Büyük Hayvan Modellerinde Preklinik Çalışmalar İçin Hücre Yığınlarında Adeno İlişkili Virüs Vektörlerinin Üretimi

Özet

Burada, hücre yığınlarında yetişen yapışan HEK 293 hücrelerini ve benzeşim kromatografisi saflaştırmayı kullanarak araştırma sınıfı AAV vektörlerinin büyük ölçekli üretimi için ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz. Bu protokol sürekli olarak >1 x 10¹³ vektör genomları /mL verir ve büyük hayvan çalışmaları için uygun vektör miktarları sağlar.

Özet

Adeno ilişkili virüs (AAV) vektörleri, insanlar için onaylanmış üç AAV gen tedavisi ile klinik olarak en gelişmiş gen tedavisi vektörleri arasındadır. AAV için yeni uygulamaların klinik ilerlemesi, fareler gibi küçük hayvan modellerinden köpekler, koyunlar ve insan olmayan primatlar da dahil olmak üzere daha büyük hayvan modellerine geçişi içerir. AAV'yi daha büyük hayvanlara uygulamanın sınırlamalarından biri, büyük miktarlarda yüksek titre virüsü gereksinimidir. Süspansiyon hücre kültürü AAV vektör üretimi için ölçeklenebilir bir yöntem olsa da, çok az araştırma laboratuvarı ekipmana (örneğin biyoreaktörler) sahiptir veya bu şekilde AAV'nin nasıl üretileceği hakkında bilir. Ayrıca, AAV titreleri süspansiyon HEK 293 hücrelerinde üretildiğinde, yapışan HEK293 hücrelerine kıyasla genellikle önemli ölçüde daha düşüktür. Burada açıklanan hücre yığınları kullanarak yüksek titre AAV büyük miktarlarda üretmek için bir yöntemdir. AAV'yi titretmeye yönelik ayrıntılı bir protokol ve vektör saflığını doğrulama yöntemleri de açıklanmıştır. Son olarak, bir koyun modelinde AAV aracılı transgene ekspresyonunun temsili sonuçları sunulmuştur. AAV vektörlerinin yapışan hücrelerde büyük ölçekli üretimi için optimize edilmiş bu protokol, moleküler biyoloji laboratuvarlarının yeni AAV tedavilerinin daha büyük hayvan modellerinde test edilmesini ilerletmesini sağlayacaktır.

Giriş

Adeno ilişkili virüs (AAV) vektörlerini kullanan gen tedavisi son otuz yılda büyük adımlar attı^1,2. Konjenital körlük, hemofili ve kas-iskelet sistemi ve merkezi sinir sistemi hastalıkları da dahil olmak üzere çeşitli genetik hastalıklarda ortaya konan gelişmeler, AAV gen tedavisini klinik araştırmalarda ön plana çıkarmıştır^3,4. 2012 yılında, Avrupa İlaç Ajansı (EMA), LPL eksikliğinin tedavisi için lipoprotein lipazını (LPL) ifade eden bir AAV1 vektörü olan Glybera'yı onayladı ve avrupa veya Amerika Birleşik^{Devletleri'nde}bir gen....

Protokol

1. Hücre yığınlarındaki HEK293 hücrelerinin çift plazmid transfeksiyon

1. 37 °C'de ayarlanmış bir boncuk banyosunda hek293 hücrelerinin kriyo şişelerini çözün.
   NOT: Soğuk sıcaklığın kaplama sırasında hücreleri şoklamamasını sağlamak için hücreler çözülürken, önceden ısınan komple DMEM ila 37 °C. Optimum büyüme ve transeksiyon verimliliği sağlamak için hücrelerin ideal olarak 20'den az düşük geçiş sayısına sahip olduğundan emin olun. Hücrelerin mikoplazma içermediğinin onaylı olduğundan emin olun.
2. Kriyo şişesinin içeriğini damla yönünde 10 mL önceden ısıtılmış komple DMEM içeren 15 mL konik bir tüpe aktarın ve hücreleri 5 dakika boyunca 500 x g'....

Sonuçlar

Küçük kemirgen modellerinden daha büyük hayvan modellerine ve nihai klinik uygulamaya çeviri, daha büyük hayvanları transdüze etmek ve terapötik etkiler elde etmek için gereken büyük miktarda AAV nedeniyle önemli bir zorluk ortaya sömektedir. Rasyonel olarak tasarlanmış AAV6.2FF kapsidinin transdüksiyon verimliliğini karşılaştırmak için, daha önce AAV6^3'ekıyasla murine kas hücrelerinde transdüksiyon verimliliğinde 101 kat artış gösterdi, fareler, hamsterlar ve kuzu.......

Tartışmalar

Bu makalede açıklanan rekombinant AAV (rAAV) vektörlerinin üretimi, moleküler biyoloji araştırma laboratuvarlarının ve tesislerinin çoğunda bulunan ortak malzemeler, reaktifler ve ekipmanlar kullanmaktadır. Bu makale, okuyucu tarafından yüksek kaliteli in vitro ve in vivo sınıf rAAV üretilmesini sağlar. Her şeyden önce, rAAV üretimi için bu protokol, sezyum klorür saflaştırmayı içeren daha sıkıcı protokollere kıyasla verimlidir ve ultrasantrifüj kullanımını önler. HEK.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Millipore Sigma	S2GPU05RE
0.25% Trypsin	Fisher Scientific	SM2001C
1-Butanol	Thermo Fisher Scientific	A399-4	CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
10 chamber cellstack	Corning	3271
1L PETG bottle	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
30% Acrylamide/Bis Solution	Bio-Rad	1610158
96-well skirted plate	FroggaBio	FS-96
Adhesive plate seals	Thermo Fisher Scientific	08-408-240
Ammonium persulfate (APS)	Bio-Rad	161-0700	CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Blood and Tissue Clean up Kit	Qiagen	69506	Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol
Bromophenol blue	Fisher Scientific	B392-5	CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Cell Culture Dishes	Greiner bio-one	7000232	15 cm plates
Culture Conical Tube	Thermo Fisher Scientific	339650	15 mL conical tube
Culture Conical Tube	Fisher Scientific	14955240	50 mL conical tube
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
ECL Western Blotting Substrate	Thermo Fisher Scientific	32209
Ethanol	Greenfield	P016EA95	Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38-500	CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Glycine	Fisher Scientific	BP381-500
HBSS with Mg2+ and Ca2+	Thermo Fisher Scientific	SH302268.02
HBSS without Mg2+ and Ca2+	Thermo Fisher Scientific	SH30588.02
HEK293 cells	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer’s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots
HEK293 host cell protein ELISA kit	Cygnus Technologies	F650S	Follow manufacturer’s instructions
Heparin sulfate column	Cytiva Life Sciences	17040703
Kimwipe	Thermo Fisher Scientific	KC34120
L-glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	SH30034.02
Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion	Corning	CLS431124	Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions
Large Volume Centrifuge Tubes	Corning	CLS431123-6EA	500 mL centrifuge tubes
MgCl2	Thermo Fisher Scientific	7791-18-6
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	05-408-129	1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use
Molecular Grade Water	Cytiva Life Sciences	SH30538.03
N-Lauroylsarcosine sodium salt	Sigma Aldrich	L5125	CAUTION. Wear gloves
NaCl	Thermo Fisher Scientific	BP35810
Optimem, reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific	31985070
Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20D	Sterilize prior to use
PBS (10x)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Dilute to 1x for use on cells
Penicillin-Streptomycin Solution	Cytiva Life Sciences	SV30010
pHelper plasmid	De novo design or obtained from plasmid repository	NA
Pipet basin	Thermo Fisher Scientific	13-681-502	Purchase sterile pipet basins
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	Thermo Fisher Scientific	9002-93-1	CAUTION. Wear gloves
Polyethylenimine (PEI)	Polyscience	24765-1	Follow manufacturer’s instructions to produce a 1L solution. 0.22μm filter and store at 4°C
Polypropylene semi-skirted PCR Plate	FroggaBio	WS-96
Polysorbate 20 (Tween 20)	Thermo Fisher Scientific	BP337-100	CAUTION. Wear gloves
polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Cytiva Life Sciences	10600023	Use forceps to manipulate. Wear gloves.
Primary antibody	Progen	65158
Protein Ladder	FroggaBio	PM008-0500
Proteinase K	Thermo Fisher Scientific	AM2546
pTrangene plasmid	De novo design or obtained from plasmid repository	NA	Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0
Pump tubing	Cole-Parmer	RK-96440-14	Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5
RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer	Promega	M6101	Use at 10x concentration in protocol from section 4.0
RQ1 Rnase-free Dnase	Promega	M6101
Sample dilutent	Cygnus Technologies	I700	Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit
Secondary antibody, HRP	Thermo Fisher Scientific	G-21040
Skim milk powder	Oxoid	LP0033B
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Thermo Fisher Scientific	28312	CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Sodium hydroxide (NaOH)	Thermo Fisher Scientific	SS266-4
SV40 polyA primer probe	IDT		Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Thermo Fisher Scientific	15524010	CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-5
Trypan blue	Bio-Rad	1450021
Ultra-Filter	Millipore Sigma	UFC810024	Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff
Universal Nuclease for cell lysis	Thermo Fisher Scientific	88702
Universal qPCR master mix	NEB	M3003L
Whatman Paper	Millipore Sigma	WHA1001325
β-mercaptoethanol	Fisher Scientific	21985023	CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
CAUTION: Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals.