إنتاج ناقلات الفيروسات المرتبطة أدينو في مداخن الخلايا للدراسات ما قبل السريرية في نماذج حيوانية كبيرة

Summary

هنا نقدم إجراء مفصلا لإنتاج واسع النطاق من ناقلات AAV من الدرجة البحثية باستخدام خلايا HEK 293 الملتصقة المزروعة في أكوام الخلايا وتنقية الكروماتوغرافيا التقارب. ينتج هذا البروتوكول باستمرار >1 × 10¹³ جينوم/مل متجه، مما يوفر كميات متجهة مناسبة للدراسات الحيوانية الكبيرة.

Abstract

تعد ناقلات الفيروسات المرتبطة بالأدينو من بين ناقلات العلاج الجيني الأكثر تقدما سريريا، مع اعتماد ثلاثة علاجات جينية AAV للبشر. التقدم السريري للتطبيقات الجديدة لAV ينطوي على الانتقال من نماذج الحيوانات الصغيرة، مثل الفئران، إلى نماذج حيوانية أكبر، بما في ذلك ال كلاب، والأغنام، والرئيسيات غير البشرية. أحد القيود المفروضة على إعطاء AAV للحيوانات الكبيرة هو شرط كميات كبيرة من فيروس التيتر العالي. في حين أن ثقافة الخلايا المعلقة هي طريقة قابلة للتطوير لإنتاج ناقلات AAV ، إلا أن القليل من مختبرات الأبحاث لديها المعدات (مثل المفاعلات الحيوية) أو تعرف كيفية إنتاج AAV بهذه الطريقة. وعلاوة على ذلك، فإن عوارض AAV غالبا ما تكون أقل بكثير عند إنتاجها في خلايا HEK 293 المعلقة مقارنة بخلايا HEK293 الملتصقة. وصف هنا هو وسيلة لإنتاج كميات كبيرة من AAV عالية titer باستخدام مداخن الخلية. كما يتم وصف بروتوكول مفصل لتكتيرينغ AAV وكذلك أساليب التحقق من صحة نقاء ناقلات. وأخيرا، يتم تقديم النتائج التمثيلية للتعبير المتحول بوساطة AAV في نموذج الأغنام. هذا البروتوكول الأمثل لإنتاج واسع النطاق من ناقلات AAV في الخلايا الملتصقة سيمكن مختبرات البيولوجيا الجزيئية من التقدم في اختبار علاجات AAV الجديدة في نماذج حيوانية أكبر.

Introduction

العلاج الجيني باستخدام ناقلات الفيروس المرتبطة أدينو (AAV) قد خطت خطوات كبيرة على مدى العقود الثلاثة الماضية^1,2. أظهرت التحسينات في مجموعة متنوعة من الأمراض الوراثية، بما في ذلك العمى الخلقي، والهيموفيليا، وأمراض الجهاز العصبي العضلي الهيكلي والمركزي، جلبت العلاج الجيني AAV إلى طليعة البحوث السريرية^3،4. في عام 2012، وافقت وكالة الأدوية الأوروبية (EMA) على غليبيرا، وهو ناقل AAV1 يعبر عن ليباز البروتين الدهني (LPL) لعلاج نقص LPL، مما يجعله أول تصريح تسويقي لعلاج العلاج الجيني في أوروبا أو الولايات المتحدة⁵. ومنذ ذلك الحين، حصل علاجان جينيان إضافيان من AAV، Luxturna⁶ و Zolgensma^7،على موافقة إدارة الأغذية والعقاقير، ومن المتوقع أن يتوسع السوق بسرعة على مدى السنوات ال 5 المقبلة مع ما يصل إلى 10-20 العلاجات الجينية المتوقعة بحلول عام 2025⁸. تشير البيانات السريرية المتاحة إلى أن العلاج الجيني AAV هو طريقة آمنة وجيدة التحمل وفعالة مما يجعله واحدا من أكثر ناقلات الفيروس الواعدة ، مع أكثر من 244 تجربة سريرية شملت AAV مسجلة مع ClinicalTrials.gov. الاهتمام المتزايد في التطبيقات السريرية التي تنطوي على ناقلات AAV يتطلب أساليب إنتاج قوية وقابلة للتطوير لتسهيل تقييم العلاجات AAV في النماذج الحيوانية الكبيرة، لأن هذا هو خطوة حاسمة في خط أنابيب⁹الترجمة .

لإنتاج ناقلات AAV ، فإن المتطلبات الرئيسية هما جينوم AAV و capsid. الجينوم من النوع البري (wt) - AAV هو الحمض النووي واحد تقطعت بهم السبل التي هي ما يقرب من 4.7 كيلو بايت في طول¹⁰. يضم جينوم wt-AAV تكرارات طرفية مقلوبة (ITRs) موجودة في طرفي الجينوم ، وهي مهمة للتغليف ، وجينات الممثل والغطاء ^11. تتم إزالة الجينات مندوب وسقف، اللازمة لتكرار الجينوم، وتجميع capsid الفيروسية، وتغليف الجينوم في capsid الفيروسية، من الجينوم الفيروسية وتقدم في ترانس لإنتاج ناقلات AAV¹². إن إزالة هذه الجينات من الجينوم الفيروسي يوفر مجالا للمتحولات العلاجية وجميع العناصر التنظيمية اللازمة، بما في ذلك المروج وإشارة تعدد الإرسال. تبقى ITRs في الجينوم ناقلات لضمان تكرار الجينوم السليم والتغليف الفيروسي^13،14. لتحسين حركية التعبير المتحول ، يمكن هندسة جينوم ناقلات AAV ليكون متكاملا ذاتيا ، مما يخفف من الحاجة إلى التحويل من تحويل الحمض النووي أحادية التقطعت بهم السبل إلى تحويل الحمض النووي المزدوج أثناء تكرار جينوم AAV ، ولكنه يقلل من قدرة الترميز إلى ~ 2.4 kb¹⁵.

وراء تصميم الجينوم AAV، اختيار النمط المصلي capsid يحدد الأنسجة والخلايا تروبية من ناقلات AAV في الجسم الحي². بالإضافة إلى التروبية الأنسجة، وقد ثبت مختلف الأنماط المصلية AAV لعرض مختلف الحركية التعبير الجيني¹⁶. على سبيل المثال، صنفت الزنكاريللي وآخرون¹⁷ أنماطا مصلية مختلفة للAV إلى أنماط مصلية منخفضة التعبير (AAV2 و3 و4 و5) وأنماط مصلية متوسطة التعبير (AAV1 و6 و8) وأنماط مصلية عالية التعبير (AAV7 و9). كما صنفوا الأنماط المصلية للAV إلى تعبير بطيء الظهور (AAV2 و3 و4 و5) أو تعبير سريع الظهور (AAV1 و6 و7 و8 و9). هذه التروبينات المتباينة وحركية التعبير الجيني ترجع إلى اختلافات الأحماض الأمينية في البروتينات الكابسيد، وتشكيلات البروتين capsid، والتفاعلات مع مستقبلات الخلايا المضيفة / المستقبلات المشتركة¹⁸. بعض capsids AAV لها خصائص مفيدة إضافية مثل القدرة على عبور حاجز الدم في الدماغ بعد الإدارة داخل الأوعية الدموية (AAV9) أو يقيمون في خلايا العضلات التي تعيش منذ فترة طويلة للتعبير عن المتحولين دائم (AAV6, 6.2FF, 8, و 9)^19,20.

تهدف هذه الورقة إلى تفصيل طريقة فعالة من حيث التكلفة لإنتاج ناقلات AAV عالية النقاء وعالية التأرت والبحث لاستخدامها في نماذج الحيوانات الكبيرة قبل السريرية. يتم إنتاج AAV باستخدام هذا البروتوكول باستخدام ثنائي البلازميد transfection في الكلى الجنينية البشرية (HEK) 293 الخلايا التي تزرع في مداخن الخلايا. وعلاوة على ذلك، تصف الدراسة بروتوكول لتنقية الكروماتوغرافيا تقارب كبريتات الهيبارين، والتي يمكن استخدامها للأنماط المصلية AAV التي تحتوي على نطاقات ربط الهيبارين، بما في ذلك AAV2، 3، 6، 6.2FF، 13، ودي جي^21،22.

وهناك عدد من أنظمة التعبئة والتغليف المتاحة لإنتاج ناقلات AAV. من بين هذه ، فإن استخدام نظامين مشتركين في العدوى ، حيث يتم احتواء جينات Rep و Cap وجينات مساعد الإعلان (E1A و E1B55K و E2A و E4orf6 و VA RNA) داخل بلازميد واحد (pHelper) ، له بعض المزايا العملية على طريقة العدوى الشائعة ثلاثية البلازميد (الثلاثية) ، بما في ذلك انخفاض تكلفة إنتاج البلازميد^23،24 . يجب أن يحيط ب PLASMID الجينوم AAV التي تحتوي على كاسيت التعبير transgene (pTransgene) ، من قبل ITRs ، ويجب ألا يتجاوز ~ 4.7 كيلوبايت في الطول. يمكن أن يتأثر تيتر الناقل والنقاء بالمتحول بسبب الآثار السامة للخلايا المحتملة أثناء العدوى. ويرد وصف لتقييم نقاء ناقلات الأمراض في هذه المسألة. تم تقييم ناقلات المنتجة باستخدام هذه الطريقة، والتي تسفر عن 1 ×^{10 13} vg/mL لكل منهما، في الفئران، الهامستر، والنماذج الحيوانية ovine.

الجدول 1: تكوين الحلول المطلوبة. المعلومات الضرورية، بما في ذلك النسب المئوية والأحجام، للمكونات اللازمة لمختلف الحلول في جميع أنحاء البروتوكول. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Protocol

1. مزدوجة plasmid transfection خلايا HEK293 في مداخن الخلية

1. إذابة قارورة التبريد من خلايا HEK293 في حمام حبة تعيين في 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: DMEM كاملة قبل الحارة إلى 37 درجة مئوية في حين أن الخلايا تذوب لضمان درجة الحرارة الباردة لا صدمة الخلايا عند الطلاء. تأكد من أن الخلايا لديها عدد مرور منخفض ، أقل من 20 بشكل مثالي ، لضمان النمو الأمثل وكفاءة العدوى. تأكد من أن الخلايا معتمدة لتكون خالية من الميكوبلازما.
2. نقل محتويات قارورة التبريد دروبوايز في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 10 مل من DMEM كاملة قبل الحارة والطرد المركزي الخلايا في 500 × ز لمدة 5 دقائق.
3. يستنشق وسائل الإعلام، ومن ثم إعادة إنفاق خلايا HEK293 في 20 مل من DMEM كاملة قبل الحارة. زرع الخلايا في لوحة 15 سم واحتضان في 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO_2.
4. تقسيم الخلايا من لوحة واحدة 15 سم إلى ثلاثة لزرع في غرفة ثقافة الخلية.
   1. مرة واحدة هي الخلايا التقاء 80٪، يستنشق وسائل الإعلام وغسل بلطف لوحة مع 3 مل من برنامج تلفزيوني لعدم تعطيل monolayer. ثم يستنشق برنامج تلفزيوني وإضافة 3 مل من التريبسين.
   2. احتضان لمدة 2 دقيقة في 37 درجة مئوية حتى الخلايا رفع من لوحة، ومن ثم تحييد التريبسين بإضافة 7 مل من DMEM كاملة إلى لوحة.
   3. جمع جميع وسائل الإعلام والخلايا في أنبوب 15 مل والكريه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقائق.
   4. يستنشق الناموست من أنبوب 15 مل وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 3 مل من DMEM كاملة. إضافة 1 مل لكل لوحة 15 سم تحتوي على 20 مل من DMEM كاملة; صخرة بلطف لوحات لتوزيع الخلايا بالتساوي، واحتضان في 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO₂.
5. مرة واحدة في الخلايا هي التقاء 80٪، كرر الخطوتين 1.4.1 و 1.4.2. جمع supernatant في أنابيب مخروطية 50 مل، وعكس بلطف أنبوب لضمان الخلايا متجانسة.
6. تحديد كثافة الخلية عن طريق خلط 10 ميكرولتر من عينات الخلايا مع 10 ميكرولتر من أزرق تريبان وإضافة الخليط إلى شريحة عد الخلايا للتحليل في عداد الخلية.
7. مزيج 1 لتر من DMEM كاملة قبل الحارة مع تعليق الخلية اللازمة لزرع غرفة ثقافة الخلية (مساحة سطح 6360 سم²) مع 1 × 10⁴ خلايا / سم². صب خليط الخلية في غرفة ثقافة الخلية وتدوير بلطف لتوزيع الخلايا بالتساوي عبر كل طبقة أحادية (الشكل 1) واحتضان في 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO_2.
8. بالإضافة إلى غرفة ثقافة الخلية، لوحة لوحة 15 سم مع 1 × 10⁴ خلايا / سم² كمرجع للالتقاء.
9. بعد ~ 65 ساعة حضانة ، والتحقق من لوحة مرجعية للالتقاء المثالي ~ 80 ٪ - 90 ٪ التقاء.
   ملاحظة: DMEM كاملة قبل الحارة لإضافة إلى غرفة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية.

الشكل 1: المناورة من كومة الخلية للبذر الخلية وtransfection. لتكديس الخلايا البذر، ابدأ بإزالة واحدة من قبعات تنفيس وصب في 1 لتر من DMEM كاملة قبل الحارة مع الكمية اللازمة من خلايا HEK293 (A). توزيع الخلايا والوسائط بالتساوي عن طريق تشديد كل من قبعات تنفيس وجلب جميع وسائل الإعلام إلى زاوية المكدس الخلية مع واحدة من قبعات تنفيس ووضعها في تلك الزاوية (ب)، وضع كومة الخلية على جانبها (C)، ومن ثم بدوره كومة الخلية 90 ° (D) بحيث منافذ تنفيس هي أعلى (هاء). خفض بلطف كومة الخلية إلى وضعها الأفقي العادي وضمان تغطية جميع الغرف من كومة الخلية تماما في وسائل الإعلام (F). عند التحويل، فك كل من قبعات تنفيس وتصب ببطء من وسائل الإعلام القديمة في حاوية النفايات العقيمة النفايات لتدفق حتى لا يزعج monolayer من الخلايا (G). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

10. إعداد البولي إيثيلينيمين (PEI) / خليط الحمض النووي بنسبة تركيز 3:1 (ث / ث).
    1. إعداد خليط الحمض النووي في أنبوب مخروطي 50 مل عن طريق إضافة 475 ميكروغرام من pTrangene و 1425 ميكروغرام من pHelper إلى 40 مل من المتوسطة منخفضة المصل لخلق نسبة 3:1 من pHelper:pTrangene.
       ملاحظة: يمكن العثور على آلة حاسبة خليط PEI/DNA باستخدام الجدول 2.
    2. أضف 5.7 مل من جزيرة الأمير إدوارد (1 غرام/لتر) إلى متوسط المصل المنخفض وخليط الحمض النووي بشكل إسقاطي. ثم دوامة لفترة وجيزة واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
       ملاحظة: كما PEI / الحمض النووي تحتضن في درجة حرارة الغرفة، وسوف تصبح غائمة قليلا.
11. بعد 8 دقائق من حضانة PEI / DNA ، قم بإزالة الوسائط من غرفة ثقافة الخلية.
    ملاحظة: تأكد من تخفيف كل من القبعات البرتقالية للحفاظ على تدفق سلس من وسائل الإعلام لتجنب إزاحة الخلايا.
12. إضافة PEI / DNA إلى 1 لتر من DMEM كاملة قبل الحارة، وتصب ببطء الخليط في ميناء غرفة ثقافة الخلية. توزيع السائل بالتساوي على جميع الصفوف (الشكل 1) واحتضان لمدة 72 ساعة في 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO₂.

2 حصاد AAV وتحلل كيميائي للخلايا HEK293 المصابة

1. هز غرفة ثقافة الخلية بقوة لطرد الخلايا حتى تظهر الوسائط غائمة من الخلايا المنزوعة وتتدفق إلى أربعة أنابيب طرد مركزي سعة 500 مل.
2. طرد مركزي الأنابيب في 18،000 × ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية لبيليه الخلايا. صب supernatant أوضح في 1 L البولي ايثيلين تيريفثالات كوبوليستر (PETG) زجاجة.
   ملاحظة: إذا لم يكن لدى الشخص إمكانية الوصول إلى جهاز طرد مركزي عالي السرعة، فإن جهاز الطرد المركزي يبلغ 12,000 × ز لمدة 40 دقيقة. قد لا تكون الخلايا الكريات صلبة بهذه السرعة وستنزلق على أنها تتدفق فائقة.
3. إعادة تشغيل الكريات الخلية في أنابيب الطرد المركزي 500 مل مع 50 مل من العازلة تحلل واحتضان لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية.
4. طاردة مركزية الأنابيب في 18،000 × ز لمدة 30 دقيقة، ومن ثم نقل supernatant في نفس زجاجة 1 L PETG. تجاهل حطام الخلية بيليه.
   ملاحظة: تنقية الفائقة الموضحة فورا وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة. للتخزين على المدى الطويل، تخزين في -80 درجة مئوية. لا تخزن عند -20 درجة مئوية.

3 AAV ناقلات تنقية باستخدام الكروماتوغرافيا تقارب الهيبارين

1. إزالة lysate الخام من -80 درجة مئوية وترك عند 4 °C بين عشية وضحاها لذوبان الجليد. وبمجرد إذابة الذوبان، استخدم فلتر 0.22 ميكرومتر لتصفية lysate الخام.
2. لتمرير المكثف الطرد المركزي، إضافة 4 مل من العازلة قبل المعالجة مرشح إلى مكثف الطرد المركزي لكل عمود سيبهاروز الهيبارين المستخدمة. Passivate المكثف الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-8 ساعة. إعداد التخميل مباشرة قبل خطوات التنقية.
3. إعداد الأنابيب والمضخة (الشكل 2).
   1. وضع الأنابيب في مضخة التجسيم وتشغيل 20 مل من 1 M NaOH. بعد ذلك، تشغيل 50 مل من المياه الجزيئية الصف، ومن ثم تشغيل 50 مل من DMEM القاعدية.
   2. إرفاق 5 مل هيبارين سيبهاروز العمود إلى أنابيب وتشغيل 25 مل من DMEM القاعدية لإزالة المواد الحافظة.
4. تشغيل 0.2 ميكرومتر من lysate الخام المصفاة من خلال العمود بمعدل تدفق 1-2 قطرات / ثانية.

الشكل 2: إعداد مضخة التجذيف لتنقية AAV. تشغيل أنابيب من lysate الخام، من خلال مضخة التمعج، وإلى عمود مصفوفة الهيبارين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملاحظة: تأكد من عدم إدخال فقاعات أو السماح للعمود بالجفاف، لأن هذا سيعرض العمود للخطر ويمنع نطق AAV. تجاهل العمود إذا كان يعمل الجافة واستخدام عمود جديد لبقية lysate الخام.

5. تحميل كافة lysate crude على عمود الهيبارين واستخدام الحلول التالية لغسل العمود.
   1. غسل باستخدام 50 مل من حلول الملح المتوازن هانك 1x (HBSS) دون ملغ^{2 +} وكا^{2 +}.
   2. غسل باستخدام 15 مل من 0.5 ٪ N-Lauroylsarcosine في HBSS دون ملغ²⁺ وكا²⁺.
   3. غسل باستخدام 50 مل من HBSS دون ملغ^{2 +} وكا^{2 +}.
   4. غسل باستخدام 50 مل من HBSS مع ملغ^{2 +} وكا^{2 +}
   5. غسل باستخدام 50 مل من 200 م م NaCl / HBSS مع Mg2 + وكا^{2 +}.
   6. Elute 5 × 5 مل (25 مل المجموع) مع 300 mM من NaCl / HBSS مع ملغ^{2 +} وكا^{2 +} وتسمية elutions كما E1 - E5 (كل elution هو من 5 مل).
6. تركيز الفيروس باستخدام جهاز طرد مركزي
   1. قم بتدفير المكثف الطردي الذي يحتوي على العازلة قبل المعالجة عند 900 × ز لمدة دقيقتين. تجاهل التدفق من خلال.
   2. غسل فلتر المكثف الطرد المركزي مع 4 مل من HBSS مع ملغ^{2 +} وكا^{2 +} والطرد المركزي في 1000 × ز لمدة 2 دقيقة؛ تجاهل التدفق من خلال.
   3. أضف elution E2 إلى جهاز الطرد المركزي المكثف. تدور في 1000 × ز لمدة 5 دقائق وتجاهل تدفق من خلال.
   4. الانتهاء من إضافة E2 ثم إضافة E3 إلى مركز الطرد المركزي وتدور في 1000 × ز لمدة 5 دقائق حتى الفيروس المركز هو ما يقرب من 1 مل.
      ملاحظة: تجنب الطرد المركزي المتجه بحيث تكون وحدة التخزين أقل من مستوى عامل التصفية. لا تركز E1 أو E4 أو E5 في مركز الطرد المركزي ، لأنها تحتوي على القليل جدا من النواقل أو لا تحتوي على ملوثات.
   5. إزالة الفيروس المركز من المكثف الطرد المركزي باستخدام طرف P200 المصفاة ووضعه في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل معقمة.
   6. شطف المكثف الطرد المركزي مع 200 ميكرولتر من HBSS مع ملغ^{2 +} وكا^{2 +} لطرد أي AAV المتبقية من المرشح. ماصة صعودا وهبوطا بقوة عدة مرات (ل~ 30 ق) لطرد أي فيروس انضمت إلى الغشاء ومكان في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل مع ما تبقى من الفيروس. خلط أنبوب جيدا.
   7. Aliquot 5 ميكرولتر لاستخراج الحمض النووي وتخزين ناقلات تنقية في -80 درجة مئوية.
7. اغسل العمود باستخدام 25 مل من 2 M NaCl. علاوة على ذلك، استخدم 25 مل من 0.1٪ تريتون X-100، قبل تسخينها إلى 37 درجة مئوية لغسل العمود. بعد ذلك، اغسل العمود باستخدام 50 مل من dH₂O المعقم، ثم اغسله باستخدام 25 مل من الإيثانول بنسبة 20٪.
8. تأكد من تشبع غشاء العمود بالكامل في الإيثانول بنسبة 20٪، لأن هذا هو محلول التخزين. ختم العمود مع المقابس المقدمة وتخزينها في 4 درجة مئوية.
9. تخزين الأنابيب في 1 M NaOH.
   ملاحظة: إذا تم تنظيفها بشكل صحيح، يمكن إعادة استخدام أعمدة سيبهاروز الهيبارين حتى خمس مرات.

4 استخراج الحمض النووي الجينومي AAV

1. إعداد مزيج رد الفعل المذكورة في الجدول 3 في أنبوب PCR لعلاج DNase.

مكون	حجم
ناقل AAV منقى	5 ميكرولتر
10x المخزن المؤقت DNase	2 ميكرولتر
DNase	1 ميكرولتر
ddH2O	12 ميكرولتر
المجلد النهائي	20 ميكرولتر

الجدول 3: تركيبة مزيج العلاج الرئيسي DNase. المكونات والأحجام الموصى بها اللازمة لعلاج DNase من ناقلات AAV الفيروسية أثناء استخراج الحمض النووي.

2. دوامة أنبوب PCR لخلط ونبض أنبوب PCR لتدور أسفل المحتويات.
3. باستخدام دراجة حرارية، واحتضن في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تليها 75 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتسخين تعطيل DNase.
4. إضافة 5 ميكرولتر من بروتيناز K.
5. باستخدام دراجة حرارية، واحتضان في 50 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ومن ثم في 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتسخين بروتيناز K.
6. استخدم مجموعة تنظيف الحمض النووي لإزالة الملوثات المحتملة.
   ملاحظة: تم تنفيذ هذه الخطوة باستخدام مجموعة تنظيف الدم والأنسجة المتاحة تجاريا(جدول المواد).
   1. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة AL (الدم والأنسجة تنظيف عدة، جدول المواد)إلى أنبوب PCR التي تحتوي على ناقلات DNase / Proteinase K المعالجة.
   2. دوامة أنبوب PCR واحتضان في 56 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في دراجة حرارية.
   3. ماصة السائل من أنبوب PCR في عمود تدور عقيمة يجلس في أنبوب جمع.
   4. إضافة 200 ميكرولتر من الإيثانول 100٪ إلى العمود وتخلط جيدا عن طريق الدوامة.
   5. جهاز الطرد المركزي في 6000 س غ لمدة دقيقة واحدة وتجاهل تدفق من خلال.
   6. إضافة 500 ميكرولتر من AW1 العازلة (الدم والأنسجة تنظيف عدة، جدول المواد)إلى العمود تدور.
   7. جهاز الطرد المركزي في 6000 س غ لمدة دقيقة واحدة وتجاهل تدفق من خلال.
   8. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة AW2 (الدم والأنسجة تنظيف عدة، جدول المواد)إلى العمود تدور.
   9. جهاز الطرد المركزي في 15،000 × ز لمدة 3 دقائق والتخلص من تدفق من خلال.
   10. ضع عمود الدوران في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 1.5 مل وأضف 200 ميكرولتر من العازلة AE (طقم تنظيف الدم والأنسجة ، جدول المواد) مباشرة إلى غشاء العمود الدوراني.
   11. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
   12. جهاز طرد مركزي على 6000 x gلمدة دقيقة واحدة ل elute الحمض النووي.
   13. تخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية.

5 المعايرة من الجينوم ناقلات AAV باستخدام تفاعل سلسلة البوليميراز الكمي وفيروس سيميان 40 (SV40) التحقيق

ملاحظة: قم بإجراء جميع أعمال qPCR في غطاء محرك السيارة PCR باستخدام نصائح ماصة تمت تصفيتها لتجنب تلوث الحمض النووي الخارجي. إذا لم ترميز الجينوم AAV تسلسل بوليا SV40، استخدم مسبار ضد ITR وصفها في مكان آخر²⁵. تأكد من أن الحمض النووي البلازميد المحدد كمعيار يحتوي على تسلسل SV40 polyA.

1. إعداد معيار المخزون
   1. تمييع معيار الحمض النووي للمخزون (pTransgene plasmid الذي يحتوي على تسلسل بولي أ SV40) إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام / ميكرولتر وتخزينه عند -20 درجة مئوية في 6 ميكرولتر من الاقتباسات.
   2. تحديد عدد النسخ الموجودة في معيار الحمض النووي plasmid باستخدام آلة حاسبة على الانترنت التالية²⁶.
      ملاحظة: استخدم حمضا نوويا بلازما يستخدم للمعيار الذي ينتجه بائع تجاري لضمان الجودة والتركيز الصحيح. إعداد كمية كبيرة من المعايير (على سبيل المثال، 10 مل) لإجراء دراسات انتقالية عند الانتقال إلى معيار تم إعداده حديثا.
2. إعداد مزيج الكاشف التالي المذكور في الجدول 4 لكل من العينات والمعيار في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل.
   ملاحظة: تحضير الإفراط كافية من المزيج الرئيسي. انظر الجدول 5 للاطلاع على تسلسلات التمهيدي/المسبار.

مكون	حجم
مزيج qPCR الرئيسي العالمي (2X)	10 ميكرولتر
المياه الصف الجزيئي	4.5 ميكرولتر
40x SV40 التمهيدي بوليA / التحقيق	0.5 ميكرولتر
المجلد النهائي	15 ميكرولتر

الجدول 4: مزيج qPCR الرئيسي ل AAV المعايرة. المكونات والأحجام الموصى بها المطلوبة لqPCR من الحمض النووي المستخرج من ناقلات الفيروس AAV.

مكون	تسلسل
التمهيدي الأمامي	5'-أكغاتاغاكاتاكاكااتاتاكا-3'
التمهيدي العكسي	5'-CCاغاكاتاغاتاكاتاغاغاغات-3'
مجس	/56-فام/أغكاتت/زين/تيتكاتغكاتكاتشتغغغتغتغغتغتك/3IABkFQ

الجدول 5: تسلسلات التمهيدي ضد تسلسل الحمض النووي ل SV40 polyA. تسلسلات من التمهيديات والتحقيق المستخدمة لqPCR المعايرة، والتي تربط إلى مناطق محددة من ناقلات الفيروسية AAV التي تحتوي على تسلسل بوليا SV40.

3. Pipette سيد خلط صعودا وهبوطا لخلط.
4. إعداد لوحة التخفيف.
   1. استخدم لوحة واضحة من 96 بئرا لإعداد المخففات القياسية والعينة ، وإضافة 45 ميكرولتر من الماء الجزيئي إلى كل بئر في كل عمود آخر بدءا من العمود 1 (الأعمدة 1 و 3 و 5 و 7 و 9 و 11).
   2. إضافة 5 ميكرولتر من المعيار إلى A1 جيدا وماصة لخلط.
   3. استخدام تلميح ماصة تصفية جديدة لخلق تخفيف 1/10 من A1 جيدا إلى B1.
   4. استمر في سلسلة من التخفيفات ذات 10 أضعاف أسفل العمود حتى الوصول إلى G1.
   5. لا تقم بإضافة إلى H1، لأن هذا سيكون بمثابة عنصر تحكم سلبي.
   6. تطبيق العينة الأولى (S1) بإضافته إلى A3 جيدا، وتشكيل تخفيف 1/10. ماصة هذا الخليط ونقل 5 ميكرولترتو جيدا B3. تجاهل تلميح ماصة بعد هذا النقل.
   7. مع طرف ماصة جديدة، مزيج الحل في B3 جيدا وتشكيل تخفيف 1/100. نقل 5 μLof هذا الخليط إلى C3 جيدا وتجاهل تلميح بعد نقل.
   8. مع طرف ماصة جديدة، ماصة صعودا وهبوطا الحل في C3 جيدا لجعل تخفيف 1/1000. تجاهل الطرف.
   9. استمر في تخفيف العينات دون إضافة أي عينات إلى الأعمدة 2 أو 4 أو 6 أو 8 أو 10 أو 12.
   10. بمجرد أن يتم تخفيف جميع العينات، اخلط المحتويات في آبار العمود 1، ثم قم بنقل 20 ميكرولتر إلى العمود 2.
   11. كرر هذا للأعمدة 3 و 5 و 7 و 9 و 11 لإنشاء نسخ متماثلة من كل معيار و عينة التخفيف. راجع الشكل 3 لتخطيط اللوحة.
       ملاحظة: عند اتباع إعداد لوحة في الشكل 3، عينات مخففة في الصفين G و H سيكون فقط 1/10 و 1/100 التخفيفات.

الشكل 3: تخطيط لوحة لqPCR AAV المعايرة. يشير اللون الأزرق إلى موضع التخفيف التسلسلي للمعيار؛ الأخضر يشير إلى موضع السيطرة السلبية؛ الأرجواني يشير إلى وضع التخفيف من العينات. تتم إضافة كل معيار أو سالب أو عينة في النسخ المتماثل. وقد أضيف مثال لتركيز المعيار لإظهار سلسلة التخفيف من المعيار، وأضيفت إلى الآبار الخاصة بهم موضع تخفيف العينة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. المعايرة بواسطة SV40 متعددة الأسلحة القائمة على qPCR
   1. إضافة 15 ميكرولتر من مزيج QPCR الرئيسي إلى كل بئر من لوحة qPCR أبيض شبه ملتف 96 جيدا.
   2. نقل 5 ميكرولتر من كل عينة من لوحة واضحة 96 جيدا إلى الأبيض شبه التفاف 96 لوحة qPCR جيدا.
   3. استخدام ماصة متعددة القنوات لضمان خلط كافية من مزيج QPCR الرئيسي وعينة.
   4. ختم لوحة مع فيلم الختم والطرد المركزي لوحة qPCR في 1500 × ز لمدة 30 s.
   5. تشغيل رد فعل qPCR على لوحة المستندة إلى اللوحة في الوقت الحقيقي PCR التضخيم والكشف عن الصك، وذلك باستخدام الشروط المقترحة في الجدول 6.

قسم	دورات	الوقت	درجة الحرارة	وصف
ما قبل الحضانة	1x	5 دقائق	95 درجة مئوية	إشباع الحمض النووي.
التضخيم	38x	15 ق	95 درجة مئوية	تضخيم الحمض النووي. يمكن تعديل الإعدادات إذا كنت تستخدم التمهيديات البديلة بدرجات حرارة تمي مختلفة.
		60 ق	60 درجة مئوية
تبريد	1x	60 ق	40 درجة مئوية	تبريد اللوحة. نهاية الشوط.

الجدول 6: بروتوكول Thermocycler لإجراء عملية التحلل المائي لكمية التحلل القائم على qPCR. الموصى بها بروتوكول thermocycler لاستخدام التحقيق القائم على qPCR المعايرة من الحمض النووي المستخرج ناقلات AAV المنقى.

ملاحظة: للحصول على ورقة عمل المعايرة AAV qPCR راجع الجدول 7.

6. تحليل البيانات لتحديد أرقام نسخ الجينوم AAV.
   1. تعبئة خلايا بيانات جدول البيانات(الجدول 7A)مع قيم التركيز التي تم الحصول عليها من تشغيل qPCR لكل من المخففات القياسية والعينة.
   2. استخدام قيم التركيز من الجدول 7A لإنتاج منحنى قياسي(الجدول 7B).
      ملاحظة: سيتم عرض المنحنى القياسي كلوغاريتم طبيعي (y = ln (x) + b) مع كفاءة R^2. يجب أن يكون للمنحنى القياسي كفاءة قريبة من 100٪ وR² قريبة من 1.0 (≥0.99).
   3. ملء كفاءة المنحدر عن طريق ملء هذه الآلة الحاسبة على الانترنت²⁷.
      ملاحظة: كفاءة بين 90٪-110٪ مقبول. إذا كانت كفاءة qPCR خارج هذا النطاق، إعادة تشغيل qPCR.
   4. استخدام قيم التركيز من الجدول 7A إلى متوسط التخفيفات من كل عينة وتحديد الانحراف المعياري لكل عينة (الجدول 7C).
      ملاحظة: استبعاد التخفيفات من العينات التي هي أكثر من انحراف معياري واحد بعيدا عن متوسط مخففات العينة.
   5. باستخدام متوسط تركيز كل تخفيف، تتكاثر بعامل التخفيف، ثم تقسيم على خمسة للحصول على الجينوم ناقلات (vg)/μL من كل عينة (الجدول 7C).
   6. حساب vg/mL من كل عينة بضرب متوسط تركيزات كل عينة في 80000 (الجدول 7C).
   7. متوسط vg/ مل من كل تخفيف لإنتاج vg/ مل النهائي من كل عينة (الجدول 7C).
      ملاحظة: يجب على المستخدم تقسيم متوسط تركيز كل تخفيف على عامل خمسة لحساب 5 ميكرولتر محملة في كل بئر لتشغيل qPCR لإنتاج التركيز في vg/μL. ويمثل عامل 000 80 عامل الانتقال من متوسط قيمة تركيز كل عينة إلى vg/mL. أولا، يجب ضرب متوسط قيمة تركيز كل عينة في 2 لحساب الجينوم واحد تقطعت بهم السبل، كما مجموعة التمهيدي التحقيق فقط يحدد كميا إيجابية الشعور، واحد تقطعت بهم السبل الحمض النووي (ssDNA)، والجينوم AAV موجود في نسبة 1:1 تقريبا بين الموجبة والسلبية ssDNA^25،28. يجب ضرب متوسط قيمة تركيز كل عينة x40 لمراعاة تخفيف العينة من 5 ميكرولتر من المتجه المنقى (القسم 4.1) إلى 200 ميكرولتر من الحمض النووي المستخرج (القسم 4.6.12). وأخيرا، يجب ضرب متوسط قيمة تركيز كل عينة x1000 لتحويلها من vg/μL إلى vg/mL.

6 تقييم جودة النواقل ونقاوتها

1. مراقبة الجودة - بلوت الغربية
   1. إعداد هلام صفحة SDS 12٪.
   2. أداء البولي أكريلاميد هلام الكهربائي.
      ملاحظة: تحميل 6 × 10¹⁰ vg من العينات لكل بئر.
   3. نقل البروتينات إلى غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيلدين (PVDF).
   4. حجب غشاء PVDF
      1. إزالة الغشاء من جهاز نقل وشطف في 0.1٪ PBST لإزالة الأكريلاميد فضفاضة.
      2. ضع الغشاء في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
         ملاحظة: يمكن استكمال العازلة حجب مع مصل الماعز 2٪.
   5. حضانة مع الأجسام المضادة الأولية
      1. Decant العازلة حجب وإضافة الأجسام المضادة الأولية ، وهو مضاد للماوس AAV الأجسام المضادة أحادية النسيلة في تخفيف 1:200.
      2. حضانة بين عشية وضحاها في 4 °C.
      3. decant الأجسام المضادة الأساسية وغسل خمس مرات مع 0.1٪ PBST لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التحريض.
   6. حضانة مع الأجسام المضادة الثانوية
      1. decant محلول الغسيل وإضافة HRP الأجسام المضادة الثانوية المقترنة، المخفف في 1:7500 في العازلة حجب، واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع التحريض.
      2. Decant الأجسام المضادة الثانوية وغسل خمس مرات مع 0.1٪ PBST لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التحريض.
      3. إجراء غسل النهائي مع برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة مع التحريض.
   7. الكشف عن البروتينات باستخدام الركيزة المحسنة chemiluminescent (ECL).
   8. صورة هلام لتصور البروتينات الفيروسية (VP1، VP2، و VP3 الوحدات الفرعية)(الشكل 4).

الشكل 4: لطخة الغربية تظهر البروتينات كابسيد AAV. حارة A; سلم ميغاواط، لين ب؛ AAV6.2FF-hIgG01, حارة C; AAV6.2FF-hIgG02, لين D; AAV6.2FF-hIgG03، ولين E؛ AAV6.2FF-hIgG04. 6 × 10¹⁰ vg من كل AAV6.2FF-hIgG تم تحميلها في الممرات الخاصة بهم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. التحكم في النقاء - SDS PAGE وكوماسي ستين
   1. إعداد هلام SDS-PAGE وعينات كما هو موضح من الخطوة 6.1.1 و 6.1.2.
   2. إصلاح هلام في حل تحديد لمدة 1 ساعة أو بين عشية وضحاها مع التحريض لطيف. تغيير حل الإصلاح مرة واحدة خلال الساعة الأولى.
   3. وصمة عار الجل في محلول تلطيخ لمدة 2-4 ساعة مع التحريض لطيف.
   4. ديستان الجل مع حل إزالة التين. تجديد محلول إزالة التلطيخ عدة مرات حتى يتم إزالة اللون بالكامل من خلفية الجل (4-24 ساعة).
   5. تخزين هلام destained في حل التخزين.
   6. صورة هلام لتصور جميع البروتينات الملطخة محلول تلطيخ Coomassie.

الشكل 5: كوماسي الملطخة هلام. حارة A; سلم ميغاواط، لين ب؛ AAV6.2FF-hIgG01, حارة C; AAV6.2FF-hIgG02, لين D; AAV6.2FF-hIgG03, لين E; AAV6.2FF-hIgG04, لين F; AAV6.2FF-hIgG05، ولين G؛ AAV6.2FF-hIgG06. 6 × 10¹⁰ vg من كل AAV6.2FF-hIgG تم تحميلها في الممرات الخاصة بهم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. اختبار التحكم البديل في النقاء - HEK293 الكشف عن بروتين الخلية المضيفة ELISA
   1. قم بإجراء الكشف عن بروتين الخلية المضيفة HEK293 عبر ELISA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: استخدم المخففات من 5 × 10^-2 و 1 × 10^-3 لعينات rAAV المنقى. بمجرد إضافة TMB إلى البئر ، احتضن بعيدا عن الضوء. لا يمكن استخدام الانحدار الخطي لتحليل النتائج.
   2. إجراء تحليل من نقطة إلى نقطة، أو خط مكعب، أو طريقة تناسب لوجستية من أربع معلمات لاستيفاء تركيزات المجهولات والتكاثر بعامل التخفيف لتحديد تركيز العينة الأصلي.

النتائج

الترجمة من نماذج القوارض الصغيرة إلى نماذج حيوانية أكبر والتطبيق السريري في نهاية المطاف يمثل تحديا كبيرا بسبب كمية كبيرة من AAV المطلوبة لتحويل الحيوانات الكبيرة وتحقيق الآثار العلاجية. لمقارنة كفاءة نقل AAV6.2FF capsid المصممة بشكل عقلاني ، أظهرت سابقا زيادة 101 مرة في كفاءة النقل في خلايا عضلة ...

Discussion

يستخدم إنتاج ناقلات AAV المؤتلفة (rAAV) الموصوفة في هذه الورقة المواد والكواشف والمعدات الشائعة الموجودة في غالبية مختبرات ومرافق أبحاث البيولوجيا الجزيئية. تسمح هذه الورقة لإنتاج عالية الجودة في المختبر وفي الصف في الجسم الحي rAAV من قبل القارئ. وقبل كل شيء، فإن هذا البروتوكول لإنتا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Millipore Sigma	S2GPU05RE
0.25% Trypsin	Fisher Scientific	SM2001C
1-Butanol	Thermo Fisher Scientific	A399-4	CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
10 chamber cellstack	Corning	3271
1L PETG bottle	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
30% Acrylamide/Bis Solution	Bio-Rad	1610158
96-well skirted plate	FroggaBio	FS-96
Adhesive plate seals	Thermo Fisher Scientific	08-408-240
Ammonium persulfate (APS)	Bio-Rad	161-0700	CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Blood and Tissue Clean up Kit	Qiagen	69506	Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol
Bromophenol blue	Fisher Scientific	B392-5	CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Cell Culture Dishes	Greiner bio-one	7000232	15 cm plates
Culture Conical Tube	Thermo Fisher Scientific	339650	15 mL conical tube
Culture Conical Tube	Fisher Scientific	14955240	50 mL conical tube
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
ECL Western Blotting Substrate	Thermo Fisher Scientific	32209
Ethanol	Greenfield	P016EA95	Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38-500	CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Glycine	Fisher Scientific	BP381-500
HBSS with Mg2+ and Ca2+	Thermo Fisher Scientific	SH302268.02
HBSS without Mg2+ and Ca2+	Thermo Fisher Scientific	SH30588.02
HEK293 cells	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer’s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots
HEK293 host cell protein ELISA kit	Cygnus Technologies	F650S	Follow manufacturer’s instructions
Heparin sulfate column	Cytiva Life Sciences	17040703
Kimwipe	Thermo Fisher Scientific	KC34120
L-glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	SH30034.02
Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion	Corning	CLS431124	Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions
Large Volume Centrifuge Tubes	Corning	CLS431123-6EA	500 mL centrifuge tubes
MgCl2	Thermo Fisher Scientific	7791-18-6
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	05-408-129	1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use
Molecular Grade Water	Cytiva Life Sciences	SH30538.03
N-Lauroylsarcosine sodium salt	Sigma Aldrich	L5125	CAUTION. Wear gloves
NaCl	Thermo Fisher Scientific	BP35810
Optimem, reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific	31985070
Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20D	Sterilize prior to use
PBS (10x)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Dilute to 1x for use on cells
Penicillin-Streptomycin Solution	Cytiva Life Sciences	SV30010
pHelper plasmid	De novo design or obtained from plasmid repository	NA
Pipet basin	Thermo Fisher Scientific	13-681-502	Purchase sterile pipet basins
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	Thermo Fisher Scientific	9002-93-1	CAUTION. Wear gloves
Polyethylenimine (PEI)	Polyscience	24765-1	Follow manufacturer’s instructions to produce a 1L solution. 0.22μm filter and store at 4°C
Polypropylene semi-skirted PCR Plate	FroggaBio	WS-96
Polysorbate 20 (Tween 20)	Thermo Fisher Scientific	BP337-100	CAUTION. Wear gloves
polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Cytiva Life Sciences	10600023	Use forceps to manipulate. Wear gloves.
Primary antibody	Progen	65158
Protein Ladder	FroggaBio	PM008-0500
Proteinase K	Thermo Fisher Scientific	AM2546
pTrangene plasmid	De novo design or obtained from plasmid repository	NA	Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0
Pump tubing	Cole-Parmer	RK-96440-14	Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5
RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer	Promega	M6101	Use at 10x concentration in protocol from section 4.0
RQ1 Rnase-free Dnase	Promega	M6101
Sample dilutent	Cygnus Technologies	I700	Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit
Secondary antibody, HRP	Thermo Fisher Scientific	G-21040
Skim milk powder	Oxoid	LP0033B
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Thermo Fisher Scientific	28312	CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Sodium hydroxide (NaOH)	Thermo Fisher Scientific	SS266-4
SV40 polyA primer probe	IDT		Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Thermo Fisher Scientific	15524010	CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-5
Trypan blue	Bio-Rad	1450021
Ultra-Filter	Millipore Sigma	UFC810024	Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff
Universal Nuclease for cell lysis	Thermo Fisher Scientific	88702
Universal qPCR master mix	NEB	M3003L
Whatman Paper	Millipore Sigma	WHA1001325
β-mercaptoethanol	Fisher Scientific	21985023	CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
CAUTION: Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals.