JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе подробно описаны методы получения, поддержания и определения характеристик органоидов тонкого кишечника и толстой кишки, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека. Эти методы предназначены для улучшения воспроизводимости, расширения масштабируемости и сокращения рабочего времени, необходимого для нанесения гальванических покрытий и пропускания органоидов.

Аннотация

Регионарная спецификация кишечника описывает процесс, посредством которого определенным областям развивающегося желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) придается уникальная морфология и функция. Регионарная специфичность в кишечнике обусловлена несколькими путями развития, включая путь костного морфогенетического белка (BMP). На основе нормальной региональной спецификации был разработан метод получения органоидов толстой кишки человека (ГСО) из плюрипотентных стволовых клеток человека (ГПСК), которые включают эмбриональные стволовые клетки человека (ГЭС) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК). Трехдневная индукция передачи сигналов BMP в достаточной степени преобразует культуры средней/задней кишки в специальные HCO, экспрессирующие АТ-богатые последовательно-связывающими белки 2 (SATB2), содержащие все основные типы эпителиальных клеток, присутствующих в толстой кишке человека, а также совместно развивающиеся мезенхимальные клетки. Пропуск BMP (или добавление ингибитора BMP NOGGIN) в течение этого критического периода формирования привел к образованию кишечных органоидов человека (HIO). HIO и HCO морфологически и молекулярно напоминают развивающуюся тонкую и толстую кишку человека соответственно. Несмотря на полезность ГИО и ГКО для изучения развития кишечника человека, создание ГИО и ГКО является сложной задачей. В данной статье представлены методы создания, поддержания и определения характеристик ГИО и ОЦ. Кроме того, в протоколе содержатся критические шаги и рекомендации по устранению неполадок.

Введение

Изучение развития толстой кишки человека затруднено из-за ограничений на использование тканей человеческого плода. Животные модели были бесценны и исторически использовались для генетических подходов на мышах для изучения развития кишечника. Тем не менее, различия между развитием кишечника у мышей и человека ограничивают применимость мышей в качестве модельной системы. Например, хотя формирование крипт в тонком кишечнике и толстой кишке мышей происходит постнатально, люди рождаются с полностью сформированными криптами. Кроме того, тонкая кишка и толстая кишка человека содержат типы клеток, которые не обнаружены у мышей, в том числе энтероэндокринные клетки, экспрессирующие мотилин (MLN) в тонком кишечнике2 и бокаловидные клетки, экспрессирующие муцин 5B (MUC5B) в толстой кишке 3,4. По этой причине важно иметь систему клеточных культур, которая точно моделирует динамические молекулярные события, определяющие ранние стадии развития толстой кишки. Таким образом, направление hPSCs на генерацию клеток с характеристиками толстой кишки обеспечивает мощную модель для изучения развития толстой кишки человека.

Были разработаны протоколы, способствующие воспроизводимому5, синхронному и эффективному образованию кишечноподобных органоидов6 и толстойкишки7 из hPSCs. В этих протоколах используется процедура ступенчатой дифференцировки, которая имитирует развитие кишечника и толстой кишки плода (Рисунок 1). Во-первых, дефинитивная энтодерма создается из плюрипотентных стволовых клеток человека путем лечения активином А, узловым миметиком. Воздействие на дефинитивную энтодерму высоких уровней WNT и фактора роста фибробластов (FGF) индуцирует морфогенез в сфероиды средней/задней кишки CDX2+. Затем сфероиды средней и задней кишки встраиваются во внеклеточный матрикс (ВКМ) и встраиваются либо в HIO, либо в HCO посредством транзиторных манипуляций с передачей сигналов BMP. Ингибирование передачи сигналов BMP с помощью NOGGIN или добавление питательной среды приводит к образованию HIO, которые напоминают проксимальный отдел тонкой кишки человека.

Активируя передачу сигналов BMP с помощью BMP2, сфероиды средней/задней кишки превращаются в HCO, которые сохраняют структурированность в эпителии и мезенхиме7. ГКО содержат обогащенные толстой кишкой, экспрессирующие MUC5B бокаловидные клетки и способны генерировать специфичные для толстой кишки инсулиноподобные 5 (INSL5) энтероэндокринные клетки. Выделенный мезенхим из ГКО экспрессирует гомеобокс A13 (HOXA13) и HOXD13, которые также экспрессируются в первичной мезенхиме толстой кишкичеловека 8. Важно помнить, что этап формирования паттерна происходит в течение 7-10 дней протокола дифференцировки. Этого трехдневного периода достаточно, чтобы вызвать формирование толстой кишки, которое сохраняется после расширенного культивирования in vitro .

Описанные ниже протоколы предназначены для исследователей, которые знакомы с культурой hPSC без питательных веществ. Для исследователей, которые не знакомы с этим типом культуры ПССК, рекомендуется пройти обучающий курс по ПССК, например, предлагаемый Stem Cell Technologies или Pluripotent Stem Cell Facility (PSCF) в Детской больнице Цинциннати. Качество начальных hPSC имеет решающее значение и может повлиять на все последующие этапы. Следующий протокол будет начинаться с hPSCs, которые выращивались в течение 4 дней и готовы к расщеплению.

протокол

1. Генерация органоидов кишечника и толстой кишки человека

  1. Подготовка пластин с покрытием ECM
    1. Добавьте 50 мл холодной среды DMEM в коническую пробирку объемом 50 мл.
    2. Извлеките из морозильной камеры при температуре -80 °C ЭБУ с 4-кратным содержанием ЭБУ (см. Таблицу материалов) и разморозьте на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к сертификату анализа продукта, чтобы определить объем ЭБУ, сертифицированного ESC, необходимый для подготовки 4-кратного запаса.
    3. Если ВКМ, сертифицированный по стандарту hESC, не полностью разморожен, возьмите 750 мкл DMEM из конической пробирки объемом 50 мл и смешайте его с ECM.
    4. Переложите смесь ECM, сертифицированную по стандарту DMEM/hESC, в коническую пробирку объемом 50 мл с DMEM и хорошо перемешайте. Добавьте по 0,5 мл на лунку в каждый из 4 x 24-луночных планшетов для культивирования клеток.
    5. Встряхните пластины, чтобы равномерно распределить ECM по всей лунке, чтобы убедиться, что вся поверхность покрыта. С помощью парапленки запечатайте пластины с покрытием ECM и оставьте их при комнатной температуре в шкафу биобезопасности не менее чем на 1 ч. Храните пластины с покрытием ECM при температуре 4 °C в течение 2 недель или до тех пор, пока они не понадобятся.
  2. ГПСК одноклеточное покрытие
    1. Поместите 24-луночный планшет с покрытием ECM в шкаф биобезопасности на 30 минут, чтобы он нагрелся до комнатной температуры.
    2. Поместите полную среду mTeSR1, раствор для отслойки клеток и усовершенствованный DMEM в водяную баню при температуре 37 °C и дайте им прогреться в течение 30 минут.
    3. Убедитесь, что hPSCs конфлюентны не менее чем на 85% с минимальной дифференцировкой. При необходимости удалите все дифференцированные клетки.
    4. Среду для гальванического покрытия готовят в конической пробирке объемом 50 мл следующим образом: 13 мл mTeSR1 и 13 мкл 10 мл ингибитора Rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK) Y-27632.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Y-27632 ингибирует анойкис и увеличивает выживаемость одиночных клеток.
    5. Чтобы собрать клетки из 6-луночного планшета, аспирируйте среду из 3-4 лунок и промойте один раз 2 мл усовершенствованного DMEM на лунку.
    6. Аспирируйте усовершенствованный DMEM и диспродуцируйте по 1 мл раствора для диссоциации клеток в каждую лунку. Инкубируйте планшет в течение 5-7 минут в инкубаторе с 5%CO2, 37 °C. Проверьте под микроскопом, что клетки находятся во взвешенном состоянии.
    7. Диссоциируйте оставшиеся скопления клеток, пипетируя вверх и вниз 4-5 раз с помощью пипетки объемом 5 мл.
    8. Добавьте по 2 мл усовершенствованного DMEM в каждую лунку, аккуратно пипетируйте вверх и вниз 4-5 раз и переложите в коническую пробирку объемом 15 мл. Раскрутите ячейки при 300 × г в течение 3 мин при комнатной температуре.
    9. Отсадите среду из пробирки, не отсасывая клеточную гранулу, и добавьте 6 мл подготовленной среды mTeSR1 плюс ингибитор ROCK. Аккуратно ресуспендируйте клетки пипетированием вверх и вниз 3-4 раза, а затем перенесите суспензию в оставшуюся среду ингибитора mTeSR1/ROCK внутри пробирки объемом 50 мл. Энергично суспензируйте 4-5 раз и подсчитайте клетки с помощью гемацитометра.
    10. Отсасывайте ВКМ из 24-луночного планшета непосредственно перед нанесением покрытия на клетки. Снова суспендируйте клетки пипетированием вверх и вниз 2-3 раза и дозируйте 0,5 мл клеточной суспензии в каждую лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная плотность покрытия должна быть определена экспериментатором. Здесь оптимальное количество ячеек составляет 80 000-200 000 ячеек на лунку.
    11. Аккуратно покачивайте пластину 3 раза по часовой стрелке, 3 раза против часовой стрелки, 3 раза вперед и назад и 3 раза из стороны в сторону, чтобы равномерно разогнать ячейки.
    12. Перенесите планшет в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2 и инкубируйте в течение 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не тревожьте планшет в течение первых нескольких часов, чтобы обеспечить надлежащее рассеивание ячеек внутри лунок.
    13. Через 24 ч (рис. 2А) аспирируйте отработанную среду, добавьте 0,5 мл в лунку mTeSR1, снова инкубируйте при 37 °С, 5%СО2 в течение 24 ч (рис. 2В), а затем перейдите к следующему этапу.
  3. Дифференциация дефинитивной энтодермы (ДЭ) от ПСК
    1. В коническую пробирку объемом 15 мл добавьте 13 мл среды Activin Day 1 (см. Таблицу материалов), 13 мкл 100 мкг/мл Activin A и 1,95 мкл 100 мкг/мл BMP4. Прогрейте среду на водяной бане при температуре 37 °C.
    2. Отсадите среду mTeSR1 из 24-луночного планшета и добавьте 0,5 мл среды Activin Day 1 на лунку. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C, 5%CO2 и инкубируйте в течение 24 часов. Проверьте клетки через 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обширная гибель клеток должна быть очевидной, как показано на рисунке 2C. Хотя монослой будет казаться разреженным, колонии клеток увеличатся.
    3. Приготовьте готовую среду Activin Day 2, добавив 12,5 мкл 100 мкг/мл Activin A в 12,5 мл среды Activin Day 2 в коническую пробирку объемом 15 мл. Поместите трубку на водяную баню при температуре 37 °C.
    4. Извлеките 24-луночную дифференцировочную пластину из инкубатора CO2 и удалите отработанную среду. Выдайте 0,5 мл предварительно подогретой среды Activin Day 2 на лунку и поместите планшет обратно в инкубатор сCO2 на 24 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность при дозировании среды. Не стоит дозировать среду непосредственно в центре лунки, так как это приведет к отрыву ячеек в монослое. Осторожно выдавите жидкость вниз по стенке лунки. На следующий день образуется монослой клеток с незначительной гибелью клеток. Теперь клетки должны быть слиты на ~90-95% (Рисунок 2D).
    5. Приготовьте готовую среду Activin Day 3, добавив 12,5 мкл 100 мкг/мл Activin A в 12,5 мл среды Activin Day 3 в коническую пробирку объемом 15 мл. Поместите трубку на водяную баню при температуре 37 °C.
    6. Удалите отработанную среду и выдайте 0,5 мл среды Activin Day 3 на лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность при дозировании среды. Не распыляйте среду непосредственно в центр лунки, так как это приведет к отрыву ячеек в монослое. Осторожно выдавите жидкость вниз по стенке лунки. На следующий день монослой должен достичь полного слияния с минимальной гибелью клеток или без нее на этой стадии. Не пытайтесь получить сфероиды средней части задней кишки, если монослой не сливается через 24 ч после добавления среды Activin Day 3. Обратитесь к рисунку 2E для получения идеальной морфологии монослоя DE, прежде чем переходить к генерации сфероидов средней части задней кишки.
    7. Выполняйте иммунофлуоресцентное (ЕСЛИ) окрашивание монослоя для экспрессии белка A2 (FOXA2) и определяющего пол региона Y (SRY) фактора транскрипции 17 (SOX17) при оптимизации дифференцировки DE.
  4. Дифференциация ДЭ в сфероиды средней задней кишки
    1. В коническую пробирку объемом 50 мл добавьте 25 мл индукционной среды средней задней кишки с FGF4 (без CHIR99021) и поместите в водяную баню при температуре 37 °C на 30 минут.
    2. Чтобы приготовить полную среду для индукции средней задней кишки, добавьте 7,5 мкл CHIR99021 после того, как среда нагреется.
    3. Удалите отработанную среду, выдайте 0,5 мл индукционной среды средней задней кишки на лунку и инкубируйте при 37 °C, 5%CO2 в течение 24 ч.
    4. После того, как на следующий день произойдет конденсация клеток внутри монослоя (рис. 3А), замените отработанную среду свежей средой для индукции средней части задней кишки и поместите планшет обратно в инкубатор с температурой 37 °C и 5%CO2 на 24 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трубчатые структуры будут заметны через 48 ч после индукции средней задней кишки, как показано на рисунке 3B. Сфероиды средней задней кишки начнут отпочковываться от монослоя на 3-й день, как показано на рисунке 3C.
    5. Чтобы избежать выброса плавающих сфероидов при смене среды, переложите старую среду в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при давлении 300 × г в течение 1 минуты. Ресуспендируйте сфероиды в 12,5 мл свежей среды для индукции средней части задней кишки, добавьте 0,5 мл на лунку в ту же 24-луночную лунку и инкубируйте при 37 °C, 5%CO2 в течение 24 ч.
    6. На 4-й день индукции задней кишки (рис. 3D) соберите плавающие сфероиды из пластинчатых лунок, собрав среду в пробирку объемом 15 мл, с последующим центрифугированием при 300 × г в течение 1 минуты. Перейдите к следующему этапу по встраиванию сфероидов средней задней кишки в ВКМ.
  5. Гальванизация и структурирование сфероидов средней/задней кишки в ВКМ
    1. Разморозьте матрицу базальной мембраны ECM при 4 °C в течение ночи перед внедрением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот ECM отличается от ECM, сертифицированного hESC. ЭХМ следует положить на лед, и соответствующий объем ЭХМ можно зализовать в предварительно охлажденные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл на льду. Таблица 1 содержит информацию об объеме ECM. Убедитесь, что объем ВКМ составляет не менее 75% в капле, в которую будут внедрены сфероиды.
    2. Прогрейте планшет на 24 лунки в инкубаторе при температуре 37 °C.
    3. Соберите плавающие сфероиды из всех 24 лунок с помощью пипетки объемом 1000 мкл и перенесите их в коническую трубку объемом 15 мл. Раскрутите сфероиды при 300 × г в течение 1 минуты при комнатной температуре. Отсасывайте большую часть среды, но оставляйте объем, необходимый для нанесения покрытия (табл. 1).
    4. Подготовьте наконечники для пипеток объемом 1000 мкл и 200 мкл, обрезав их концы. Выньте предварительно подогретую 24-луночную пластину.
    5. Смешайте плавающие сфероиды, перенесите соответствующий объем в трубку ВКМ, помещенную на лед, а затем повторно суспендируйте сфероиды и ЭКМ с помощью пипетирования, чтобы хорошо их перемешать.
    6. Возьмите 65 мкл смеси сфероидов и ЭХМ с отрезанными 200 мкл наконечниками пипеток и загрузите в центр каждой лунки в 24-луночный планшет. Чтобы убедиться в образовании хорошей капли ECM, осторожно и медленно поднимайте пипетку, пока смесь дозируется.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина 30-100 сфероидов на лунку.
    7. Аккуратно перенесите планшет в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2 и инкубируйте в течение 5 минут.
    8. Переверните тарелку вверх дном и выдерживайте в течение 15-25 минут, что поможет каплям ECM сохранить куполообразную структуру.
    9. Во время инкубации подготовьте необходимую среду и прогрейте ее. После того как ECM затвердеет, добавьте 0,5 мл среды с HIO или HCO-структурой в каждую лунку и инкубируйте при 37 °C, 5%CO2. На рисунке 3E показано изображение сфероидов в ECM.
    10. Культивируйте сфероиды в моделирующей среде в течение 3 дней.
    11. Через 3 дня смените среду с HIO- или HCO-структурой на нормальную среду роста и инкубируйте при 37 °C, 5%CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды в этот момент времени (День 10) являются органоидами на ранних стадиях. В зависимости от цели проекта, некоторые органоиды ранних стадий могут быть использованы для анализа паттернов на ранних стадиях, как подробно описано в разделе 2.
  6. Отрастание и пассирование органоидов кишечника и толстой кишки человека
    1. После 10 дня меняйте питательную среду каждые 3 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от плотности покрытия и роста органоидов может потребоваться более частая смена среды. Изменения среды следует проводить до того, как фенольный красный (показатель pH) в среде станет желтым.
    2. Инкубируйте органоиды до 21-го дня (рисунок 3F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка BMP2 приведет к уменьшению количества органоидов (в ~3 раза меньше, чем у HIO), которые растут из сфероидов. Таким образом, для производства HCO необходимо покрыть большее количество сфероидов.
  7. Расщепление органоидов на 21 день
    1. Осмотрите органоиды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды должны быть разделены на 21-й день, так как к 21-му дню ECM почти разрушается из-за роста и расширения органоидов.
    2. Подготовьте наконечники для пипеток объемом 1000 μл и 200 μл, обрезав их концы.
    3. Прогрейте 24-луночный планшет Nunc в инкубаторе при температуре 37 °C.
    4. Поместите соответствующий объем ЭКМ в предварительно охлажденные пробирки объемом 1,5 мл (Таблица 1).
    5. Аккуратно соскребите каплю ECM с органоидами с помощью наконечника дозатора объемом 1000 мкл и несколько раз попытайтесь разбить ECM.
    6. Переложите смесь в чашку Петри диаметром 60 мм и проверьте органоиды под микроскопом. При необходимости отделите органоиды друг от друга с помощью стерильных щипцов. Следите за тем, чтобы отделение не повредило эпителий органоидов.
    7. Перенесите органоиды в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при давлении 300 × г в течение 30 с. Аспирируйте надосадочную жидкость и оставьте в пробирке ~1 мл среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем среды может быть изменен в зависимости от цели эксперимента. Если требуется больше органоидов на одну каплю ECM, объем среды может быть уменьшен. Однако, если требуется меньше органоидов, объем среды можно увеличить.
    8. Хорошо перемешайте органоиды, перенесите соответствующий объем в трубку ECM, помещенную на лед, а затем повторно суспендируйте органоиды и ECM с помощью пипетирования, чтобы хорошо их перемешать.
    9. Добавьте 65 мкл смеси сфероидов и ECM в центр каждой лунки 24-луночного планшета с помощью отрезанных наконечников пипеток объемом 200 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время пипетирования очень важно сначала брать органоиды, а затем ECM. Таким образом, при дозировании смеси органоиды находятся в верхней части капли ECM.
    10. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C, 5%CO2 на 5 минут.
    11. Переверните пластину вверх дном еще на 15-25 минут, чтобы капли ECM сохранили куполообразную структуру.
    12. Добавьте в каждую лунку по 0,5 мл среды для роста HIO/HCO и инкубируйте при 37 °C, 5%CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда роста одинакова как для ОО, так и для ОГС после формирования паттерна.
    13. Меняйте среду каждые 2-3 дня до 35-го дня (Рисунок 3G).

2. Проверка структурирования органоидов методом количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР)

  1. Перед сбором РНК приготовьте 1x буфер для лизиса РНК, следуя инструкциям производителя.
  2. Выбросьте отработанную среду и добавьте 350 мкл буфера для лизиса в каждую лунку 24-луночного планшета. Лизируйте органоиды путем пипетирования вверх и вниз с помощью пипетки объемом 1 мл. Для лучшего лизиса кратковременно делайте вихрь на максимальной скорости в течение 5 с.
  3. Храните все образцы при температуре -80 °C до тех пор, пока они не будут готовы к экстракции РНК. Когда все будет готово, достаньте образцы РНК из морозильной камеры при температуре -80 °C и разморозьте их на льду в течение 10 минут. Энергично переведите пробирки при комнатной температуре в течение 10-15 минут, чтобы обеспечить полный лизис образцов.
  4. Снова поместите образцы на лед и приступайте к извлечению РНК в соответствии с инструкциями производителя. Перенесите образцы РНК в морозильную камеру при температуре -80 °C, если вы не готовы перейти к следующему шагу.
  5. Выполняйте экстракцию РНК, обработку ДНКазой, синтез кДНК и ОТ-кПЦР с использованием стандартной методологии. В таблице 2 приведен список названий и последовательностей праймеров.

3. Проверка структурирования органоидов методом иммунофлюоресценции

  1. Сбор и фиксация органоидов
    1. Асасируйте среду HIO или HCO из соответствующих лунок и добавьте в каждую лунку по 1 мл ледяного фосфатно-солевого буфера (PBS). Отделите органоиды от ЭХМ с помощью разрезанного наконечника для пипетки объемом 200 мкл. Проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы отделить большие куски ЭКМ от органоидов.
    2. Переложите органоиды в коническую пробирку объемом 15 мл и заполните остальную часть пробирки ледяным PBS и аккуратно перемешайте, перевернув пробирку. Дайте органоидам осесть под действием силы тяжести и аспирируйте PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если органоиды не оседают под действием силы тяжести, центрифугируйте при 300 × г в течение 1 минуты.
    3. Отсадите PBS и добавьте 1 мл ледяного раствора для разложения ЭХМ. Держите трубку на льду в течение 10-15 минут на вращающейся платформе, осторожно встряхивая.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наклоните трубку под углом 45°, чтобы обеспечить правильное смешивание органоидов и раствора для восстановления клеток. Через 10-15 мин органоиды должны осесть на дно пробирки, что свидетельствует о полном переваривании ВКМ.
    4. Добавить холодный PBS в пробирку до 15 мл; Хорошо перемешайте, несколько раз перевернув трубку. Когда органоиды осядут на дно пробирки, аспирируйте PBS и добавьте 1 мл предварительно охлажденного 4% параформальдегида для фиксации органоидов. Инкубируйте органоиды с 4% параформальдегидом на льду в течение 1 ч.
    5. Заполните остальную часть трубки ледяным PBS и поместите ее горизонтально на качающуюся платформу при температуре 4 °C на ночь. На следующий день утилизируйте параформальдегид/PBS в указанный контейнер для отходов и промойте один раз 15 мл ледяного PBS, как описано в шаге 3.1.2.
    6. Аспирируйте PBS и заполните пробирку 30% сахарозой в PBS. Поместите трубку горизонтально на качающуюся платформу при температуре 4 °C на ночь.
    7. На следующий день вживите органоиды в базовую модель размером 7 мм x 7 мм x 5 мм со средой OCT и мгновенно заморозьте с помощью ванны с сухим льдом и этанолом.
    8. Высушите блоки лабораторными салфетками, заверните в бумажное полотенце и оставьте на ночь в морозильной камере при температуре -80 °C. На следующий день вырежьте срезы размером 5 мкм на предметные стекла микроскопа с помощью криостата. Хранить предметные стекла при температуре -80 °C.
  2. Иммунофлуоресцентное окрашивание органоидов
    1. Обработайте предметные стекла из морозильной камеры при температуре -80 °C и выполните окрашивание ПЧ по стандартным протоколам.
    2. Наклейте покровные стекла на предметные стекла и высушите их при комнатной температуре, в защищенном от света месте не менее 2 часов или в течение ночи перед визуализацией.
    3. Визуализируйте слайды с помощью 25-кратного объектива конфокального микроскопа.

Результаты

Успешное генерирование сфероидов на стадии индукции средней/задней кишки свидетельствует об успешном формировании паттернов. Выполните окрашивание IF для CDX2 на плавающих сфероидах и на монослое, чтобы убедиться в правильности нанесения рисунка. Хотя окрашивание на ?...

Обсуждение

Дифференциация hPSC на HIO и HCO является сложным процессом, требующим контроля качества на каждом этапе. Исходные ПСК должны иметь минимальную дифференцировку, прежде чем начать дифференцировку в ДЭ. Оптимизация плотности hPSCs, покрытых для дифференцировки DE, имеет решающ...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Лаборатория Múnera финансируется NIH/NCI 5U54CA210962-02 Исследовательским центром неравенства при раке Южной Каролины (SC CADRE), NIH/NIGMS P20 GM130457-01A1 COBRE при заболеваниях пищеварительной системы и печени и NIH/NIDDK 1P30 DK123704-01 MUSC Core Research Disease Disease Core Center.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1% Bovine serum albumin (BSA) solutionN/AN/AN/A
15 mL Corning tubeFalcon21008-918N/A
30% SucroseN/AN/AMade in PBS.
5% Normal donkey serumJackson ImmunoResearch Lab017-000-121N/A
50 mL Corning tubeFalcon21008-951N/A
AccutaseThermo ScientificA1110501Cell detachment solution; aliquot 5 mL of Accutase into 10 mL tubes totaling 20 tubes and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use.
Activin ACell guidance SystemsGFH6-100x10Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Aliquot 38 µL of Activin A into prechilled microcentrifuge tubes and store at -80 °C (Tubes expire 12 months from date of receipt).
Activin Day 1 medium (RPMI 1640)CorningMT10041CVUse nonessential amino acids (NEAA, Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 1 medium: 500 mL of RPMI 1640 and 500 mL of NEAA. When preparing Activin Day 1 medium, add 13 mL of basic day 1 medium, 13 µl of Activin A (100 µg/mL), and 2 µl of BMP4 (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Activin Day 2 medium (RPMI 1640, 0.2% FBS vol/vol)HycloneSH30070.03TUse nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 2 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL of NEAA, and 1 mL of 0.2% serum. When preparing Activin Day 2 medium, add 12.5 mL of basic day 2 medium and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Activin Day 3 medium (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)HycloneSH30070.03TUse nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 3 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL NEAA, and 10 mL of 2% serum. When preparing Activin Day 3 medium, add 12.5 mL of basic day 3 and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Alexa Fluor 488 Donkey anti-GoatThermo ScientificA110551:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 488 Donkey anti-RabbitThermo ScientificA212061:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 546 Donkey anti-MouseThermo ScientificA100361:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 647 Donkey anti-MouseThermo ScientificA315711:500 dilution (Secondary antibody)
Base moldFisher22-363-552N/A
Basic gut medium (advanced DMEM)Gibco12491015 When preparing Basic gut medium, add 500 mL of DMEM, 500 mL of N2 (Gibco 17-502-048), 500 mL of B27 (Gibco), 500 mL of L-Glutamine to get 2 mM L-Glutamine (Corning A2916801), 5 mL of 100 U/mL Penicillin-Streptomycin (Gibco 15-140-122), and 7.5 mL of  1 M HEPES to get 15 mM HEPES.  The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Biorad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBioradN/AOther qRT-PCR systems can be used.
Cell Recovery SolutionCorning354253ECM-degrading solution
CHIR99021Reprocell4000410Reconstitute by adding 2.15 mL of DMSO at 10 mM. Prepare 50 µL aliquots and store at -20 °C.  Store powder at 4 °C, protected from light.
CTRL HIO patterning mediumN/AN/ABasic gut medium and 100 ng/mL EGF.
DAPISigma-AldrichD95421:100 dilution (Secondary antibody)
DE monolayerN/AN/AMonolayer was generated in prior steps (Section 4.4).
DispaseGibco17105041Resuspend lyophilized powder in Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) to a 1 mg/mL final concentration. Filter the solution for sterilization by vacuuming using a Millipore filter sterilization tube. Make 10 mL aliquots (1 mg/mL) and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use.
EGFThermo Scientific236-EG-01MWhen preparing 100 ng/mL EGF reconstitute 500 µg/mL in sterile PBS. Next add 2 mL of sterile PBS to 1 mg EGF and make 500 µg/mL EGF solution. Aliquot 100 µL of EGF in 20 tubes.
Fisherbrand 6 cm Petri Dishes with Clear LidFisherFB0875713AN/A
Fisherbrand Cell LifterFisher08-100-240N/A
Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials with Closures AttachedFisher03-338BN/A
Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur PipetteFisher13-678-2D0N/A
Fluoromount G Slide Mounting MediumVWR100241-874N/A
Gibco advanced DMEMGibco12-491-023N/A
Goat anti-E-CadherinR&D systemsAF6481:400 dilution (Primary antibody)
Goat anti-SOX17R&D systemsAF19241:500 dilution (Primary antibody)
HCOs patterning mediumN/AN/ABasic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL BMP2. When preparing BMP2, add 1 mL of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to BMP2 vials (100 µg). Aliquot 25 µL of BMP4 solution in 4 tubes.  The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
HemocytometerSigma-AldrichZ359629N/A
Human Pluripotent Stem Cells (hPSC)Pluripotent Stem Cell FacilityN/ACells seeded in a Matrigel coated 24-well plate (Thermo Scientific 73520-906).
Ice-cold 4% Paraformaldehyde solution (PFA)N/AN/AN/A
Ice-cold Phosphate Buffered Saline (PBS)N/AN/AThe pH must be 7.4.
ImmEdge Hydrophobic Barrier PenVector Laboratories101098-065N/A
Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)Pluripotent Stem Cell Facility (Cincinnati Children's Hospital Medical Center)N/AOther hESC or iPSC lines can be used, but the protocol needs to be optimized for each cell line.
Leica microtomeN/AN/AN/A
LSM 880confocal microscope
Matrigel Basement Membrane MatrixCorning354234N/A
Matrigel hESC-qualified MatrixCorning354277Prepare 4 x Matrigel aliquots which corresponds to volumes sufficient to make enough diluted Matrigel for 4 x 6-well dishes.
Mid-hindgut induction medium (RPMI 1640)CorningMT10041CVNonessential amino acids (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 µM CHIR99021 and 500 ng/mL FGF4. The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Mid-hindgut spheroidsN/AN/AN/A
MilliporeSigma Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter UnitsMilliporeSigmaSCGP00525N/A
Mouse anti-CDX2BioGenexMU392-UC1:300 dilution (Primary antibody)
Mouse anti-FOXA2Abnova/NovusH00003170-M011:500 dilution
mTeSR1 complete growth mediumStem Cell technologies85870Add 100-mL of mTeSR supplement (85870) into one 400-mL mTeSR medium (85870) and aliquot into 50-mL tubes while avoiding contamination. Store at 4°C until use.
Murray's Clear solution (Also known as BABB)Murray'sN/A1:2 benzyl benzoate and benzyl alcohol.
NOG HIO patterning mediumN/AN/ABasic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL NOGGIN (Dispense 25 µg of NOGGIN in 250 µl sterile PBS with 0.1% BSA).
NucleoSpin RNATakara740955.25Other RNA isolation kits may be used.
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells (Nunc)Thermo Scientific73521-004N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells coated with MatrigelThermo Scientific73521-004N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells (Nunc)Thermo Scientific73520-906N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells coated with  Matrigel.Thermo Scientific73520-906N/A
Outgrowth medium for HIOs, CTRL HIOs, and HCOsN/AN/ABasic gut medium and 100 ng/mL EGF (Final concentration)
Phosphate Buffer Saline, 0.5% Triton X (PBS-T)N/AN/AN/A
PrimersIntegrated DNA Technologies, Inc. (IDT)N/AThe primers are listed in Table 2 on the protocol.
Rabbit anti-CDX2Cell MarqueEPR22764Y1:100 dilution (Primary antibody)
Rabbit anti-SATB2Cell MarqueEP2811:100 dilution (Primary antibody)
Recombinant Human BMP-4 ProteinR&D systems314-BP-010Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile 4 mM HCl containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Add 4.17 mL HCl solution to 45.83 mL molecular water totaling to 50 mL of 1 M HCl. Then add 200 µL of 1 M HCl to 49.8 mL of molecular grade water totaling to 50 mL of 4 mM HCl. Next add 0.05 g BSA to 50 mL of 4 mM HCl and filter to make sterile. Aliquot sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to 33 microcentrifuge tube totaling and store at -20 °C. Add 100 µl of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to the BMP4 vials (10 µg) to make BMP4 solution at 100 µg/mL.
Recombinant Human FGF-4 ProteinR&D systems235-F4-01MReconstitute at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin. Add 0.05 g of BSA in 50 mL of PBS to make 0.1% BSA. Filter 0.22 µM BSA to sterilize the BSA. Aliquot 10 mL of 0.1% BSA in 5 tubes. Add 1 mg FGF-4 in 10 mL of sterile 0.1% BSA. Aliquot 250 µL into prechilled 40 microcentrifuge tubes and store at -80 °C.
ROCK inhibitor Y-27632Tocris1254The final concentration is 10 mM (10 mmol/L). Resuspend in DMSO at 10 mM and filter sterilize. Add 3 mL of sterile PBS to each vial. Aliqout 100 µL of ROCK inhibitor in 30 tubes and store at -20 °C.
SuperScript VILO cDNA Synthesis KitThermo Scientific11-754-250N/A
SuperFrost Plus microscope slides
Tissue Tek O.C.T CompoundVWR25608-930N/A

Ссылки

  1. Montgomery, R. K., Mulberg, A. E., Grand, R. J. Development of the human gastrointestinal tract: twenty years of progress. Gastroenterology. 116 (3), 702-731 (1999).
  2. Beumer, J., et al. High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells. Cell. 181 (6), 1291-1306 (2020).
  3. van Klinken, B. J., et al. MUC5B is the prominent mucin in human gallbladder and is also expressed in a subset of colonic goblet cells. American Journal of Physiology. 274 (5), 871-878 (1998).
  4. Escande, F., Porchet, N., Aubert, J. P., Buisine, M. P. The mouse Muc5b mucin gene: cDNA and genomic structures, chromosomal localization and expression. Biochemical Journal. 363, 589-598 (2002).
  5. Lau, S. T., et al. Activation of hedgehog signaling promotes development of mouse and human enteric neural crest cells, based on single-cell transcriptome analyses. Gastroenterology. 157 (6), 1556-1571 (2019).
  6. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  7. Munera, J. O., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into colonic organoids via transient activation of BMP signaling. Cell Stem Cell. 21 (1), 51-64 (2017).
  8. Higuchi, Y., et al. Gastrointestinal fibroblasts have specialized, diverse transcriptional phenotypes: a comprehensive gene expression analysis of human fibroblasts. PLoS One. 10 (6), 0129241 (2015).
  9. Yahagi, N., et al. Position-specific expression of Hox genes along the gastrointestinal tract. Congenital Anomalies. 44 (1), 18-26 (2004).
  10. Sarvestani, S. K., et al. Induced organoids derived from patients with ulcerative colitis recapitulate colitic reactivity. Nature Communications. 12 (1), 262 (2021).
  11. Holloway, E. M., et al. Differentiation of human intestinal organoids with endogenous vascular endothelial cells. Developmental Cell. 54 (4), 516-528 (2020).
  12. Britanova, O., et al. Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex. Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).
  13. Jaitner, C., et al. Satb2 determines miRNA expression and long-term memory in the adult central nervous system. Elife. 5, 17361 (2016).
  14. Teo, A. K., et al. Activin and BMP4 synergistically promote formation of definitive endoderm in human embryonic stem cells. Stem Cells. 30 (4), 631-642 (2012).
  15. Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
  16. Tamminen, K., et al. Intestinal commitment and maturation of human pluripotent stem cells is independent of exogenous FGF4 and R-spondin1. PloS One. 10 (7), 0134551 (2015).
  17. Crespo, M., et al. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nature Medicine. 23 (7), 878-884 (2017).
  18. Lees, E. A., et al. Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against Salmonella and other pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478 (2019).
  19. Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
  20. Jung, K. B., et al. Interleukin-2 induces the in vitro maturation of human pluripotent stem cell-derived intestinal organoids. Nature Communications. 9 (1), 3039 (2018).
  21. Woo, D. H., et al. Enhancing a Wnt-telomere feedback loop restores intestinal stem cell function in a human organotypic model of dyskeratosis congenita. Cell Stem Cell. 19 (3), 397-405 (2016).
  22. Sommer, C. A., et al. Modeling APC mutagenesis and familial adenomatous polyposis using human iPS cells. PLoS One. 13 (7), 0200657 (2018).
  23. McCauley, H. A., et al. Enteroendocrine cells couple nutrient sensing to nutrient absorption by regulating ion transport. Nature Communications. 11 (1), 4791 (2020).
  24. Zhang, X., et al. A comprehensive structure-function study of neurogenin3 disease-causing alleles during human pancreas and intestinal organoid development. Developmental Cell. 50 (3), 367-380 (2019).
  25. Kumar, N., et al. The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development. Development. 146 (5), (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

BMPHPSCsSATB2HIOsHCOs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены