نموذج فأر في الجسم الحي للتخدير الوريدي الكلي أثناء جراحة استئصال السرطان

Summary

تصف هذه الورقة طريقة لنمذجة التخدير الوريدي الكلي (TIVA) أثناء جراحة استئصال السرطان في الفئران. الهدف هو تكرار السمات الرئيسية لتوصيل التخدير للمرضى الذين يعانون من السرطان. تسمح هذه الطريقة بالتحقيق في كيفية تأثير تقنية التخدير على تكرار الإصابة بالسرطان بعد جراحة الاستئصال.

Abstract

التخدير هو عنصر روتيني في رعاية مرضى السرطان يستخدم في الإجراءات التشخيصية والعلاجية. وقد تورطت تقنية التخدير مؤخرا في التأثير على نتائج السرطان على المدى الطويل، ربما من خلال تعديل الاستجابات الالتهابية الأدرينالية التي تؤثر على سلوك الخلايا السرطانية ووظيفة الخلايا المناعية. تشير الأدلة الناشئة إلى أن التخدير الوريدي الكلي القائم على البروبوفول (TIVA) قد يكون مفيدا لنتائج السرطان على المدى الطويل عند مقارنته بالتخدير المتطاير المستنشق. ومع ذلك ، فإن النتائج السريرية المتاحة غير متسقة. هناك حاجة ماسة إلى الدراسات قبل السريرية التي تحدد الآليات الأساسية المعنية لتوجيه تصميم الدراسات السريرية التي من شأنها تسريع البصيرة. تم استقراء معظم النماذج قبل السريرية للتخدير من استخدام التخدير في أبحاث الجسم الحي ولم يتم تصميمها على النحو الأمثل لدراسة تأثير التخدير نفسه كنقطة النهاية الأولية. تصف هذه الورقة طريقة لتقديم تخدير البروبوفول-تيفا في نموذج فأر لاستئصال سرطان الثدي يكرر الجوانب الرئيسية للولادة السريرية في مرضى السرطان. يمكن استخدام النموذج لدراسة آليات عمل التخدير على نتائج السرطان في أنواع السرطان المختلفة ويمكن استقرائه إلى مناطق أخرى غير سرطانية في أبحاث التخدير قبل السريري.

Introduction

أكثر من 60٪ من المرضى الذين يعانون من السرطان يتلقون التخدير للاستئصال الجراحي¹. حاليا، لا توجد إرشادات سريرية محددة تحدد اختيار التخدير المستخدم في مرضى السرطان. تشير الدراسات الاستقصائية لأطباء التخدير إلى تفضيل التخدير المتطاير ، بما في ذلك أثناء جراحة السرطان ^2,3. ومع ذلك ، هناك مجموعة متزايدة من الأدلة على أن استخدام التخدير الوريدي الكلي القائم على البروبوفول (TIVA) أثناء جراحة السرطان قد يرتبط بنتائج ما بعد الجراحة المحسنة (البقاء على قيد الحياة بدون تقدم ، البقاء على قيد الحياة بشكل عام) عند مقارنته بالتخدير المتطاير⁴. تستمر الدراسات السريرية اللاحقة في الإبلاغ عن نتائج متناقضة⁵،^6،7،8. تدعم هذه النتائج الحاجة إلى دراسات ما قبل السريرية لفهم الآثار الميكانيكية لعوامل التخدير المختلفة على النتائج المتعلقة بالسرطان بشكل أفضل.

ومع ذلك ، في الدراسات في الجسم الحي التي تشكل جراحة السرطان ، غالبا ما يكون التخدير جزءا عرضيا من الإجراء. غالبا ما لا يكون الأساس المنطقي لاختيار التخدير هو محور التصميم التجريبي ، وقد لا يتم تقييم تأثيره على نقاط النهاية المرتبطة بالسرطان. على سبيل المثال ، في الدراسات الحية التي تتطلب صيانة التخدير لجراحة السرطان الأكثر شيوعا استخدام التخدير المتطاير المستنشق⁹. حيث تم استخدام البروبوفول في دراسات الجسم الحي ، فقد تم تسليمه عن طريق جرعات بلعة واحدة مع التسليم داخل الصفاق ، والذي لا يكرر بروتوكولات تخدير الأورام السريرية¹⁰. هذا النهج من إدارة البروبوفول يحفز التخدير الخفيف المناسب للإجراءات السريعة. ومع ذلك ، فإنه لا يسمح بصيانة التخدير المطلوب لجراحة استئصال السرطان التي قد تكون طويلة. علاوة على ذلك ، فإن حركية الامتصاص للتسليم داخل الصفاق تختلف عن الطرق السريرية للإدارة.

تم تطوير نموذج من TIVA القائم على البروبوفول لجراحة استئصال السرطان لتلبية هذه الحاجة. تم تطوير بروتوكول للصيانة المستمرة للتخدير مع معايرة عامل التخدير للسماح بالاستجابة للتحفيز الجراحي لتكرار الجوانب الرئيسية للتوصيل المخدر للمرضى الذين يخضعون لجراحة السرطان. يتم استخدام البروتوكول الناتج مع نموذج الفأر من السرطان لتوفير TIVA أثناء جراحة استئصال السرطان. يتم تقييم التأثير على النتائج المتعلقة بالسرطان على المدى القصير والطويل.

Protocol

تم إجراء جميع الدراسات على الحيوانات بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة موناش. في هذه الدراسة ، تم استخدام إناث الفئران Balb / c الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع.

1. تحضير الخلايا السرطانية

1. زراعة الخلايا السرطانية في الوسط. زراعة 66cl4 خلايا سرطان الثدي الفئران في ألفا-MEM تحتوي على 10٪ FBS و 200 mM الجلوتامين. يجب أن تكون الخلايا سلبية للميكوبلازما. اختياري: استخدم الخلايا التي يتم نقلها بثبات للتعبير عن لوسيفيراز اليراع لتصوير التلألؤ الحيوي لتمكين مراقبة تكرار السرطان بعد جراحة الاستئصال¹¹ (انظر الخطوة 4).
   ملاحظة: تم استخدام خط الخلية والوسيط المذكور أعلاه في هذه الدراسة.
2. تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂. تمر الخلايا بشكل معقم في غطاء محرك السيارة عند التقاء <80٪. استخدم الخلايا منخفضة المرور في مرحلة النمو اللوغاريتمي للحصول على أفضل النتائج في الجسم الحي .
3. رفع الخلايا الملتصقة مع 0.5 ملغ / مل من التربسين في PBS مع 10 mM EDTA ؛ 2 مل لقارورة T75. عند رفعه ، أضف وسيطا لتعطيل التربسين ، واغسل الخلايا في PBS.
4. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. تمييع الخلايا في PBS للحقن. بالنسبة لخلايا سرطان الثدي 66cl4 ، حقن 1 × 10⁵ خلايا في 20 ميكرولتر من PBS لكل ماوس.
5. ضع الخلايا على الثلج قبل الحقن.

2. توليد نموذج الفأر من سرطان الثدي

1. استخدم 4٪ من الأيزوفلوران لتخدير الماوس في غرفة الحث. ثم ، الحفاظ على التخدير مع 2 ٪ -3 ٪ isoflurane باستخدام مخروط الأنف. تأكيد التخدير المناسب عن طريق عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم.
2. قم بإعداد موقع الحقن عن طريق مسح منطقة الدهون الثديية اليسرى الرابعة باستخدام مسحة كحولية تستخدم لمرة واحدة.
3. ارسم الخلايا السرطانية (انظر الخطوة 1.4) في حقنة هاميلتون سعة 25 ميكرولتر متصلة بإبرة معقمة تحت الجلد 27 جم.
4. حقن الخلايا في الدهون الثديية اليسرى الرابعة. استخدم الملقط لتأمين الجلد ورفعه. حقن حوالي 1 مم من الحلمة.
5. اختياري: إذا تم وضع علامة على الخلايا باستخدام luciferase ، فقم بتأكيد الحقن الناجح للخلايا السرطانية عن طريق التصوير بالتلألؤ الحيوي. حقن 100 ميكرولتر من 150 مغ/كغ د-لوسيفيرين في الوريد الذيل الجانبي للفئران المخدرة باستخدام حقنة أنسولين سعة 0.5 مل مع إبرة تحت الجلد 30 غرام.
6. اختياري: ضع الماوس في نظام تصوير التلألؤ الحيوي مع توجيه لوحة الدهون الثديية لأعلى. انتظر لمدة 2 دقيقة من حقن لوسيفيرين للحصول على امتصاص الأنسجة الأمثل من لوسيفيرين ، ثم صورة لمدة 10 ثوان.
7. ضع الماوس في قفص نظيف واتركه يتعافى من التخدير.
8. الاستمرار في مراقبة رعاية الحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لأخلاقيات الحيوان.

3. الحث على التخدير المستقر مع التسليم عن طريق الوريد من البروبوفول

1. مراقبة نمو الورم الأساسي باستخدام قياس الفرجار وحساب حجم الورم باستخدام المعادلة: الحجم (مم³) = (الطول × (العرض)2 ÷ ² ).
2. قم بإجراء جراحة استئصال الورم على الفئران عندما يصل الورم الأساسي إلى الحجم المطلوب (هنا ، 80-90 مم³).
3. قم بإعداد مضخة حقنة آلية مع حقنة أنسولين سعة 30 جم 1 مل تحتوي على تركيبة بروبوفول (2٪ ليبورو بروبوفول) (الشكل 1 أ).
4. الحث على تخدير الماوس في غرفة الحث مع 3 ٪ سيفوفلوران أو إيزوفلوران.
   ملاحظة: هنا ، تم استخدام sevoflurane لأن هذا هو المتطاير السائد المستخدم سريريا.
5. انقل الماوس إلى وسادة تسخين 37 درجة مئوية طوال مدة الجراحة. الحفاظ على التخدير لفترة وجيزة مع 2٪ -3٪ سيفوفلوران باستخدام مخروط الأنف.
6. ضع مواد التشحيم المائية على العينين لمنع التجفيف.
7. حقن 0.05 مغ/كغ من البوبرينورفين تحت الجلد لعلاج التسكين.
8. للتحضير للجراحة ، حلق البطن وإعداد الجلد للجراحة باستخدام محلول اليود البوفيدون. امسح الجلد باستخدام كحول أو منديل معقم.
9. لتوصيل TIVA القائم على البروبوفول ، قم بتقليب الوريد الذيل الجانبي باستخدام إبرة معقمة تحت الجلد 30 جم متصلة بقسطرة بولي يوريثين معقمة. تأكد من الموضع الصحيح عن طريق فلاش باك الدم في القسطرة (الشكل 1B). اضبط توصيل سيفوفلوران كما هو مطلوب أثناء القنية الوريدية للحفاظ على عمق ثابت للتخدير يتضح من فقدان منعكس القرنية والدواسة ، ومعدل التنفس < 100 نفس في الدقيقة.
10. ابدأ البروبوفول-TIVA عن طريق إعطاء 2٪ من البروبوفول كبلعة أولية من 27 ملغم / كغم لأكثر من 1 دقيقة. وقف إدارة سيفوفلوران.
11. استمر في ضخ البروبوفول بمعدل صيانة يتراوح بين 2.2-4.0 مجم / كجم / دقيقة للحفاظ على عمق ثابت للتخدير طوال مدة الجراحة (الشكل 1C).

4. استئصال الورم الرئيسي

1. جعل شق مستقيم 1 سم أدنى من الورم في منطقة الدهون الثديية الرابعة اليسرى. استئصال الورم والعقدة الليمفاوية الإربية اليسرى بعناية باستخدام تشريح مع ملقط حاد.
2. اختياري: في حالة استخدام الخلايا السرطانية الموسومة باللوسيفيراز ، استخدم تصوير التلألؤ الحيوي لتأكيد الهوامش الجراحية الواضحة. حقن 150 مغ / كغ D-luciferin في الوريد الذيل الجانبي ، وانتظر لمدة 2 دقيقة ، ثم صور لمدة 60 ثانية باستخدام نظام تصوير التلألؤ الحيوي. إذا تم تحديد الورم المتبقي ، فقم باستئصال أنسجة إضافية من لوحة الدهون الثديية وإعادة تصويرها لتحقيق هوامش واضحة.
3. تأكد من الإرقاء في موقع الجراحة وأغلق الجلد باستخدام 5-0 خيوط نايلون. تأكد من أن الفراء لا يدخل الموقع الجراحي.
4. في ختام جراحة الاستئصال ، توقف عن التخدير. ضع الماوس في قفص نظيف على وسادة تسخين 37 درجة مئوية واتركه يتعافى من التخدير.
5. راقب كل 15 دقيقة بعد التخدير حتى يعود الماوس إلى اليقظة الطبيعية. ثم راقب الماوس كل 12 ساعة لمدة 48 ساعة بعد الجراحة.
6. إدارة 0.05 مغ/كغ من البوبرينورفين تحت الجلد كل 12 ساعة لمدة 48 ساعة بعد الجراحة.
7. بعد 7-10 أيام ، قم بإزالة الغرز باستخدام قواطع غرزة منحنية معقمة تحت تخدير سيفوفلوران أو إيسوفلوران قصير.

5. تتبع تكرار السرطان مع التصوير في الجسم الحي

1. استخدم التصوير بالتلألؤ الحيوي لتتبع تكرار الإصابة بالسرطان بعد جراحة الاستئصال بشكل غير جراحي. استخدم نظام تصوير التلألؤ الحيوي لمراقبة الفئران مرة واحدة في الأسبوع للحصول على دليل على تكرار الورم الأولي أو تكراره عن بعد، بدءا من الأسبوع التالي للجراحة.
2. الحث على تخدير الماوس في غرفة الحث مع 4 ٪ isoflurane. ثم ، انقل الماوس إلى وسادة تسخين 37 درجة مئوية طوال مدة التخدير وحافظ على التخدير بنسبة 2٪ -4٪ من الأيزوفلوران باستخدام مخروط الأنف.
3. ضع مواد التشحيم المائية على العينين لمنع التجفيف.
4. حقن D-luciferin 150 ملغم / كغم في الوريد الذيل الجانبي. انتظر لمدة 2 دقيقة ، ثم قم بقياس التلألؤ الحيوي على مدى التعرض لمدة 60 ثانية للكشف عن تكرار الورم الأساسي أو الانبثاث البعيد.
5. إذا تكرر الورم الأساسي وأصبح ملموسا، فابدأ في مراقبة نمو الورم باستخدام قياسات الفرجار.
6. في نهاية التجربة ، قتل الفئران بشكل إنساني وفقا للبروتوكول المعتمد. هنا ، تم استخدام CO₂ ، يليه خلع عنق الرحم.

النتائج

تصف هذه الطريقة نموذجا للتخدير الوريدي الكلي (TIVA) باستخدام البروبوفول أثناء جراحة استئصال السرطان في الفئران. يتم تسليم البروبوفول في نموذج الفأر هذا من خلال قسطرة وريدية باستخدام مضخة حقنة (الشكل 1A ، B) لتكرار تسليم TIVA في الإعداد السريري للتخدير لجراحة السرطان. ي?...

Discussion

تقدم هذه الدراسة تقريرا عن بروتوكول لإدارة التخدير الوريدي الكلي (TIVA) باستخدام البروبوفول في نموذج الفأر لسرطان الثدي الذي يكرر الجوانب الرئيسية للممارسة السريرية ل TIVA في المرضى الذين يحتاجون إلى جراحة السرطان. يسمح البروتوكول بالتحقيق في كل من النتائج قصيرة الأجل وطويلة الأجل ذات الصلة...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline	Fresnius Kabi	AUST R 197198
Artery forceps	Proscitech	TS1322-140
Buprenorphine	Temgesic	TEMG I
Heated surgical mat	Custom	-
Hypodermic needle (30 G, 1 mL insulin syringe)	Terumo	NN3013R
IVIS Lumina	PerkinElmer	126274
Luciferin	Promega	P1041/2/3
Polyurethane catheter	Intramedic	427401
Povidone Iodine	Betadine	AUST R 29562
Propofol Lipuro, 2%	Braun	3521490
Sevoflurane	Baxter	ANZ2L9117
Sevoflurane vaporiser	Vetquip	VQ1334
Sterile gauze	Multigate Medical Products	11-600A
Surgical scissors	Proscitech	TS1044
Sutures, 5-0 nylon	Dynek	V504
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Syringes (1 mL)	Terumo	SS+01T