ヒト多能性幹細胞由来腸管オルガノイドおよび結腸オルガノイドの作製、維持、および特性評価

要約

ここでは、ヒト多能性幹細胞由来の小腸オルガノイドおよび結腸オルガノイドを作製、維持、および特性評価するための詳細な方法について説明します。これらの方法は、オルガノイドのプレーティングと継代に必要な作業時間を短縮し、再現性を向上させ、スケーラビリティを拡大するように設計されています。

要約

腸の地域仕様は、発達中の胃腸(GI)管の定義された領域に独自の形態と機能が付与されるプロセスを説明しています。腸内の局所的な特異性は、骨形成タンパク質(BMP)経路を含む複数の発生経路によって駆動されます。通常の地域仕様に基づき、ヒト胚性幹細胞(hES)と人工多能性幹細胞(iPSC)を含むヒト多能性幹細胞(hPSC)からヒト結腸オルガノイド(HCO)を作製する方法を開発しました。BMPシグナル伝達の3日間の誘導により、中腸/後腸管培養物を、ヒト結腸に存在するすべての主要な上皮細胞タイプを含む特別なATリッチ配列結合タンパク質2(SATB2)発現HCOに十分にパターン化し、共発達する間葉系細胞にもたらします。この重要なパターニング期間中のBMPの省略(またはBMP阻害剤NOGGINの追加)により、ヒト腸オルガノイド(HIO)が形成されました。HIOとHCOは、形態学的および分子的に、それぞれヒトの発育中の小腸と結腸に似ています。HIOとHCOはヒトの腸の発達を研究する上で有用であるにもかかわらず、HIOとHCOの生成は困難です。この論文では、HIOおよびHCOを生成、維持、および特性評価する方法を紹介します。さらに、プロトコルの重要な手順とトラブルシューティングの推奨事項も示されています。

概要

ヒトの結腸発生の研究は、ヒトの胎児組織の使用に制限があるため困難です。動物モデルは、腸の発達を研究するためのマウスの遺伝的アプローチに非常に貴重であり、歴史的に使用されてきました。しかし、マウスとヒトの腸管発生の違いにより、マウスのモデルシステムとしての適用性は限られています。例えば、マウスの小腸や結腸での陰窩形成は出生後に起こりますが、ヒトは生まれつき完全に形成された陰窩¹を持っています。さらに、ヒトの小腸と結腸には、小腸のモチリン(MLN)発現腸内分泌細胞²や結腸のムチン5B(MUC5B)発現杯細胞^3,4など、マウスには見られない細胞タイプが含まれています。このため、結腸発生の初期段階を定義する動的な分子イベントを正確にモデル化する細胞培養システムを持つことが重要です。したがって、結腸特性を持つ細胞を生成するようにhPSCを指示することは、ヒトの結腸発生の研究のための強力なモデルを提供します。

プロトコル^は、hPSCからの腸様オルガノイド⁶ および結腸様オルガノイド⁷ の再現性5、同期的、かつ効率的な形成を促進するために開発されました。これらのプロトコルは、胎児の腸と結腸の発達を模倣した段階的な分化手順を使用します(図1)。まず、ヒト多能性幹細胞から、Nodal模倣物であるアクチビンAで処理することにより、決定的な内胚葉を作製します。決定的な内胚葉を高レベルのWNTおよび線維芽細胞成長因子(FGF)に曝露すると、CDX2⁺ 中腸/後腸管スフェロイドへの形態形成が誘導されます。その後、中腸/後腸スフェロイドは細胞外マトリックス(ECM)に埋め込まれ、BMPシグナル伝達の一過性操作を通じてHIOまたはHCOのいずれかにパターン化されます。NOGGINを使用してBMPシグナル伝達を阻害するか、増殖培地のみを添加すると、ヒト近位小腸に似たHIOが形成されます。

BMP2を用いてBMPシグナル伝達を活性化することにより、中腸/後腸スフェロイドはHCOにパターン化され、HCOは上皮と間葉にパターン化^{を保持します7。}HCOは、結腸が豊富なMUC5B発現杯細胞を含み、結腸特異的インスリン様5(INSL5)発現腸内分泌細胞を産生する能力があります。HCOから単離された間葉は、ホメオボックスA13(HOXA13)とHOXD13を発現し、これらはヒトの一次結腸間葉でも発現^{します8。}パターニングステップは、分化プロトコルの7〜10日目に発生することを覚えておくことが重要です。この3日間の期間は、長期 のin vitro 培養後も維持される結腸パターニングを誘導するのに十分です。

以下で説明するプロトコルは、フィーダーフリーのhPSC培養に精通している研究者向けです。このタイプのhPSC培養に詳しくない研究者には、Stem Cell Technologiesやシンシナティ小児病院の多能性幹細胞施設(PSCF)が提供するようなhPSCに関するトレーニングコースをお勧めします。開始時のhPSCの品質は非常に重要であり、すべての下流ステップに影響を与える可能性があります。以下のプロトコルは、4日間培養され、分割の準備ができているhPSCから始まります。

プロトコル

1. ヒト腸オルガノイドおよび結腸オルガノイドの作製

1. ECMコーティングプレートの準備
   1. 50 mLのコニカルチューブに50 mLの冷たいDMEM培地を加えます。
   2. -80°Cの冷凍庫から4x hESC認定ECM( 材料表を参照)のアリコートを取り出し、氷上で解凍します。
      注意: 製品の分析証明書を参照して、4xストックを準備するために必要なESC認定ECMの量を決定します。
   3. hESC認定ECMが完全に解凍されていない場合は、50mLのコニカルチューブから750μLのDMEMを取り出し、ECMと混合します。
   4. DMEM/hESCで修飾されたECM混合物をDMEMで50mLコニカルチューブに移し、よく混合します。1ウェルあたり0.5 mLを4 x 24ウェル細胞培養プレートのそれぞれに加えます。
   5. プレートを振ってECMをウェル全体に均等に広げ、表面全体が覆われていることを確認します。パラフィルムを使用して、ECMコーティングされたプレートを密封し、バイオセーフティキャビネットに室温で少なくとも1時間放置します。ECMコーティングプレートは、最大2週間または必要になるまで4°Cで保管してください。
2. hPSCsシングルセルめっき
   1. ECMコーティングされた24ウェルプレートをバイオセーフティキャビネット内に30分間置き、室温に戻します。
   2. mTeSR1完全培地、細胞剥離溶液、および高度なDMEMを37°Cのウォーターバス内に入れ、30分間ウォームアップします。
   3. hPSCが少なくとも85%コンフルエントで、微分が最小限であることを確認してください。必要に応じて、分化したセルをすべて削除します。
   4. 13 mLのmTeSR1と13 μLの10 mM Y-27632 Rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤13 μLで、50 mLのコニカルチューブにプレーティング培地を調製します。
      注:Y-27632はアノイキスを阻害し、単一細胞の生存率を高めます。
   5. 6ウェルプレートから細胞を採取するには、培地を3ウェルから4ウェルまで吸引し、ウェルあたり2 mLの高度なDMEMで1回洗浄します。
   6. 進行したDMEMを吸引し、1 mLの細胞解離溶液を各ウェルに分注します。プレートを5% CO₂、37°Cインキュベーター内で5〜7分間インキュベートします。顕微鏡で細胞が懸濁状態にあることを確認します。
   7. 5 mLピペットを使用して4〜5回ピペッティングして、残っている細胞塊を解離します。
   8. 各ウェルに2 mLの高度なDMEMを加え、4〜5回静かにピペットで上下させ、15 mLのコニカルチューブに移します。細胞を300 × g で室温で3分間スピンダウンします。
   9. 細胞ペレットを吸引せずにチューブから培地を吸引し、調製したmTeSR1とROCK阻害剤の培地6 mLを加えます。ピペッティングで3〜4回ピペッティングして細胞を穏やかに再懸濁し、懸濁液を50mLチューブ内の残りのmTeSR1/ROCK阻害剤培地に移します。4〜5回激しく再懸濁し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
   10. 細胞をプレーティングする直前に、24ウェルプレートからECMを吸引します。ピペッティングを2〜3回行って細胞を再懸濁し、各ウェルに0.5 mLの細胞懸濁液を分注します。
       注:最適なめっき密度は、実験者が決定する必要があります。ここで、最適な細胞数はウェルあたり80,000〜200,000細胞です。
   11. プレートを時計回りに3回、反時計回りに3回、前後に3回、左右に3回、穏やかに揺さぶって、細胞を均等に分散させます。
   12. プレートを37°C、5%CO₂ インキュベーターに移し、24時間インキュベートします。
       注:ウェル内の細胞が適切に分散するように、最初の数時間はプレートを乱さないでください。
   13. 24時間後(図2A)、使用済み培地を吸引し、mTeSR1のウェルあたり0.5 mLを添加し、再度37°C、5%CO₂ で24時間インキュベート(図2B)してから、次のステップに進みます。
3. hPSCからの決定的内胚葉(DE)の鑑別
   1. 15 mLのコニカルチューブに、13 mLのActivin Day 1培地( 材料表を参照)、13 μLの100 μg/mL Activin A、1.95 μLの100 μg/mL BMP4を加えます。37°Cのウォーターバスで培地を温めます。
   2. 24ウェルプレートからmTeSR1培地を吸引し、ウェルごとに0.5 mLのActivin Day 1培地を添加します。プレートを37°C、5%_CO2 インキュベーターに置き、24時間インキュベートします。24時間後にセルを確認します。
      注: 図2Cに示すように、広範な細胞死が明らかになるはずです。単層はまばらに見えますが、細胞のコロニーは拡大しています。
   3. 12.5 μL の 100 μg/mL アクチビン A を 12.5 mL の Activin Day 2 培地 15 mL コニカルチューブに添加して、Activin Day 2 完全培地を調製します。チューブを37°Cのウォーターバスに入れます。
   4. 24ウェル分化プレートを_CO2 インキュベーターから取り出し、使用済みの培地を取り出します。ウェルあたり0.5 mLの予熱したActivin Day 2培地を分注し、プレートを_CO2 インキュベーター内に24時間戻します。
      注意: メディアを分配するときは注意が必要です。.ウェルの中央に直接培地を分注すると、単分子膜の細胞が剥離するため、分注しないでください。ウェルの側面に培地を慎重に分注します。翌日、細胞死はごくわずかで、細胞の単層が形成されます。これで、細胞は ~90 ~ 95% コンフルエントになるはずです(図 2D)。
   5. 15 mLコニカルチューブ内の12.5 mLのActivin Day.3培地に12.5 μLの100 μg/mLアクチビンAを加えて、Activin Day 3完全培地を調製します。チューブを37°Cのウォーターバスに入れます。
   6. 使用済みの培地を取り出し、ウェルごとに0.5 mLのActivin Day 3培地を分注します。
      注意: メディアを分配するときは注意が必要です。ウェルの中央に直接培地を分注すると、単層の細胞が剥離するため、分注しないでください。ウェルの側面に培地を慎重に分注します。翌日、単層は、この段階で細胞死がほとんどまたはまったくなく、完全なコンフルエントに達するはずです。Activin Day 3培地を追加してから24時間後に単層がコンフルエントでない場合は、中腸スフェロイドの生成を試みないでください。.DE単層の理想的な形態については、中後腸スフェロイドの生成に進む前に、 図2E を参照してください。
   7. DE分化を最適化する際には、forkhead box A2タンパク質(FOXA2)および性決定領域Y(SRY)-box転写因子17(SOX17)の発現のために、単層の免疫蛍光染色(IF)を行います。
4. DEの中腸スフェロイドへの分化
   1. 50 mLのコニカルチューブに、FGF4(CHIR99021なし)を含む中腸誘導培地25 mLを加え、37°Cのウォーターバスに30分間入れます。
   2. 完全な中後腸誘導培地を調製するには、培地が温まった後に7.5μLのCHIR99021を追加します。
   3. 使用済みの培地を取り出し、ウェルあたり0.5 mLの中部後腸誘導培地を分注し、37°C、5%CO₂ で24時間インキュベートします。
   4. 翌日に単分子膜内の細胞の凝縮が発生した後(図3A)、使用済みの培地を新鮮な中腸誘導培地と交換し、プレートを37°C、5%_CO2 インキュベーターに24時間戻します。
      注: 図3Bに示すように、中部後腸誘導の48時間後に管状構造が顕著になります。中腸スフェロイドは、 図3Cに示すように、3日目に単層から出芽し始めます。
   5. 培地交換中に浮遊スフェロイドが廃棄されるのを避けるため、古い培地を15 mLチューブに移し、300 × g で1分間遠心分離します。スフェロイドを12.5 mLの新鮮な中後腸誘導培地に再懸濁し、同じ24ウェルプレートにウェルあたり0.5 mLを加え、37°C、5%CO₂ で24時間インキュベートします。
   6. 後腸誘導の4日目(図3D)に、培地を15 mLチューブに集めてプレートウェルから浮遊スフェロイドを回収し、続いて300 × g で1分間遠心分離します。ECMに中腸スフェロイドを埋め込むための次のステップに進みます。
5. ECMにおける中腸/後腸スフェロイドのプレーティングとパターニング
   1. ECM基底膜マトリックスを4°Cで一晩解凍してから、埋入します。
      注: この ECM は、hESC 認定の ECM とは異なります。ECMは氷上に置く必要があり、適切な量のECMを氷上で予め冷却した1.5mL微量遠心チューブに分注できます。 表 1 には、ECM ボリュームに関する情報が含まれています。スフェロイドが埋め込まれる液滴中のECMの体積が少なくとも75%であることを確認してください。
   2. 24ウェルプレートを37°Cのインキュベーターで温めます。
   3. 1000 μLピペットを使用してすべての24ウェルからフローティングスフェロイドを回収し、15 mLのコニカルチューブに移します。スフェロイドを300 × g で室温で1分間スピンダウンします。媒体の大部分を吸引しますが、めっきに必要な量を残します(表1)。
   4. 1000 μLと200 μLのピペットチップの端を切って準備します。予熱した24ウェルプレートを取り出します。
   5. 浮遊するスフェロイドを混合し、氷上に置いたECMチューブに適切な量を移し、ピペッティングでスフェロイドとECMを再懸濁してよく混合します。
   6. スフェロイドとECMの混合物65 μLをカットした200 μLピペットチップに取り、24ウェルプレートの各ウェルの中心にロードします。良好なECM液滴が形成されていることを確認するために、混合物が分注されている間、ピペットを穏やかかつゆっくりと持ち上げます。
      注:ウェルあたり30〜100個のスフェロイドをプレート化します。
   7. プレートを37°C、5%_CO2 インキュベーターに静かに移し、5分間インキュベートします。
   8. プレートを逆さまにして15〜25分間インキュベートすると、ECM液滴がドーム状の構造を維持するのに役立ちます。
   9. インキュベーション中に、必要な培地を準備して温めます。ECMが固まったら、各ウェルに0.5 mLのHIOまたはHCOパターニング培地を加え、37°C、5%CO₂でインキュベートします。ECMのスフェロイドの画像については、 図3E を参照してください。
   10. スフェロイドをパターニング培地で3日間培養します。
   11. 3日後、HIOまたはHCOパターニング培地を通常の増殖培地に交換し、37°C、5%CO₂でインキュベートします。
       注:この時点(10日目)のオルガノイドは初期段階のオルガノイドです。プロジェクトの目標に基づき、セクション2で詳述するように、一部の初期オルガノイドを早期パターニング分析に使用することができます。
6. ヒト腸および結腸オルガノイドの増殖と継代
   1. 10日目以降、成長培地を3日ごとに交換します。
      注:めっき密度とオルガノイドの成長によっては、より頻繁な培地交換が必要になる場合があります。培地の交換は、培地中のフェノールレッド(pH指示薬)が黄色になる前に行う必要があります。
   2. オルガノイドを21日目までインキュベートします(図3F)。
      注:BMP2治療により、スフェロイドから増殖するオルガノイドの数が減少します(HIOの~3倍)。したがって、HCOの生成には、より多くのスフェロイドをプレーティングする必要があります。
7. 21日目のオルガノイドの分割
   1. オルガノイドを検査します。
      注:ECMはオルガノイドの成長と拡大により21日目までにほぼ分解されるため、オルガノイドは21日目に分割する必要があります。
   2. 1000 μLおよび200 μLのピペットチップの端を切って準備します。
   3. 24ウェルNuncプレートを37°Cのインキュベーターで温めます。
   4. 予冷した1.5 mLチューブに適切な量のECMを分注します(表1)。
   5. 1000 μLのピペットチップでオルガノイドでECM液滴を優しくこすり落とし、混合物を数回上下にピペットで動かしてECMを分解します。
   6. 混合物を60 mmのペトリ皿に移し、顕微鏡でオルガノイドを確認します。必要に応じて、滅菌鉗子を使用してオルガノイドを互いに分離します。分離がオルガノイドの上皮を損傷しないことを確認してください。
   7. オルガノイドを15 mLのコニカルチューブに移し、300 × g で30秒間遠心分離します。上清を吸引し、チューブ内に~1 mLの培地を残します。
      注:培地の容量は、実験の目的に基づいて変更できます。ECM液滴ごとにより多くのオルガノイドが必要な場合は、培地の量を減らすことができます。ただし、必要なオルガノイドの数が少ない場合は、培地の容量を増やすことができます。
   8. オルガノイドをよく混合し、氷上に置いたECMチューブに適切な量を移し、オルガノイドとECMをピペッティングで再懸濁してよく混合します。
   9. カットした200 μLピペットチップを使用して、スフェロイドとECMの混合物を65 μLを24ウェルプレートの各ウェルの中央に加えます。
      注:ピペッティング中に最初にオルガノイドを取り込み、次にECMを取り出します。したがって、混合物を分注する間、オルガノイドはECM液滴の上部にあります。
   10. プレートを37°C、5%CO₂ インキュベーターに5分間入れます。
   11. プレートをさらに15〜25分間逆さまにして、ECM液滴がドーム状の構造を維持するのを助けます。
   12. 各ウェルに0.5 mLのHIO/HCO伸長培地を加え、37°C、5% CO₂でインキュベートします。
       注:パターニング後の伸長培地は、HIOとHCOの両方で同じです。
   13. 35日目まで2〜3日ごとに培地を交換します(図3G)。

2. 逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)によるオルガノイドのパターニングの検証

1. RNAを収集する前に、製造元の指示に従って1x RNA溶解バッファーを調製してください。
2. 使用済みの培地を廃棄し、350 μL の溶解バッファーを 24 ウェルプレートの各ウェルに加えます。オルガノイドを溶解するには、1 mLピペットを使用してピペッティングで上下します。より良い溶解のために、最高速度で5秒間短時間ボルテックスします。
3. RNA抽出の準備が整うまで、すべてのサンプルを-80°Cに保ちます。準備ができたら、-80°Cの冷凍庫からRNAサンプルを取り出し、氷上で10分間解凍します。チューブを室温で10〜15分間激しくボルテックスし、サンプルが完全に溶解するようにします。
4. サンプルを再び氷上に置いて、製造元の指示に従ってRNA抽出に進みます。次のステップに進む準備ができていない場合は、RNAサンプルを-80°Cのフリーザーに移します。
5. 標準的な方法論を使用して、RNA抽出、DNAse処理、cDNA合成、およびRT-qPCRを実行します。プライマーの名称と配列のリストについては、 表2 を参照してください。

3. 免疫蛍光法によるオルガノイドのパターニングの検証

1. オルガノイドの収集と固定
   1. 適切なウェルからHIOまたはHCO培地を吸引し、各ウェルに1 mLの氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加えます。カットされた200 μLピペットチップを使用して、ECMからオルガノイドを解離します。ピペットで上下に動かして、ECMの大きな塊をオルガノイドから解離させます。
   2. オルガノイドを15mLの円錐形チューブに移し、チューブの残りの部分に氷冷したPBSを充填し、チューブを反転させて穏やかに混合します。オルガノイドが重力によって沈降するのを待ち、PBSを吸引します。
      注:オルガノイドが重力によって沈降しない場合は、300 × g で1分間遠心分離します。
   3. PBSを吸引し、氷冷ECM分解溶液1mLを加えます。チューブを回転するプラットフォームで10〜15分間氷の上に置いて、穏やかに振ってください。
      注:チューブを45°の角度に傾けて、オルガノイドと細胞回収溶液が適切に混合されるようにします。10〜15分後、オルガノイドはチューブの底に落ち着き、ECMの完全な消化を示します。
   4. チューブに冷たいPBSを最大15mL追加します。チューブを数回反転させてよく混ぜます。オルガノイドがチューブの底に落ち着いたら、PBSを吸引し、予冷した4%パラホルムアルデヒド1 mLを加えてオルガノイドを固定します。オルガノイドを4%パラホルムアルデヒドと氷上で1時間インキュベートします。
   5. チューブの残りの部分に氷冷したPBSを充填し、4°Cのロッキングプラットフォームに水平に一晩置きます。翌日、パラホルムアルデヒド/ PBSを指定された廃棄物容器に廃棄し、ステップ3.1.2で説明されているように、15 mLの氷冷PBSで1回洗浄します。
   6. PBSを吸引し、PBS中の30%スクロースをチューブに充填します。チューブを4°Cのロッキングプラットフォームに水平に一晩置きます。
   7. 翌日、オルガノイドをOCT培地で7 mm x 7 mm x 5 mmのベースモデルに埋め込み、ドライアイス/エタノール浴を使用して急速凍結します。
   8. ブロックを実験室用ワイプで乾かし、ペーパータオルで包み、-80°Cの冷凍庫で一晩保管します。翌日、クライオスタットを使用して顕微鏡スライド上に5 μm切片をカットします。スライドは-80°Cで保管してください。
2. オルガノイドの免疫蛍光染色
   1. -80°Cの冷凍庫からスライドを処理し、標準プロトコルを使用してIF染色を行います。
   2. スライドにカバースリップを貼り、室温で乾燥させ、少なくとも2時間または一晩光から保護してからイメージングします。
   3. 共焦点顕微鏡の25倍対物レンズを使用してスライドを画像化します。

結果

中腸/後腸誘導期におけるスフェロイドの生成の成功は、パターニングの成功を示しています。浮遊スフェロイドおよび単層上のCDX2のIF染色を行い、パターニングが正しいことを確認します。決定的な内胚葉(DE)段階での染色はDE誘導の有効性を示すことができますが、効率的なDE誘導なしにはスフェロイドの生成は不可能です。DE誘導の効率をテストするには、FOXA2お?...

ディスカッション

hPSCをHIOとHCOに区別することは、各ステップで品質管理を必要とする複雑なプロセスです。開始時の hPSC は、DE への分化を開始する前に、最小限の分化を行う必要があります。DE分化のために播種されたhPSCの密度を最適化することは、プロトコールの成功にとって重要です。DE分化の品質を確保するには、FOXA2とSOX17のIFを実行して、DE分化の効率を決定します。DEの分?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Bovine serum albumin (BSA) solution	N/A	N/A	N/A
15 mL Corning tube	Falcon	21008-918	N/A
30% Sucrose	N/A	N/A	Made in PBS.
5% Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Lab	017-000-121	N/A
50 mL Corning tube	Falcon	21008-951	N/A
Accutase	Thermo Scientific	A1110501	Cell detachment solution; aliquot 5 mL of Accutase into 10 mL tubes totaling 20 tubes and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use.
Activin A	Cell guidance Systems	GFH6-100x10	Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Aliquot 38 µL of Activin A into prechilled microcentrifuge tubes and store at -80 °C (Tubes expire 12 months from date of receipt).
Activin Day 1 medium (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Use nonessential amino acids (NEAA, Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 1 medium: 500 mL of RPMI 1640 and 500 mL of NEAA. When preparing Activin Day 1 medium, add 13 mL of basic day 1 medium, 13 µl of Activin A (100 µg/mL), and 2 µl of BMP4 (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Activin Day 2 medium (RPMI 1640, 0.2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03T	Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 2 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL of NEAA, and 1 mL of 0.2% serum. When preparing Activin Day 2 medium, add 12.5 mL of basic day 2 medium and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Activin Day 3 medium (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03T	Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 3 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL NEAA, and 10 mL of 2% serum. When preparing Activin Day 3 medium, add 12.5 mL of basic day 3 and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Goat	Thermo Scientific	A11055	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit	Thermo Scientific	A21206	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 546 Donkey anti-Mouse	Thermo Scientific	A10036	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 647 Donkey anti-Mouse	Thermo Scientific	A31571	1:500 dilution (Secondary antibody)
Base mold	Fisher	22-363-552	N/A
Basic gut medium (advanced DMEM)	Gibco	12491015	When preparing Basic gut medium, add 500 mL of DMEM, 500 mL of N2 (Gibco 17-502-048), 500 mL of B27 (Gibco), 500 mL of L-Glutamine to get 2 mM L-Glutamine (Corning A2916801), 5 mL of 100 U/mL Penicillin-Streptomycin (Gibco 15-140-122), and 7.5 mL of  1 M HEPES to get 15 mM HEPES.  The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Biorad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Biorad	N/A	Other qRT-PCR systems can be used.
Cell Recovery Solution	Corning	354253	ECM-degrading solution
CHIR99021	Reprocell	4000410	Reconstitute by adding 2.15 mL of DMSO at 10 mM. Prepare 50 µL aliquots and store at -20 °C.  Store powder at 4 °C, protected from light.
CTRL HIO patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium and 100 ng/mL EGF.
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	1:100 dilution (Secondary antibody)
DE monolayer	N/A	N/A	Monolayer was generated in prior steps (Section 4.4).
Dispase	Gibco	17105041	Resuspend lyophilized powder in Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) to a 1 mg/mL final concentration. Filter the solution for sterilization by vacuuming using a Millipore filter sterilization tube. Make 10 mL aliquots (1 mg/mL) and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use.
EGF	Thermo Scientific	236-EG-01M	When preparing 100 ng/mL EGF reconstitute 500 µg/mL in sterile PBS. Next add 2 mL of sterile PBS to 1 mg EGF and make 500 µg/mL EGF solution. Aliquot 100 µL of EGF in 20 tubes.
Fisherbrand 6 cm Petri Dishes with Clear Lid	Fisher	FB0875713A	N/A
Fisherbrand Cell Lifter	Fisher	08-100-240	N/A
Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials with Closures Attached	Fisher	03-338B	N/A
Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipette	Fisher	13-678-2D0	N/A
Fluoromount G Slide Mounting Medium	VWR	100241-874	N/A
Gibco advanced DMEM	Gibco	12-491-023	N/A
Goat anti-E-Cadherin	R&D systems	AF648	1:400 dilution (Primary antibody)
Goat anti-SOX17	R&D systems	AF1924	1:500 dilution (Primary antibody)
HCOs patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL BMP2. When preparing BMP2, add 1 mL of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to BMP2 vials (100 µg). Aliquot 25 µL of BMP4 solution in 4 tubes.  The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	N/A
Human Pluripotent Stem Cells (hPSC)	Pluripotent Stem Cell Facility	N/A	Cells seeded in a Matrigel coated 24-well plate (Thermo Scientific 73520-906).
Ice-cold 4% Paraformaldehyde solution (PFA)	N/A	N/A	N/A
Ice-cold Phosphate Buffered Saline (PBS)	N/A	N/A	The pH must be 7.4.
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	101098-065	N/A
Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)	Pluripotent Stem Cell Facility (Cincinnati Children's Hospital Medical Center)	N/A	Other hESC or iPSC lines can be used, but the protocol needs to be optimized for each cell line.
Leica microtome	N/A	N/A	N/A
LSM 880			confocal microscope
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	N/A
Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	Prepare 4 x Matrigel aliquots which corresponds to volumes sufficient to make enough diluted Matrigel for 4 x 6-well dishes.
Mid-hindgut induction medium (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Nonessential amino acids (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 µM CHIR99021 and 500 ng/mL FGF4. The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Mid-hindgut spheroids	N/A	N/A	N/A
MilliporeSigma Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	MilliporeSigma	SCGP00525	N/A
Mouse anti-CDX2	BioGenex	MU392-UC	1:300 dilution (Primary antibody)
Mouse anti-FOXA2	Abnova/Novus	H00003170-M01	1:500 dilution
mTeSR1 complete growth medium	Stem Cell technologies	85870	Add 100-mL of mTeSR supplement (85870) into one 400-mL mTeSR medium (85870) and aliquot into 50-mL tubes while avoiding contamination. Store at 4°C until use.
Murray's Clear solution (Also known as BABB)	Murray's	N/A	1:2 benzyl benzoate and benzyl alcohol.
NOG HIO patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL NOGGIN (Dispense 25 µg of NOGGIN in 250 µl sterile PBS with 0.1% BSA).
NucleoSpin RNA	Takara	740955.25	Other RNA isolation kits may be used.
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells (Nunc)	Thermo Scientific	73521-004	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells coated with Matrigel	Thermo Scientific	73521-004	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells (Nunc)	Thermo Scientific	73520-906	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells coated with  Matrigel.	Thermo Scientific	73520-906	N/A
Outgrowth medium for HIOs, CTRL HIOs, and HCOs	N/A	N/A	Basic gut medium and 100 ng/mL EGF (Final concentration)
Phosphate Buffer Saline, 0.5% Triton X (PBS-T)	N/A	N/A	N/A
Primers	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT)	N/A	The primers are listed in Table 2 on the protocol.
Rabbit anti-CDX2	Cell Marque	EPR22764Y	1:100 dilution (Primary antibody)
Rabbit anti-SATB2	Cell Marque	EP281	1:100 dilution (Primary antibody)
Recombinant Human BMP-4 Protein	R&D systems	314-BP-010	Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile 4 mM HCl containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Add 4.17 mL HCl solution to 45.83 mL molecular water totaling to 50 mL of 1 M HCl. Then add 200 µL of 1 M HCl to 49.8 mL of molecular grade water totaling to 50 mL of 4 mM HCl. Next add 0.05 g BSA to 50 mL of 4 mM HCl and filter to make sterile. Aliquot sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to 33 microcentrifuge tube totaling and store at -20 °C. Add 100 µl of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to the BMP4 vials (10 µg) to make BMP4 solution at 100 µg/mL.
Recombinant Human FGF-4 Protein	R&D systems	235-F4-01M	Reconstitute at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin. Add 0.05 g of BSA in 50 mL of PBS to make 0.1% BSA. Filter 0.22 µM BSA to sterilize the BSA. Aliquot 10 mL of 0.1% BSA in 5 tubes. Add 1 mg FGF-4 in 10 mL of sterile 0.1% BSA. Aliquot 250 µL into prechilled 40 microcentrifuge tubes and store at -80 °C.
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris	1254	The final concentration is 10 mM (10 mmol/L). Resuspend in DMSO at 10 mM and filter sterilize. Add 3 mL of sterile PBS to each vial. Aliqout 100 µL of ROCK inhibitor in 30 tubes and store at -20 °C.
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Thermo Scientific	11-754-250	N/A
SuperFrost Plus microscope slides
Tissue Tek O.C.T Compound	VWR	25608-930	N/A