in spezielle AT-reiche sequenzbindende Protein 2 (SATB2)-exprimierende HCOs, die alle wichtigen Epithelzelltypen enthalten, die im menschlichen Dickdarm vorkommen, sowie in sich mitentwickelnden mesenchymalen Zellen. Das Weglassen von BMP (oder die Zugabe des BMP-Inhibitors NOGGIN) während dieser kritischen Strukturierungsphase führte zur Bildung von humanen Darmorganoiden (HIOs). HIOs und HCOs ähneln morphologisch und molekular dem sich entwickelnden Dünndarm bzw. Dickdarm des Menschen. Trotz des Nutzens von HIOs und HCOs für die Untersuchung der menschlichen Darmentwicklung ist die Generierung von HIOs und HCOs eine Herausforderung. In diesem Artikel werden Methoden zur Generierung, Pflege und Charakterisierung von HIOs und HCOs vorgestellt. Darüber hinaus werden die kritischen Schritte im Protokoll und Empfehlungen zur Problembehandlung bereitgestellt.

Einleitung

Die Untersuchung der menschlichen Dickdarmentwicklung ist aufgrund von Einschränkungen bei der Verwendung von menschlichem fötalem Gewebe schwierig. Tiermodelle waren von unschätzbarem Wert und wurden in der Vergangenheit für genetische Ansätze bei Mäusen verwendet, um die Darmentwicklung zu untersuchen. Unterschiede zwischen der Darmentwicklung von Maus und Mensch schränken jedoch die Anwendbarkeit von Mäusen als Modellsystem ein. Obwohl beispielsweise die Kryptenbildung im Dünndarm und Dickdarm von Mäusen postnatal erfolgt, wird der Mensch mit vollständig ausgebildeten Krypten geboren¹. Darüber hinaus enthalten der menschliche Dünndarm und Dickdarm Zelltypen, die bei Mäusen nicht vorkommen, darunter Motilin (MLN)-exprimierende enteroendokrine Zellen im Dünndarm² und Mucin 5B (MUC5B)-exprimierende Becherzellen im Dickdarm ^3,4. Aus diesem Grund ist es wichtig, ein Zellkultursystem zu haben, das die dynamischen molekularen Ereignisse, die die frühen Stadien der Dickdarmentwicklung definieren, genau modelliert. Daher stellt die Ausrichtung von hPSCs auf die Erzeugung von Zellen mit Dickdarmeigenschaften ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung der menschlichen Dickdarmentwicklung dar.

Es wurden Protokolle^{entwickelt, um} die reproduzierbare 5, synchrone und effiziente Bildung von darmähnlichen⁶ und dickdarmähnlichen Organoiden⁷ aus hPSCs zu erleichtern. Diese Protokolle verwenden ein schrittweises Differenzierungsverfahren, das die Entwicklung des fetalen Darms und Dickdarms nachahmt (Abbildung 1). Zunächst wird ein endgültiges Endoderm aus humanen pluripotenten Stammzellen durch Behandlung mit Activin A, einem Nodal-Mimetikum, erzeugt. Die Exposition des definitiven Endoderms gegenüber hohen Konzentrationen von WNT und Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) induziert die Morphogenese in CDX2⁺ -Sphäroiden der Mittel-/Hinterdarmröhre. Die Sphäroide des Mitteldarms und des Hinterdarms werden dann in die extrazelluläre Matrix (ECM) eingebettet und durch eine vorübergehende Manipulation der BMP-Signalübertragung entweder in HIOs oder HCOs umgewandelt. Die Hemmung der BMP-Signalübertragung mit NOGGIN oder die alleinige Zugabe von Wachstumsmedium führt zur Bildung von HIOs, die dem menschlichen proximalen Dünndarm ähneln.

Durch die Aktivierung des BMP-Signalwegs mit BMP2 werden Sphäroide im Mittel-/Hinterdarm zu HCOs strukturiert, die die Musterbildung im Epithel und Mesenchym beibehalten⁷. HCOs enthalten mit Dickdarm angereicherte, MUC5B-exprimierende Becherzellen und sind in der Lage, dickdarmspezifische insulinähnliche 5 (INSL5)-exprimierende enteroendokrine Zellen zu erzeugen. Isoliertes Mesenchym aus HCOs exprimiert die Homöobox A13 (HOXA13) und HOXD13, die auch im primären Dickdarmmesenchym des Menschen exprimiert^{werden 8}. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Schritt der Musterung an den Tagen 7-10 des Differenzierungsprotokolls stattfindet. Dieser Zeitraum von drei Tagen reicht aus, um eine Dickdarmmusterbildung zu induzieren, die nach längerer In-vitro-Kultur aufrechterhalten wird.

Die im Folgenden beschriebenen Protokolle richten sich an Forscher, die mit der feederfreien hPSC-Kultur vertraut sind. Für Forscher, die mit dieser Art von hPS-Kultur nicht vertraut sind, empfiehlt sich eine Schulung zu hPSCs, wie sie von Stem Cell Technologies oder der Pluripotent Stem Cell Facility (PSCF) am Cincinnati Children's Hospital angeboten wird. Die Qualität der Ausgangs-hPSCs ist entscheidend und kann sich auf alle nachgelagerten Schritte auswirken. Das folgende Protokoll beginnt mit hPSCs, die 4 Tage lang gezüchtet wurden und bereit sind, sich zu teilen.

Protokoll

1. Erzeugung von menschlichen Darm- und Dickdarmorganoiden

1. Vorbereiten von ECM-beschichteten Platten
   1. Geben Sie 50 mL kaltes DMEM-Medium in ein konisches 50-ml-Röhrchen.
   2. Ein Aliquot von 4x hESC-qualifiziertem ECM (siehe Materialtabelle) aus dem -80 °C Gefrierschrank nehmen und auf Eis auftauen.
      HINWEIS: Beziehen Sie sich auf das Analysezertifikat des Produkts, um das Volumen des ESC-qualifizierten ECM zu bestimmen, das für die Erstellung eines 4-fachen Materials erforderlich ist.
   3. Wenn die hESC-qualifizierte ECM nicht vollständig aufgetaut ist, entnehmen Sie 750 μl DMEM aus dem konischen 50-ml-Röhrchen und mischen Sie es mit der ECM.
   4. Übertragen Sie das DMEM/hESC-qualifizierte ECM-Gemisch mit DMEM in das konische 50-ml-Röhrchen und mischen Sie es gut. Geben Sie 0,5 ml pro Vertiefung in jede von 4 x 24-Well-Zellkulturplatten.
   5. Schütteln Sie die Platten, um die ECM gleichmäßig in der Vertiefung zu verteilen und sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist. Versiegeln Sie die ECM-beschichteten Platten mit Parafilm und lassen Sie sie mindestens 1 h bei Raumtemperatur in einer Biosicherheitswerkbank liegen. Lagern Sie ECM-beschichtete Platten bis zu 2 Wochen oder bis zur Verwendung bei 4 °C.
2. hPSCs einzellige Beschichtung
   1. Legen Sie eine ECM-beschichtete 24-Well-Platte für 30 Minuten in eine Biosicherheitswerkbank, damit sie Raumtemperatur erreicht.
   2. Legen Sie das mTeSR1 Komplettmedium, die Zellablösungslösung und das fortschrittliche DMEM in ein 37 °C heißes Wasserbad und lassen Sie sie 30 Minuten lang aufwärmen.
   3. Stellen Sie sicher, dass hPS-Zellen zu mindestens 85 % mit minimaler Differenzierung konfluent sind. Entfernen Sie bei Bedarf alle differenzierten Zellen.
   4. Bereiten Sie das Beschichtungsmedium in einem konischen 50-ml-Röhrchen wie folgt vor: 13 ml mTeSR1 und 13 μl 10 mM Y-27632 Rho-assoziierter Proteinkinase (ROCK)-Inhibitor.
      HINWEIS: Y-27632 hemmt Anoikis und erhöht das Überleben einzelner Zellen.
   5. Um Zellen aus einer 6-Well-Platte zu entnehmen, aspirieren Sie das Medium von 3 auf 4 Wells und waschen Sie es einmal mit 2 ml fortschrittlichem DMEM pro Well.
   6. Aspirieren Sie das fortschrittliche DMEM und geben Sie 1 ml der Zelldissoziationslösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte 5-7 Minuten lang in einem Inkubator mit 5 % CO_{2 und} 37 °C. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen in Suspension befinden.
   7. Dissoziieren Sie alle verbleibenden Zellklumpen, indem Sie mit einer 5-ml-Pipette 4-5 Mal auf und ab pipettieren.
   8. Geben Sie 2 ml fortschrittliches DMEM in jede Vertiefung, pipettieren Sie vorsichtig 4-5 Mal auf und ab und geben Sie es in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Schleudern Sie die Zellen bei 300 × g für 3 min bei Raumtemperatur herunter.
   9. Das Medium wird aus dem Röhrchen aspiriert, ohne das Zellpellet zu aspirieren, und es werden 6 ml des vorbereiteten Mediums mTeSR1 plus ROCK-Inhibitor hinzugefügt. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie 3-4 Mal auf und ab pipettieren und dann die Suspension auf den Rest des mTeSR1/ROCK-Inhibitormediums im 50-ml-Röhrchen übertragen. Resuspendieren Sie 4-5 Mal kräftig und zählen Sie die Zellen mit einem Hämazytometer.
   10. Aspirieren Sie die EZM aus der 24-Well-Platte, kurz bevor Sie die Zellen plattieren. Resuspendieren Sie die Zellen erneut, indem Sie 2-3 Mal auf und ab pipettieren und 0,5 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung geben.
       HINWEIS: Die optimale Beschichtungsdichte muss vom Experimentator bestimmt werden. Hier liegt die optimale Zellzahl bei 80.000-200.000 Zellen pro Well.
   11. Schütteln Sie die Platte vorsichtig 3 Mal im Uhrzeigersinn, 3 Mal gegen den Uhrzeigersinn, 3 Mal vorwärts und rückwärts und 3 Mal von Seite zu Seite, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
   12. Die Platte in einen 37 °C, 5 % CO₂ -Inkubator geben und 24 h inkubieren.
       HINWEIS: Stören Sie die Platte in den ersten Stunden nicht, um eine ordnungsgemäße Verteilung der Zellen in den Vertiefungen zu gewährleisten.
   13. Nach 24 Stunden (Abbildung 2A) aspirieren Sie das verbrauchte Medium, fügen Sie 0,5 ml mTeSR1 pro Vertiefung hinzu, inkubieren Sie erneut bei 37 °C und 5 % CO₂ für 24 Stunden (Abbildung 2B) und fahren Sie dann mit dem nächsten Schritt fort.
3. Unterscheidung des definitiven Endoderms (DE) von hPS-Zellen
   1. In ein konisches 15-ml-Röhrchen geben Sie 13 ml Activin Day 1 Medium (siehe Materialtabelle), 13 μl 100 μg/ml Activin A und 1,95 μl 100 μg/ml BMP4. Erwärmen Sie das Medium in einem 37 °C warmen Wasserbad.
   2. Aspirieren Sie das mTeSR1-Medium aus der 24-Well-Platte und fügen Sie 0,5 ml Activin Day 1 Medium pro Well hinzu. Stellen Sie die Platte in einen Inkubator mit 37 °C und 5 % CO₂ und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang. Überprüfen Sie die Zellen nach 24 h.
      HINWEIS: Ein ausgedehnter Zelltod sollte offensichtlich sein, wie in Abbildung 2C dargestellt. Obwohl die Monoschicht spärlich erscheint, haben sich die Zellkolonien ausgedehnt.
   3. Bereiten Sie das Activin Day 2 Complete Medium vor, indem Sie 12,5 μl 100 μg/ml Activin A in 12,5 mL Activin Day 2 Medium in einem konischen 15 mL Röhrchen hinzufügen. Legen Sie den Schlauch in ein 37 °C heißes Wasserbad.
   4. Nehmen Sie die 24-Well-Differenzierungsplatte aus dem CO_{2 -} Inkubator und entfernen Sie das verbrauchte Medium. Geben Sie 0,5 ml vorgewärmtes Activin Day 2 Medium pro Vertiefung ab und stellen Sie die Platte für 24 Stunden wieder in den CO₂ -Inkubator.
      HINWEIS: Bei der Abgabe des Mediums ist Vorsicht geboten. Geben Sie das Medium nicht direkt in die Mitte der Vertiefung, da sich dadurch Zellen in der Monoschicht ablösen. Geben Sie das Medium vorsichtig an der Seite der Vertiefung ab. Am nächsten Tag bildet sich eine Monoschicht aus Zellen mit vernachlässigbarem Zelltod. Die Zellen sollten nun zu ~90 bis 95 % konfluent sein (Abbildung 2D).
   5. Bereiten Sie das Activin Tag 3 Komplettmedium vor, indem Sie 12,5 μl 100 μg/ml Activin A in 12,5 ml Activin Tag 3 Medium in einem konischen 15-ml-Röhrchen hinzufügen. Legen Sie den Schlauch in ein 37 °C heißes Wasserbad.
   6. Entfernen Sie das verbrauchte Medium und geben Sie 0,5 ml Activin Day 3 Medium pro Vertiefung ab.
      HINWEIS: Bei der Abgabe des Mediums ist Vorsicht geboten. Geben Sie das Medium nicht direkt in die Mitte der Vertiefung ab, da sich dadurch Zellen in der Monoschicht ablösen. Geben Sie das Medium vorsichtig an der Seite der Vertiefung ab. Am nächsten Tag sollte die Monoschicht die volle Konfluenz mit wenig bis gar keinem Zelltod in diesem Stadium erreichen. Versuchen Sie nicht, Sphäroide im mittleren Hinterdarm zu erzeugen, wenn die Monoschicht 24 Stunden nach Zugabe von Activin Tag 3 Medium nicht konfluent ist. In Abbildung 2E finden Sie die ideale Morphologie der DE-Monoschicht, bevor Sie mit der Erzeugung von Sphäroiden im mittleren Hinterdarm fortfahren.
   7. Durchführung einer Immunfluoreszenzfärbung (IF) der Monoschicht für die Expression des Forkhead-Box-A2-Proteins (FOXA2) und des geschlechtsbestimmenden Region Y (SRY)-Box-Transkriptionsfaktors 17 (SOX17) zur Optimierung der DE-Differenzierung.
4. Differenzierung von DE in Sphäroide des mittleren Hinterdarms
   1. Geben Sie in ein konisches 50-ml-Röhrchen 25 mL Induktionsmedium für den mittleren Hinterdarm mit FGF4 (ohne CHIR99021) und legen Sie es für 30 Minuten in ein 37 °C warmes Wasserbad.
   2. Um das komplette Induktionsmedium für den mittleren Hinterdarm herzustellen, fügen Sie 7,5 μl CHIR99021 hinzu, nachdem das Medium erwärmt ist.
   3. Entfernen Sie das verbrauchte Medium, geben Sie 0,5 ml Induktionsmedium für den mittleren Hinterdarm pro Vertiefung ab und inkubieren Sie es 24 h lang bei 37 °C, 5 % CO₂ .
   4. Nachdem am nächsten Tag eine Kondensation der Zellen innerhalb der Monoschicht stattgefunden hat (Abbildung 3A), ersetzen Sie das verbrauchte Medium durch frisches Induktionsmedium aus dem mittleren Hinterdarm und stellen Sie die Platte für 24 Stunden wieder in einen 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO₂ .
      HINWEIS: Tubuläre Strukturen machen sich nach 48 Stunden Induktion im mittleren Hinterdarm bemerkbar, wie in Abbildung 3B gezeigt. Die Sphäroide im mittleren Hinterdarm beginnen am Tag 3 von der Monoschicht abzuknospen, wie in Abbildung 3C dargestellt.
   5. Um zu vermeiden, dass die schwimmenden Sphäroide beim Wechseln des Mediums verworfen werden, geben Sie das alte Medium in ein 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie es 1 Minute lang bei 300 × g . Resuspendieren Sie die Sphäroide in 12,5 ml frischem Induktionsmedium für den mittleren Hinterdarm, geben Sie 0,5 ml pro Vertiefung in dieselbe 24-Well-Platte und inkubieren Sie bei 37 °C 5 % CO₂ für 24 Stunden.
   6. Ernten Sie an Tag 4 der Induktion des Hinterdarms (Abbildung 3D) schwimmende Sphäroide aus den Plattenvertiefungen, indem Sie das Medium in ein 15-ml-Röhrchen sammeln, gefolgt von einer Zentrifugation bei 300 × g für 1 min. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt zur Einbettung von Sphäroiden im mittleren Hinterdarm in die ECM fort.
5. Plattierung und Strukturierung von Sphäroiden des Mittel-/Hinterdarms in der ECM
   1. Tauen Sie die ECM-Basalmembranmatrix vor der Einbettung über Nacht bei 4 °C auf.
      HINWEIS: Dieses ECM unterscheidet sich vom hESC-qualifizierten ECM. Die ECM sollte auf Eis gelegt werden, und das entsprechende Volumen der ECM kann in vorgekühlte 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis aliquotiert werden. Tabelle 1 enthält Informationen zum ECM-Volume. Stellen Sie sicher, dass das Volumen der ECM mindestens 75 % in dem Tröpfchen beträgt, in das die Sphäroide eingebettet werden.
   2. Erwärmen Sie eine 24-Well-Platte in einem 37 °C heißen Inkubator.
   3. Sammeln Sie die schwimmenden Sphäroide aus allen 24-Wells mit einer 1000-μl-Pipette und übertragen Sie sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Die Sphäroide bei 300 × g 1 min bei Raumtemperatur einschleudern. Saugen Sie den größten Teil des Mediums an, lassen Sie jedoch das für die Beschichtung erforderliche Volumen (Tabelle 1).
   4. Bereiten Sie die Pipettenspitzen für 1000 μl und 200 μl vor, indem Sie die Enden abschneiden. Nehmen Sie die vorgewärmte 24-Well-Platte heraus.
   5. Mischen Sie die schwimmenden Sphäroide, übertragen Sie das entsprechende Volumen in das auf Eis gestellte EZM-Röhrchen und resuspendieren Sie dann die Sphäroide und die EZM durch Pipettieren, um sie gut zu mischen.
   6. Nehmen Sie 65 μl der Mischung aus Sphäroi und ECM mit den abgeschnittenen 200-μl-Pipettenspitzen und laden Sie sie in die Mitte jeder Vertiefung in die 24-Well-Platte. Um sicherzustellen, dass ein gutes ECM-Tröpfchen gebildet wird, heben Sie die Pipette vorsichtig und langsam an, während die Mischung abgegeben wird.
      HINWEIS: Platten Sie 30-100 Sphäroide pro Vertiefung an.
   7. Schieben Sie die Platte vorsichtig in einen 37 °C mit 5 % CO₂ -Inkubator und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang.
   8. Drehen Sie die Platte auf den Kopf und inkubieren Sie sie 15-25 Minuten lang, was den ECM-Tröpfchen hilft, eine kuppelartige Struktur zu erhalten.
   9. Bereiten Sie während der Inkubation das benötigte Medium vor und erwärmen Sie es. Sobald die ECM verfestigt ist, fügen Sie 0,5 ml HIO- oder HCO-Strukturierungsmedium in jede Vertiefung hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C, 5 % CO₂. In Abbildung 3E finden Sie ein Bild von Sphäroiden in der ECM.
   10. Kultivieren Sie die Sphäroide 3 Tage lang im Strukturierungsmedium.
   11. Wechseln Sie nach 3 Tagen das HIO- oder HCO-Strukturierungsmedium auf normales Wachstumsmedium und inkubieren Sie bei 37 °C, 5% CO₂.
       HINWEIS: Bei den Organoiden zu diesem Zeitpunkt (Tag 10) handelt es sich um Organoide im Frühstadium. Basierend auf dem Projektziel können einige Organoide im Frühstadium für die frühe Strukturierungsanalyse verwendet werden, wie in Abschnitt 2 beschrieben.
6. Auswachsen und Passieren von menschlichen Darm- und Dickdarmorganoiden
   1. Wechseln Sie nach dem 10. Tag das Wachstumsmedium alle 3 Tage.
      HINWEIS: Abhängig von der Beschichtungsdichte und dem Wachstum der Organoide können häufigere Medienwechsel erforderlich sein. Der Wechsel des Mediums sollte durchgeführt werden, bevor das Phenolrot (pH-Indikator) im Medium gelb wird.
   2. Inkubieren Sie die Organoide bis zum 21. Tag (Abbildung 3F).
      HINWEIS: Die BMP2-Behandlung führt zu einer reduzierten Anzahl von Organoiden (~3-mal weniger als HIOs), die aus Sphäroiden wachsen. Daher muss eine größere Anzahl von Sphäroiden für die Erzeugung von HCOs plattiert werden.
7. Spaltung der Organoide am Tag 21
   1. Untersuchen Sie die Organoide.
      HINWEIS: Die Organoide müssen an Tag 21 gespalten werden, da die EZM an Tag 21 aufgrund des Wachstums und der Expansion der Organoide fast abgebaut ist.
   2. Bereiten Sie die Pipettenspitzen mit einem Fassungsvermögen von 1000 μl und 200 μl vor, indem Sie die Enden abschneiden.
   3. Erwärmen Sie eine 24-Well-Nunc-Platte in einem 37 °C heißen Inkubator.
   4. Aliquotieren Sie das entsprechende Volumen ECM in die vorgekühlten 1,5-ml-Röhrchen (Tabelle 1).
   5. Kratzen Sie das EZM-Tröpfchen mit den Organoiden vorsichtig mit einer 1000 μL Pipettenspitze ab und pipettieren Sie die Mischung mehrmals auf und ab, um die EZM aufzubrechen.
   6. Übertragen Sie das Gemisch in eine 60 mm Petrischale und überprüfen Sie die Organoide unter einem Mikroskop. Trennen Sie die Organoide gegebenenfalls mit einer sterilen Pinzette voneinander. Achten Sie darauf, dass durch die Trennung das Epithel der Organoide nicht beschädigt wird.
   7. Die Organoide werden in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt und 30 s lang bei 300 × g zentrifugiert. Aspirieren Sie den Überstand und lassen Sie ~1 ml Medium im Röhrchen.
      HINWEIS: Die Lautstärke des Mediums kann je nach Zweck des Experiments geändert werden. Werden mehr Organoide pro EZM-Tröpfchen benötigt, kann das mittlere Volumen verringert werden. Werden jedoch weniger Organoide benötigt, kann das mittlere Volumen erhöht werden.
   8. Mischen Sie die Organoide gut, übertragen Sie das entsprechende Volumen in das auf Eis gestellte EZM-Röhrchen und resuspendieren Sie dann die Organoide und die EZM durch Pipettieren, um sie gut zu mischen.
   9. Geben Sie 65 μl der Mischung aus Sphäroi und ECM mit den abgeschnittenen 200-μl-Pipettenspitzen in die Mitte jeder Vertiefung der 24-Well-Platte.
      HINWEIS: Es ist wichtig, während des Pipettierens zuerst die Organoide und dann die EZM aufzunehmen. Während der Abgabe des Gemisches befinden sich die Organoide also an der Spitze des EZM-Tröpfchens.
   10. Stellen Sie die Platte für 5 min in einen 37 °C, 5 % CO₂ -Inkubator.
   11. Drehen Sie die Platte für weitere 15-25 Minuten auf den Kopf, damit die ECM-Tröpfchen eine kuppelartige Struktur erhalten.
   12. Geben Sie 0,5 ml HIO/HCO-Auswuchsmedium in jede Vertiefung und inkubieren Sie bei 37 °C, 5 % CO₂.
       HINWEIS: Das Auswuchsmedium ist sowohl für HIOs als auch für HCOs nach der Musterung gleich.
   13. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage bis zum 35. Tag (Abbildung 3G).

2. Überprüfung der Strukturierung von Organoiden durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion der Reverse-Transkription (RT-qPCR)

1. Bereiten Sie vor der Entnahme von RNA 1x RNA-Lysepuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
2. Entsorgen Sie das verbrauchte Medium und geben Sie 350 μl Lysepuffer in jede Vertiefung der 24-Well-Platte. Lysieren Sie die Organoide, indem Sie mit einer 1-ml-Pipette auf und ab pipettieren. Zur besseren Lyse 5 s kurz bei maximaler Geschwindigkeit vortexen.
3. Bewahren Sie alle Proben bei -80 °C auf, bis sie für die RNA-Extraktion bereit sind. Sobald sie fertig sind, nehmen Sie die RNA-Proben aus dem -80 °C Gefrierschrank und tauen Sie sie 10 Minuten lang auf Eis auf. Wirbeln Sie die Röhrchen 10-15 Minuten lang bei Raumtemperatur kräftig vor, um eine vollständige Lyse der Proben zu gewährleisten.
4. Legen Sie die Proben erneut auf Eis und fahren Sie mit der RNA-Extraktion gemäß den Anweisungen des Herstellers fort. Übertragen Sie die RNA-Proben in einen -80 °C-Gefrierschrank, wenn Sie nicht bereit sind, mit dem nächsten Schritt fortzufahren.
5. Führen Sie RNA-Extraktion, DNAse-Behandlung, cDNA-Synthese und RT-qPCR mit Standardmethodik durch. In Tabelle 2 finden Sie eine Liste der Primernamen und -sequenzen.

3. Überprüfung der Strukturierung von Organoiden durch Immunfluoreszenz

1. Entnahme und Fixierung von Organoiden
   1. Aspirieren Sie HIO- oder HCO-Medium aus den entsprechenden Vertiefungen und geben Sie 1 ml eiskalte, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in jede Vertiefung. Dissoziieren Sie die Organoide mit einer geschnittenen 200-μl-Pipettenspitze von der EZM. Pipettieren Sie auf und ab, um große Teile der EZM von den Organoiden zu trennen.
   2. Übertragen Sie die Organoide in ein konisches 15-ml-Röhrchen und füllen Sie den Rest des Röhrchens mit eiskaltem PBS und mischen Sie es vorsichtig, indem Sie das Röhrchen umdrehen. Lassen Sie die Organoide durch die Schwerkraft absetzen und aspirieren Sie das PBS.
      HINWEIS: Wenn sich die Organoide nicht durch die Schwerkraft absetzen, zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 300 × g .
   3. Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie 1 ml eiskalte ECM-abbauende Lösung hinzu. Halten Sie das Rohr 10-15 Minuten auf Eis auf einer rotierenden Plattform unter leichtem Schütteln.
      HINWEIS: Kippen Sie das Röhrchen in einem Winkel von 45°, um eine ordnungsgemäße Mischung der Organoide und der Zellwiederherstellungslösung zu ermöglichen. Nach 10-15 Minuten sollten sich die Organoide am Boden des Röhrchens absetzen, was auf den vollständigen Verdau der EZM hinweist.
   4. Geben Sie kaltes PBS bis zu 15 ml in das Röhrchen; Gut mischen, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen. Wenn sich die Organoide am Boden des Röhrchens absetzen, aspirieren Sie das PBS und fügen Sie 1 ml vorgekühltes 4%iges Paraformaldehyd hinzu, um die Organoide zu fixieren. Inkubieren Sie die Organoide mit 4% Paraformaldehyd 1 h auf Eis.
   5. Füllen Sie den Rest des Röhrchens mit eiskaltem PBS und legen Sie es über Nacht waagerecht bei 4 °C auf eine Schaukelplattform. Entsorgen Sie am nächsten Tag das Paraformaldehyd/PBS in dem angegebenen Abfallbehälter und waschen Sie es einmal mit 15 mL eiskaltem PBS, wie in Schritt 3.1.2 beschrieben.
   6. Aspirieren Sie das PBS und füllen Sie das Röhrchen mit 30% Saccharose in PBS. Stellen Sie das Rohr über Nacht waagerecht bei 4 °C auf eine Schaukelplattform.
   7. Am nächsten Tag werden die Organoide in ein 7 mm x 7 mm x 5 mm großes Basismodell mit OCT-Medium eingebettet und mit einem Trockeneis-/Ethanolbad schockgefroren.
   8. Trocknen Sie die Blöcke mit Labortüchern, wickeln Sie sie in ein Papiertuch und bewahren Sie sie über Nacht in einem -80 °C warmen Gefrierschrank auf. Am nächsten Tag schneiden Sie 5 μm große Schnitte mit einem Kryostaten auf Objektträger. Lagern Sie die Objektträger bei -80 °C.
2. Immunfluoreszenzfärbung der Organoide
   1. Verarbeiten Sie die Objektträger aus dem -80 °C-Gefrierschrank und führen Sie die IF-Färbung mit Standardprotokollen durch.
   2. Kleben Sie Deckgläser auf die Objektträger und trocknen Sie sie bei Raumtemperatur mindestens 2 h oder über Nacht vor der Bildgebung lichtgeschützt.
   3. Bilden Sie die Objektträger mit einem 25-fach-Objektiv eines konfokalen Mikroskops ab.

Ergebnisse

Die erfolgreiche Erzeugung von Sphäroiden während der Induktionsphase des Mittel-/Hinterdarms ist ein Hinweis auf eine erfolgreiche Strukturierung. Führen Sie eine IF-Färbung für CDX2 auf schwebenden Sphäroiden und auf der Monoschicht durch, um zu bestätigen, dass die Strukturierung korrekt ist. Obwohl die Färbung im definitiven Endodermstadium (DE) auf die Wirksamkeit der DE-Induktion hinweisen kann, ist die Erzeugung von Sphäroiden ohne effiziente DE-Induktion nicht möglich. ...

Diskussion

Die Unterscheidung von hPSCs in HIOs und HCOs ist ein komplexer Prozess, der bei jedem Schritt Qualitätskontrollen erfordert. Die Ausgangs-hPSCs müssen eine minimale Differenzierung aufweisen, bevor sie mit der Differenzierung in DE beginnen. Die Optimierung der Dichte von hPSCs, die für die DE-Differenzierung plattiert werden, ist entscheidend für den Erfolg des Protokolls. Um die Qualität der DE-Differenzierung sicherzustellen, führen Sie IF für FOXA2 und SOX17 durch, um die Eff...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Bovine serum albumin (BSA) solution	N/A	N/A	N/A
15 mL Corning tube	Falcon	21008-918	N/A
30% Sucrose	N/A	N/A	Made in PBS.
5% Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Lab	017-000-121	N/A
50 mL Corning tube	Falcon	21008-951	N/A
Accutase	Thermo Scientific	A1110501	Cell detachment solution; aliquot 5 mL of Accutase into 10 mL tubes totaling 20 tubes and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use.
Activin A	Cell guidance Systems	GFH6-100x10	Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Aliquot 38 µL of Activin A into prechilled microcentrifuge tubes and store at -80 °C (Tubes expire 12 months from date of receipt).
Activin Day 1 medium (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Use nonessential amino acids (NEAA, Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 1 medium: 500 mL of RPMI 1640 and 500 mL of NEAA. When preparing Activin Day 1 medium, add 13 mL of basic day 1 medium, 13 µl of Activin A (100 µg/mL), and 2 µl of BMP4 (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Activin Day 2 medium (RPMI 1640, 0.2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03T	Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 2 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL of NEAA, and 1 mL of 0.2% serum. When preparing Activin Day 2 medium, add 12.5 mL of basic day 2 medium and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Activin Day 3 medium (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03T	Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 3 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL NEAA, and 10 mL of 2% serum. When preparing Activin Day 3 medium, add 12.5 mL of basic day 3 and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Goat	Thermo Scientific	A11055	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit	Thermo Scientific	A21206	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 546 Donkey anti-Mouse	Thermo Scientific	A10036	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 647 Donkey anti-Mouse	Thermo Scientific	A31571	1:500 dilution (Secondary antibody)
Base mold	Fisher	22-363-552	N/A
Basic gut medium (advanced DMEM)	Gibco	12491015	When preparing Basic gut medium, add 500 mL of DMEM, 500 mL of N2 (Gibco 17-502-048), 500 mL of B27 (Gibco), 500 mL of L-Glutamine to get 2 mM L-Glutamine (Corning A2916801), 5 mL of 100 U/mL Penicillin-Streptomycin (Gibco 15-140-122), and 7.5 mL of  1 M HEPES to get 15 mM HEPES.  The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Biorad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Biorad	N/A	Other qRT-PCR systems can be used.
Cell Recovery Solution	Corning	354253	ECM-degrading solution
CHIR99021	Reprocell	4000410	Reconstitute by adding 2.15 mL of DMSO at 10 mM. Prepare 50 µL aliquots and store at -20 °C.  Store powder at 4 °C, protected from light.
CTRL HIO patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium and 100 ng/mL EGF.
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	1:100 dilution (Secondary antibody)
DE monolayer	N/A	N/A	Monolayer was generated in prior steps (Section 4.4).
Dispase	Gibco	17105041	Resuspend lyophilized powder in Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) to a 1 mg/mL final concentration. Filter the solution for sterilization by vacuuming using a Millipore filter sterilization tube. Make 10 mL aliquots (1 mg/mL) and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use.
EGF	Thermo Scientific	236-EG-01M	When preparing 100 ng/mL EGF reconstitute 500 µg/mL in sterile PBS. Next add 2 mL of sterile PBS to 1 mg EGF and make 500 µg/mL EGF solution. Aliquot 100 µL of EGF in 20 tubes.
Fisherbrand 6 cm Petri Dishes with Clear Lid	Fisher	FB0875713A	N/A
Fisherbrand Cell Lifter	Fisher	08-100-240	N/A
Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials with Closures Attached	Fisher	03-338B	N/A
Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipette	Fisher	13-678-2D0	N/A
Fluoromount G Slide Mounting Medium	VWR	100241-874	N/A
Gibco advanced DMEM	Gibco	12-491-023	N/A
Goat anti-E-Cadherin	R&D systems	AF648	1:400 dilution (Primary antibody)
Goat anti-SOX17	R&D systems	AF1924	1:500 dilution (Primary antibody)
HCOs patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL BMP2. When preparing BMP2, add 1 mL of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to BMP2 vials (100 µg). Aliquot 25 µL of BMP4 solution in 4 tubes.  The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	N/A
Human Pluripotent Stem Cells (hPSC)	Pluripotent Stem Cell Facility	N/A	Cells seeded in a Matrigel coated 24-well plate (Thermo Scientific 73520-906).
Ice-cold 4% Paraformaldehyde solution (PFA)	N/A	N/A	N/A
Ice-cold Phosphate Buffered Saline (PBS)	N/A	N/A	The pH must be 7.4.
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	101098-065	N/A
Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)	Pluripotent Stem Cell Facility (Cincinnati Children's Hospital Medical Center)	N/A	Other hESC or iPSC lines can be used, but the protocol needs to be optimized for each cell line.
Leica microtome	N/A	N/A	N/A
LSM 880			confocal microscope
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	N/A
Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	Prepare 4 x Matrigel aliquots which corresponds to volumes sufficient to make enough diluted Matrigel for 4 x 6-well dishes.
Mid-hindgut induction medium (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Nonessential amino acids (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 µM CHIR99021 and 500 ng/mL FGF4. The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Mid-hindgut spheroids	N/A	N/A	N/A
MilliporeSigma Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	MilliporeSigma	SCGP00525	N/A
Mouse anti-CDX2	BioGenex	MU392-UC	1:300 dilution (Primary antibody)
Mouse anti-FOXA2	Abnova/Novus	H00003170-M01	1:500 dilution
mTeSR1 complete growth medium	Stem Cell technologies	85870	Add 100-mL of mTeSR supplement (85870) into one 400-mL mTeSR medium (85870) and aliquot into 50-mL tubes while avoiding contamination. Store at 4°C until use.
Murray's Clear solution (Also known as BABB)	Murray's	N/A	1:2 benzyl benzoate and benzyl alcohol.
NOG HIO patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL NOGGIN (Dispense 25 µg of NOGGIN in 250 µl sterile PBS with 0.1% BSA).
NucleoSpin RNA	Takara	740955.25	Other RNA isolation kits may be used.
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells (Nunc)	Thermo Scientific	73521-004	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells coated with Matrigel	Thermo Scientific	73521-004	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells (Nunc)	Thermo Scientific	73520-906	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells coated with  Matrigel.	Thermo Scientific	73520-906	N/A
Outgrowth medium for HIOs, CTRL HIOs, and HCOs	N/A	N/A	Basic gut medium and 100 ng/mL EGF (Final concentration)
Phosphate Buffer Saline, 0.5% Triton X (PBS-T)	N/A	N/A	N/A
Primers	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT)	N/A	The primers are listed in Table 2 on the protocol.
Rabbit anti-CDX2	Cell Marque	EPR22764Y	1:100 dilution (Primary antibody)
Rabbit anti-SATB2	Cell Marque	EP281	1:100 dilution (Primary antibody)
Recombinant Human BMP-4 Protein	R&D systems	314-BP-010	Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile 4 mM HCl containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Add 4.17 mL HCl solution to 45.83 mL molecular water totaling to 50 mL of 1 M HCl. Then add 200 µL of 1 M HCl to 49.8 mL of molecular grade water totaling to 50 mL of 4 mM HCl. Next add 0.05 g BSA to 50 mL of 4 mM HCl and filter to make sterile. Aliquot sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to 33 microcentrifuge tube totaling and store at -20 °C. Add 100 µl of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to the BMP4 vials (10 µg) to make BMP4 solution at 100 µg/mL.
Recombinant Human FGF-4 Protein	R&D systems	235-F4-01M	Reconstitute at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin. Add 0.05 g of BSA in 50 mL of PBS to make 0.1% BSA. Filter 0.22 µM BSA to sterilize the BSA. Aliquot 10 mL of 0.1% BSA in 5 tubes. Add 1 mg FGF-4 in 10 mL of sterile 0.1% BSA. Aliquot 250 µL into prechilled 40 microcentrifuge tubes and store at -80 °C.
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris	1254	The final concentration is 10 mM (10 mmol/L). Resuspend in DMSO at 10 mM and filter sterilize. Add 3 mL of sterile PBS to each vial. Aliqout 100 µL of ROCK inhibitor in 30 tubes and store at -20 °C.
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Thermo Scientific	11-754-250	N/A
SuperFrost Plus microscope slides
Tissue Tek O.C.T Compound	VWR	25608-930	N/A