Un modèle murin in vivo d’anesthésie intraveineuse totale pendant une chirurgie de résection du cancer

Résumé

Cet article décrit une méthode de modélisation de l’anesthésie intraveineuse totale (TIVA) pendant la chirurgie de résection du cancer chez la souris. L’objectif est de reproduire les principales caractéristiques de l’administration de l’anesthésie aux patients atteints de cancer. La méthode permet d’étudier comment la technique anesthésique affecte la récidive du cancer après une chirurgie de résection.

Résumé

L’anesthésie est une composante courante des soins contre le cancer qui est utilisée pour les procédures diagnostiques et thérapeutiques. La technique anesthésique a récemment été impliquée dans l’impact sur les résultats du cancer à long terme, peut-être par la modulation des réponses adrénergiques-inflammatoires qui ont un impact sur le comportement des cellules cancéreuses et la fonction des cellules immunitaires. De nouvelles preuves suggèrent que l’anesthésie intraveineuse totale à base de propofol (TIVA) pourrait être bénéfique pour les résultats du cancer à long terme par rapport à l’anesthésie volatile inhalée. Cependant, les résultats cliniques disponibles sont contradictoires. Les études précliniques qui identifient les mécanismes sous-jacents impliqués sont absolument nécessaires pour guider la conception d’études cliniques qui accéléreront la compréhension. La plupart des modèles précliniques d’anesthésie ont été extrapolés à partir de l’utilisation de l’anesthésie dans la recherche in vivo et ne sont pas conçus de manière optimale pour étudier l’impact de l’anesthésie elle-même en tant que critère d’évaluation principal. Cet article décrit une méthode d’administration de l’anesthésie au propofol-TIVA dans un modèle murin de résection du cancer du sein qui reproduit des aspects clés de l’administration clinique chez les patientes atteintes de cancer. Le modèle peut être utilisé pour étudier les mécanismes d’action de l’anesthésie sur les résultats du cancer dans divers types de cancer et peut être extrapolé à d’autres domaines non cancéreux de la recherche préclinique en anesthésie.

Introduction

Plus de 60% des patients atteints de cancer reçoivent une anesthésie pour une résection chirurgicale¹. Actuellement, il n’existe pas de lignes directrices cliniques spécifiques qui déterminent le choix de l’anesthésie utilisée chez les patients atteints de cancer. Les enquêtes menées auprès des anesthésiologistes indiquent une préférence pour l’anesthésie à base volatile, y compris lors d’une chirurgie du cancer ^2,3. Cependant, il existe de plus en plus de preuves que l’utilisation de l’anesthésie intraveineuse totale à base de propofol (TIVA) pendant la chirurgie du cancer peut être associée à une amélioration des résultats postopératoires (survie sans progression, survie globale) par rapport à l’anesthésie volatile⁴. Des études cliniques ultérieures continuent de rapporter des résultats contradictoires 5,6,7,8. Ces résultats appuient la nécessité de mener des études précliniques pour mieux comprendre les effets mécanistes de différents agents anesthésiques sur les résultats liés au cancer.

Cependant, dans les études in vivo qui modélisent la chirurgie du cancer, l’anesthésie est souvent une partie accessoire de la procédure. La justification du choix de l’anesthésie n’est souvent pas au centre de la conception expérimentale, et son impact sur les paramètres liés au cancer peut ne pas être évalué. Par exemple, les études in vivo qui nécessitent le maintien de l’anesthésie pour la chirurgie du cancer utilisent le plus souvent une anesthésie volatile inhalée⁹. Lorsque le propofol a été utilisé dans des études in vivo , il a été administré par bolus unique avec administration intrapéritonéale, ce qui ne reproduit pas les protocoles onco-anesthésiques cliniques¹⁰. Cette approche de l’administration de propofol induit une anesthésie légère adaptée aux procédures rapides. Cependant, il ne permet pas le maintien de l’anesthésie nécessaire pour la chirurgie de résection du cancer qui peut être prolongée. De plus, la cinétique d’absorption de l’administration intrapéritonéale est distincte des méthodes cliniques d’administration.

Un modèle de TIVA à base de propofol pour la chirurgie de résection du cancer a été développé pour répondre à ce besoin. Un protocole pour le maintien soutenu de l’anesthésie avec titrage de l’agent anesthésique pour permettre la réponse au stimulus chirurgical a été développé pour reproduire les aspects clés de l’administration de l’anesthésique aux patients subissant une chirurgie du cancer. Le protocole résultant est utilisé avec un modèle murin de cancer pour fournir TIVA pendant la chirurgie de résection du cancer. L’effet sur les résultats à court et à long terme liés au cancer est évalué.

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Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été entreprises sous l’approbation du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Monash. Dans cette étude, des souris Balb/c femelles âgées de 6 à 8 semaines ont été utilisées.

1. Préparer les cellules cancéreuses

1. Culture de cellules tumorales en milieu. Culture de cellules cancéreuses mammaires murines 66cl4 dans l’alpha-MEM contenant 10% de FBS et 200 mM de glutamine. Les cellules doivent envoyer un texte négatif pour les mycoplasmes. FACULTATIF : Utilisez des cellules qui sont transduites de manière stable pour exprimer la luciférase luciole pour l’imagerie par bioluminescence afin de permettre la surveillance de la récidive du cancer après une chirurgie de résection¹¹ (voir étape 4).
   NOTE: La lignée cellulaire et le milieu mentionnés ci-dessus ont été utilisés dans cette étude.
2. Cultiver des cellules à 37 °C avec 5% de CO₂. Cellules de passage aseptique dans une hotte à <80% de confluence. Utilisez des cellules à faible passage dans la phase de croissance logarithmique pour des résultats in vivo optimaux.
3. Soulever les cellules adhérentes avec 0,5 mg/mL de trypsine dans du PBS avec 10 mM d’EDTA; 2 mL pour une fiole T75. Une fois soulevé, ajoutez du milieu pour inactiver la trypsine et lavez les cellules dans du PBS.
4. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Diluer les cellules dans PBS pour injection. Pour 66cl4 cellules cancéreuses mammaires, injecter 1 x 10⁵ cellules dans 20 μL de PBS par souris.
5. Placez les cellules sur de la glace avant l’injection.

2. Générer un modèle murin de cancer du sein

1. Utilisez de l’isoflurane à 4% pour anesthésier la souris dans une chambre à induction. Ensuite, maintenez l’anesthésie avec 2% -3% d’isoflurane à l’aide d’un cône nasal. Confirmer une anesthésie adéquate par l’absence de réponse au pincement de l’orteil.
2. Préparez le site d’injection en essuyant la quatrième zone de fatpad mammaire gauche à l’aide d’un tampon imbibé d’alcool à usage unique.
3. Prélever les cellules tumorales (voir étape 1.4) dans une seringue Hamilton de 25 μL fixée à une aiguille hypodermique stérile de 27 G.
4. Injectez les cellules dans le quatrième fatpad mammaire gauche. Utilisez des pinces pour fixer et soulever la peau. Injecter à environ 1 mm du mamelon.
5. FACULTATIF: Si les cellules sont marquées avec de la luciférase, confirmer l’injection réussie de cellules tumorales par imagerie par bioluminescence. Injecter 100 μL de 150 mg/kg de D-luciférine dans la veine latérale de la queue des souris anesthésiées à l’aide d’une seringue à insuline de 0,5 mL avec une aiguille hypodermique de 30 G.
6. FACULTATIF: Placez la souris dans un système d’imagerie par bioluminescence avec le fatpad mammaire vers le haut. Attendez 2 minutes à partir de l’injection de luciférine pour une absorption tissulaire optimale de la luciférine, puis imagez pendant 10 s.
7. Placez la souris dans une cage propre et laissez-la récupérer de l’anesthésie.
8. Continuer de surveiller le bien-être des animaux conformément aux lignes directrices institutionnelles en matière d’éthique animale.

3. Induire une anesthésie stable avec l’administration intraveineuse de propofol

1. Surveillez la croissance de la tumeur primaire à l’aide de la mesure de l’étrier et calculez le volume tumoral à l’aide de l’équation: Volume (mm³) = (longueur x (largeur)2 ÷ ² ).
2. Effectuer une chirurgie de résection tumorale sur des souris lorsque la tumeur primaire atteint le volume requis (ici, 80-90 mm³).
3. Mettre en place une pompe à seringue automatisée avec une seringue à insuline de 30 G 1 mL contenant une formulation de propofol (2 % de Lipuro propofol) (Figure 1A).
4. Induire l’anesthésie de la souris dans une chambre d’induction avec 3% de sévoflurane ou d’isoflurane.
   REMARQUE: Ici, le sévoflurane a été utilisé car c’est le volatil prédominant utilisé cliniquement.
5. Transférez la souris dans un coussin chauffant à 37 °C pendant toute la durée de la chirurgie. Maintenir brièvement l’anesthésie avec 2% -3% de sévoflurane à l’aide d’un cône nasal.
6. Appliquez un lubrifiant aqueux sur les yeux pour éviter le dessèchement.
7. Injecter 0,05 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée pour l’analgésie.
8. Pour vous préparer à la chirurgie, rasez l’abdomen et préparez la peau à la chirurgie avec une solution d’iode-povidone. Essuyez la peau à l’aide d’un alcool ou d’une lingette stérile.
9. Pour administrer le TIVA à base de propofol, canuler la veine latérale de la queue à l’aide d’une aiguille hypodermique stérile de 30 G fixée à un cathéter stérile en polyuréthane. Confirmer le placement correct par flashback sanguin dans le cathéter (Figure 1B). Ajuster l’administration de sévoflurane au besoin pendant la canulation intraveineuse pour maintenir une profondeur d’anesthésie stable démontrée par une perte du réflexe cornéen et pédal, et une fréquence respiratoire < 100 respirations par minute.
10. Commencer le propofol-TIVA en administrant du propofol à 2 % sous forme de bolus initial de 27 mg/kg pendant plus de 1 min. Cesser l’administration de sévoflurane.
11. Poursuivre la perfusion de propofol à un taux d’entretien de 2,2 à 4,0 mg/kg/min pour maintenir une profondeur d’anesthésie stable pendant toute la durée de la chirurgie (Figure 1C).

4. Réséquer la tumeur primaire

1. Faites une incision droite de 1 cm inférieure à la tumeur dans la région du quatrième coussinet mammaire gauche. Réséquer soigneusement la tumeur et le ganglion lymphatique inguinal gauche en utilisant un curage avec une pince contondante.
2. FACULTATIF: Si vous utilisez des cellules tumorales marquées à la luciférase, utilisez l’imagerie par bioluminescence pour confirmer des marges chirurgicales claires. Injecter 150 mg/kg de D-luciférine dans la veine latérale de la queue, attendre 2 minutes, puis imager pendant 60 s à l’aide d’un système d’imagerie par bioluminescence. Si une tumeur résiduelle est identifiée, réséquez le tissu supplémentaire du coussinet adipeux mammaire et ré-imagez pour obtenir des marges claires.
3. Assurez-vous de l’hémostase au site chirurgical et fermez la peau à l’aide de sutures en nylon 5-0. Assurez-vous que la fourrure ne pénètre pas dans le site chirurgical.
4. À la fin de la chirurgie de résection, cesser l’anesthésie. Placez la souris dans une cage propre sur un coussin chauffant à 37 °C et laissez-la récupérer de l’anesthésie.
5. Surveiller toutes les 15 minutes après l’anesthésie jusqu’à ce que la souris soit revenue à une vigilance normale. Ensuite, surveillez la souris toutes les 12 heures pendant 48 heures après la chirurgie.
6. Administrer 0,05 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée toutes les 12 heures pendant 48 h après la chirurgie.
7. Après 7 à 10 jours, retirez les sutures à l’aide de couteaux incurvés stériles sous une brève anesthésie au sévoflurane ou à l’isoflurane.

5. Suivre la récidive du cancer grâce à l’imagerie in vivo

1. Utilisez l’imagerie par bioluminescence pour suivre la récidive du cancer après une chirurgie de résection de manière non invasive. Utilisez un système d’imagerie par bioluminescence pour surveiller les souris une fois par semaine à la recherche de signes de récidive tumorale primaire ou de récidive à distance, à partir de la semaine suivant la chirurgie.
2. Induire une anesthésie de la souris dans une chambre d’induction avec 4% d’isoflurane. Ensuite, transférez la souris dans un coussin chauffant à 37 °C pendant toute la durée de l’anesthésie et maintenez l’anesthésie avec de l’isoflurane à 2% à 4% à l’aide d’un cône nasal.
3. Appliquez un lubrifiant aqueux sur les yeux pour éviter le dessèchement.
4. Injecter 150 mg/kg de D-luciférine dans la veine latérale de la queue. Attendre 2 min, puis mesurer la bioluminescence sur une exposition de 60 s pour détecter une récidive de la tumeur primaire ou des métastases à distance.
5. Si la tumeur primaire réapparaît et devient palpable, commencez à surveiller la croissance tumorale à l’aide de mesures d’étriers.
6. À la fin de l’expérience, tuez humainement les souris selon le protocole approuvé. Ici, le CO₂ a été utilisé, suivi d’une luxation cervicale.

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Résultats

Cette méthode décrit un modèle d’anesthésie intraveineuse totale (TIVA) avec du propofol lors d’une chirurgie de résection du cancer chez la souris. Le propofol est administré dans ce modèle murin par un cathéter intraveineux à l’aide d’une pompe à seringue (Figure 1A,B) pour reproduire l’administration de TIVA dans le cadre clinique de l’anesthésie pour la chirurgie du cancer. L’utilisation de la pompe à seringue minimise l’exposition à l’anes...

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Discussion

Cette étude rend compte d’un protocole d’administration d’anesthésie intraveineuse totale (TIVA) avec du propofol dans un modèle murin de cancer du sein qui reproduit des aspects clés de la pratique clinique du TIVA chez les patientes nécessitant une chirurgie du cancer. Le protocole permet d’étudier les résultats cliniquement pertinents à court et à long terme après une chirurgie du cancer dans un modèle murin de progression du cancer, y compris la mesure des taux de cytokines et de la récidive du ca...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline	Fresnius Kabi	AUST R 197198
Artery forceps	Proscitech	TS1322-140
Buprenorphine	Temgesic	TEMG I
Heated surgical mat	Custom	-
Hypodermic needle (30 G, 1 mL insulin syringe)	Terumo	NN3013R
IVIS Lumina	PerkinElmer	126274
Luciferin	Promega	P1041/2/3
Polyurethane catheter	Intramedic	427401
Povidone Iodine	Betadine	AUST R 29562
Propofol Lipuro, 2%	Braun	3521490
Sevoflurane	Baxter	ANZ2L9117
Sevoflurane vaporiser	Vetquip	VQ1334
Sterile gauze	Multigate Medical Products	11-600A
Surgical scissors	Proscitech	TS1044
Sutures, 5-0 nylon	Dynek	V504
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Syringes (1 mL)	Terumo	SS+01T