מודל עכבר in vivo של הרדמה תוך ורידית כוללת במהלך ניתוח כריתת סרטן

Summary

מאמר זה מתאר שיטה למידול הרדמה תוך ורידית כוללת (TIVA) במהלך ניתוח כריתת סרטן בעכברים. המטרה היא לשכפל תכונות מרכזיות של אספקת הרדמה לחולים עם סרטן. השיטה מאפשרת לחקור כיצד טכניקת ההרדמה משפיעה על הישנות הסרטן לאחר ניתוח כריתה.

Abstract

הרדמה היא מרכיב שגרתי בטיפול בסרטן המשמש להליכי אבחון וטיפול. טכניקת ההרדמה מעורבת לאחרונה בהשפעה על תוצאות סרטן ארוכות טווח, אולי באמצעות אפנון של תגובות אדרנרגיות-דלקתיות המשפיעות על התנהגות התאים הסרטניים ועל תפקוד תאי מערכת החיסון. עדויות חדשות מצביעות על כך שהרדמה תוך ורידית כוללת מבוססת פרופופול (TIVA) עשויה להועיל לתוצאות סרטן ארוכות טווח בהשוואה להרדמה נדיפה בשאיפה. עם זאת, הממצאים הקליניים הזמינים אינם עקביים. מחקרים פרה-קליניים המזהים את המנגנונים הבסיסיים המעורבים נחוצים באופן קריטי כדי להנחות את התכנון של מחקרים קליניים שיזרזו תובנות. רוב המודלים הפרה-קליניים של הרדמה הושפעו משימוש בהרדמה במחקר in vivo ואינם מתוכננים באופן אופטימלי לחקור את השפעת ההרדמה עצמה כנקודת הקצה העיקרית. מאמר זה מתאר שיטה להרדמה של פרופופול-TIVA במודל עכברי של כריתת סרטן השד, המשכפל היבטים מרכזיים של העברה קלינית בחולות סרטן. המודל יכול לשמש לחקר מנגנוני הפעולה של הרדמה על תוצאות סרטן בסוגי סרטן מגוונים וניתן לבצע אקסטרפולציה לתחומים אחרים שאינם סרטניים של מחקר הרדמה פרה-קליני.

Introduction

יותר מ -60% מהחולים עם סרטן מקבלים הרדמה לכריתה כירורגית¹. נכון לעכשיו, אין הנחיות קליניות ספציפיות הקובעות את הבחירה של הרדמה בשימוש בחולי סרטן. סקרים של מרדימים מצביעים על העדפה להרדמה נדיפה, כולל במהלך ניתוח סרטן ^2,3. עם זאת, יש יותר ויותר עדויות לכך ששימוש בהרדמה תוך ורידית כוללת מבוססת פרופופול (TIVA) במהלך ניתוח סרטן עשוי להיות קשור לתוצאות משופרות לאחר הניתוח (הישרדות ללא התקדמות, הישרדות כוללת) בהשוואה להרדמה נדיפה⁴. מחקרים קליניים מאוחרים יותר ממשיכים לדווח על תוצאות סותרות 5,6,7,8. ממצאים אלה תומכים בצורך במחקרים פרה-קליניים כדי להבין טוב יותר את ההשפעות המכניסטיות של חומרי הרדמה שונים על תוצאות הקשורות לסרטן.

עם זאת, מחקרי in vivo המדגימים ניתוח סרטן, הרדמה היא לעתים קרובות חלק מקרי של ההליך. הרציונל לבחירת ההרדמה הוא לעתים קרובות לא המוקד של תכנון הניסוי, והשפעתו על נקודות קצה הקשורות לסרטן עשויה שלא להיות מוערכת. לדוגמה, מחקרי in vivo הדורשים תחזוקה של הרדמה לניתוחי סרטן משתמשים בדרך כלל בהרדמה נדיפה בשאיפה⁹. כאשר נעשה שימוש בפרופופול במחקרי in vivo , הוא נמסר על ידי מינון בולוס יחיד עם אספקה תוך-צפקית, שאינה משכפלת פרוטוקולים קליניים של הרדמה אונקו-הרדמה¹⁰. גישה זו של מתן פרופופול גורמת להרדמה קלה המתאימה להליכים מהירים. עם זאת, הוא אינו מאפשר תחזוקה של הרדמה הנדרשת לניתוח כריתת סרטן אשר עשוי להיות ממושך. יתר על כן, קינטיקה הקליטה של אספקה תוך-צפקית נבדלת משיטות הניהול הקליניות.

מודל של TIVA מבוסס פרופופול לניתוח כריתת סרטן פותח כדי לענות על צורך זה. פרוטוקול לתחזוקה מתמשכת של הרדמה עם טיטרציה של חומר ההרדמה כדי לאפשר תגובה לגירוי הניתוחי פותח כדי לשכפל היבטים מרכזיים של מתן הרדמה לחולים שעברו ניתוח סרטן. הפרוטוקול המתקבל משמש עם מודל עכבר של סרטן כדי לספק TIVA במהלך ניתוח כריתת סרטן. ההשפעה על תוצאות הקשורות לסרטן בטווח הקצר והארוך מוערכת.

Protocol

כל המחקרים בבעלי חיים נערכו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מונאש. במחקר זה נעשה שימוש בנקבות עכברי Balb/c בגילאי 6-8 שבועות.

1. הכן תאים סרטניים

1. תרבית תאי גידול במדיום. תרבית 66cl4 תאי סרטן החלב מורין באלפא-MEM המכילים 10% FBS ו-200 מ"מ גלוטמין. תאים צריכים טקסט שלילי עבור mycoplasma. אופציונלי: השתמש בתאים שעברו התמרה יציבה כדי לבטא לוציפראז גחלילית להדמיית ביולומינסנציה כדי לאפשר ניטור הישנות סרטן לאחר ניתוח כריתה¹¹ (ראה שלב 4).
   הערה: קו התאים והמדיום שהוזכרו לעיל שימשו במחקר זה.
2. לגדל תאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂. מעבר תאים באופן אספטי במכסה המנוע במפגש של <80%. השתמש בתאים בעלי מעבר נמוך בשלב הגדילה הלוגריתמי לקבלת תוצאות in vivo מיטביות.
3. הרם את התאים הדבקים עם 0.5 מ"ג/מ"ל של טריפסין ב- PBS עם 10 mM EDTA; 2 מ"ל עבור בקבוק T75. כאשר מורמים, יש להוסיף טריפסין בינוני להשבתה, ולשטוף את התאים ב-PBS.
4. לספור את התאים באמצעות hemocytometer. לדלל את התאים ב- PBS להזרקה. עבור 66cl4 תאי סרטן החלב, להזריק 1 x 10^{5 תאים} ב 20 μL של PBS לכל עכבר.
5. מניחים את התאים על קרח לפני ההזרקה.

2. צור מודל עכבר של סרטן השד

1. השתמש 4% isoflurane כדי להרדים את העכבר בתא אינדוקציה. לאחר מכן, לשמור על הרדמה עם 2%-3% isoflurane באמצעות חרוט האף. אשר הרדמה נכונה על ידי חוסר תגובה לצביטת הבוהן.
2. הכן את אתר ההזרקה על ידי ניגוב אזור השומן השמאלי הרביעי של החלב באמצעות ספוגית אלכוהול חד פעמית.
3. שאבו תאי גידול (ראו שלב 1.4) לתוך מזרק המילטון 25 μL המחובר למחט היפודרמית סטרילית של 27 גרם.
4. להזריק את התאים לתוך הפטפד הרביעי השמאלי של החלב. השתמש מלקחיים כדי לאבטח ולהרים את העור. מזריקים כ-1 מ"מ מהפטמה.
5. אופציונלי: אם תאים מתויגים עם לוציפראז, אשר הזרקה מוצלחת של תאי הגידול על ידי הדמיה bioluminescence. הזרקת 100 μL של 150 מ"ג/ק"ג D-לוציפרין לווריד הזנב הצדדי של העכברים המרדימים באמצעות מזרק אינסולין של 0.5 מ"ל עם מחט היפודרמית של 30 גרם.
6. אופציונלי: הנח את העכבר במערכת הדמיה ביולומינסנציה כאשר משטח השומן של החלב פונה כלפי מעלה. המתן 2 דקות מהזרקת לוציפרין לספיגת רקמות אופטימלית של לוציפרין, ולאחר מכן תמונה במשך 10 שניות.
7. הניחו את העכבר בכלוב נקי ואפשרו לו להתאושש מההרדמה.
8. המשך לעקוב אחר רווחת בעלי החיים בהתאם להנחיות האתיקה המוסדיות של בעלי חיים.

3. גרום הרדמה יציבה עם אספקה תוך ורידית של פרופופול

1. עקוב אחר צמיחת הגידול הראשוני באמצעות מדידת קליפר וחשב את נפח הגידול באמצעות המשוואה: נפח (מ"מ³) = (אורך x (רוחב)2 ÷ ² ).
2. בצע ניתוח כריתת גידול בעכברים כאשר הגידול הראשוני מגיע לנפח הנדרש (כאן, 80-90 מ"מ³).
3. הגדירו משאבת מזרק אוטומטית עם מזרק אינסולין 30 G 1 מ"ל המכיל נוסחת פרופופול (2% ליפורו פרופופול) (איור 1A).
4. השרה הרדמה של העכבר בתא אינדוקציה עם 3% sevoflurane או isoflurane.
   הערה: כאן, sevoflurane שימש כמו זה נדיף השולט בשימוש קליני.
5. מעבירים את העכבר למשטח חימום בטמפרטורה של 37°C למשך הניתוח. שמור לזמן קצר על הרדמה עם 2%-3% sevoflurane באמצעות חרוט האף.
6. יש למרוח חומר סיכה מימי על העיניים כדי למנוע התייבשות.
7. להזריק 0.05 מ"ג / ק"ג של buprenorphine תת עורית עבור משכך כאבים.
8. כדי להתכונן לניתוח, לגלח את הבטן ולהכין את העור לניתוח עם פתרון יוד-פובידון. נגבו את העור באמצעות אלכוהול או מגבון סטרילי.
9. כדי לספק TIVA מבוסס פרופופול, cannulate את וריד הזנב לרוחב באמצעות מחט היפודרמית סטרילית 30 G המחוברת לקטטר פוליאוריתן סטרילי. אשרו את המיקום הנכון באמצעות פלאשבק דם לתוך הקטטר (איור 1B). התאם את אספקת sevoflurane כנדרש במהלך קנולציה תוך ורידית כדי לשמור על עומק יציב של הרדמה המודגם על ידי אובדן של קרנית רפלקס הדוושה, וקצב הנשימה < 100 נשימות לדקה.
10. יש להתחיל את השימוש בפרופופול-TIVA על ידי מתן 2% פרופופול כבולוס ראשוני של 27 מ"ג/ק"ג למשך למעלה מדקה אחת. להפסיק את ניהול sevoflurane.
11. המשך את העירוי של פרופופול בקצב תחזוקה של 2.2-4.0 מ"ג/ק"ג/דקה כדי לשמור על עומק הרדמה יציב למשך הניתוח (איור 1C).

4. כריתת הגידול הראשוני

1. בצע חתך ישר של 1 ס"מ נחות מהגידול באזור של השומן הרביעי השמאלי של החלב. בזהירות לכרות את הגידול ואת הצומת הלימפה המפשעה השמאלית באמצעות דיסקציה עם מלקחיים קהים.
2. אופציונלי: אם אתה משתמש בתאי גידול המתויגים על-ידי לוציפראז, השתמש בהדמיית ביולומינסנציה כדי לאשר שולי ניתוח ברורים. יש להזריק 150 מ"ג/ק"ג D-לוציפרין לווריד הזנב הלטרלי, להמתין 2 דקות ולאחר מכן לצלם במשך 60 שניות באמצעות מערכת הדמיה ביולומינסנציה. אם מזוהה גידול שיורי, כריתת רקמה נוספת ממשטח השומן של החלב ותמונה מחדש כדי להשיג שוליים ברורים.
3. ודא hemostasis באתר כירורגי ולסגור את העור באמצעות 5-0 תפרים ניילון. ודא כי הפרווה אינה נכנסת לאתר הניתוח.
4. בסיום ניתוח כריתה, להפסיק הרדמה. הניחו את העכבר בכלוב נקי על כרית חימום של 37 מעלות צלזיוס ואפשרו לו להתאושש מההרדמה.
5. עקוב כל 15 דקות לאחר ההרדמה עד שהעכבר חזר לערנות רגילה. לאחר מכן, עקוב אחר העכבר כל 12 שעות במשך 48 שעות לאחר הניתוח.
6. לתת 0.05 מ"ג / ק"ג של buprenorphine תת עורית כל 12 שעות במשך 48 שעות לאחר הניתוח.
7. לאחר 7-10 ימים, יש להסיר את התפרים באמצעות חותכי תפרים מעוקלים סטריליים בהרדמה קצרה של סבופלוראן או איזופלוראן.

5. עקוב אחר הישנות סרטן באמצעות הדמיית in vivo

1. השתמש בהדמיית ביולומינסנציה כדי לעקוב אחר הישנות סרטן לאחר ניתוח כריתה באופן לא פולשני. השתמש במערכת הדמיה bioluminescence כדי לנטר את העכברים פעם בשבוע כדי להעיד על הישנות הגידול הראשוני או הישנות מרוחקת, החל מהשבוע שלאחר הניתוח.
2. לגרום הרדמה של העכבר בתא אינדוקציה עם 4% isoflurane. לאחר מכן, העבר את העכבר לכרית חימום של 37 מעלות צלזיוס למשך ההרדמה ושמור על הרדמה עם 2%-4% איזופלוראן באמצעות חרוט אף.
3. יש למרוח חומר סיכה מימי על העיניים כדי למנוע התייבשות.
4. להזריק D-לוציפרין 150 מ"ג/ק"ג לווריד הזנב הצדדי. המתן 2 דקות, ולאחר מכן מדוד bioluminescence על פני חשיפה של 60 שניות כדי לזהות הישנות של הגידול הראשוני או גרורות מרוחקות.
5. אם הגידול הראשוני חוזר והופך מוחשי, התחל במעקב אחר צמיחת הגידול באמצעות מדידות קליפר.
6. בסוף הניסוי, הורגים את העכברים באופן אנושי על פי הפרוטוקול המאושר. כאן, CO₂ שימש, ואחריו נקע צוואר הרחם.

תוצאות

שיטה זו מתארת מודל של הרדמה תוך ורידית כוללת (TIVA) עם פרופופול במהלך ניתוח כריתת סרטן בעכברים. פרופופול מועבר במודל עכבר זה דרך קטטר תוך ורידי באמצעות משאבת מזרק (איור 1A,B) כדי לשכפל את העברת TIVA בסביבה הקלינית של הרדמה לניתוח סרטן. השימוש במשאבת המזרק ממזער את החשיפה ?...

Discussion

מחקר זה מדווח על פרוטוקול למתן הרדמה תוך ורידית כוללת (TIVA) עם פרופופול במודל עכברי של סרטן השד המשכפל היבטים מרכזיים של הפרקטיקה הקלינית עבור TIVA בחולות הזקוקות לניתוח סרטן. הפרוטוקול מאפשר לחקור הן תוצאות רלוונטיות מבחינה קלינית לטווח הקצר והן לטווח הארוך לאחר ניתוח סרטן במודל עכברי של הת...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline	Fresnius Kabi	AUST R 197198
Artery forceps	Proscitech	TS1322-140
Buprenorphine	Temgesic	TEMG I
Heated surgical mat	Custom	-
Hypodermic needle (30 G, 1 mL insulin syringe)	Terumo	NN3013R
IVIS Lumina	PerkinElmer	126274
Luciferin	Promega	P1041/2/3
Polyurethane catheter	Intramedic	427401
Povidone Iodine	Betadine	AUST R 29562
Propofol Lipuro, 2%	Braun	3521490
Sevoflurane	Baxter	ANZ2L9117
Sevoflurane vaporiser	Vetquip	VQ1334
Sterile gauze	Multigate Medical Products	11-600A
Surgical scissors	Proscitech	TS1044
Sutures, 5-0 nylon	Dynek	V504
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Syringes (1 mL)	Terumo	SS+01T