암 절제 수술 중 전체 정맥 마취의 생체 내 마우스 모델

요약

이 논문은 마우스에서 암 절제 수술 중 총 정맥 마취 (TIVA)를 모델링하는 방법을 설명합니다. 목표는 암 환자에게 마취 전달의 주요 기능을 복제하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 마취 기술이 절제 수술 후 암 재발에 어떤 영향을 미치는지 조사 할 수 있습니다.

초록

마취는 진단 및 치료 절차에 사용되는 암 치료의 일상적인 구성 요소입니다. 마취 기술은 최근 암세포 행동과 면역 세포 기능에 영향을 미치는 아드레날린 염증 반응의 조절을 통해 장기적인 암 결과에 영향을 미치는 것과 관련이 있습니다. 새로운 증거는 propofol 기반 전체 정맥 마취 (TIVA)가 흡입 휘발성 마취와 비교할 때 장기적인 암 결과에 도움이 될 수 있음을 시사합니다. 그러나 이용 가능한 임상 결과는 일관성이 없습니다. 관련된 기본 메커니즘을 식별하는 전임상 연구는 통찰력을 신속하게 제공하는 임상 연구의 설계를 안내하는 데 매우 필요합니다. 대부분의 전임상 마취 모델은 생체 내 연구에서 마취를 사용하여 외삽되었으며 마취 자체를 1차 종점으로 연구하도록 최적으로 설계되지 않았습니다. 이 논문은 암 환자에서 임상 전달의 주요 측면을 복제하는 유방암 절제술의 마우스 모델에서 propofol-TIVA 마취를 전달하는 방법을 설명합니다. 이 모델은 다양한 암 유형의 암 결과에 대한 마취 작용 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있으며 전임상 마취 연구의 다른 비암 영역으로 외삽할 수 있습니다.

서문

암 환자의 60 % 이상이 외과 적 절제술을 위해 마취를받습니다¹. 현재 암 환자에게 사용되는 마취의 선택을 결정하는 구체적인 임상 지침은 없습니다. 마취과 의사에 대한 설문 조사는^{암 수술 2,3}을 포함하여 휘발성 기반 마취에 대한 선호도를 나타냅니다. 그러나 암 수술 중 프로포폴 기반 총 정맥 마취 (TIVA)를 사용하면 휘발성 마취와 비교할 때 수술 후 결과 (무 진행 생존, 전체 생존)가 개선 될 수 있다는 증거가 늘어나고 있습니다⁴. 후속 임상 연구는 계속해서 모순되는 결과 ^5,6,7,8을 보고합니다. 이러한 결과는 암 관련 결과에 대한 다양한 마취제의 기계적 효과를 더 잘 이해하기 위한 전임상 연구의 필요성을 뒷받침합니다.

그러나 암 수술을 모델링하는 생체 내 연구에서 마취는 종종 절차의 부수적 인 부분입니다. 마취 선택의 근거는 종종 실험 설계의 초점이 아니며 암 관련 종점에 미치는 영향은 평가되지 않을 수 있습니다. 예를 들어, 암 수술을 위해 마취의 유지를 필요로 하는 생체내 연구는 흡입 휘발성 마취^{9를 가장} 일반적으로 사용한다. 프로포폴이 생체내 연구에서 사용된 경우, 이는 임상 종양 마취 프로토콜¹⁰을 복제하지 않는 복강 내 전달과 함께 단일 볼루스 투여에 의해 전달되었습니다. 프로포폴 투여의 이러한 접근 방식은 신속한 절차에 적합한 가벼운 마취를 유도합니다. 그러나 오래 걸릴 수있는 암 절제 수술에 필요한 마취의 유지는 허용되지 않습니다. 또한, 복강 내 전달의 흡수 동역학은 임상 투여 방법에 구별된다.

이러한 요구를 해결하기 위해 암 절제 수술을위한 propofol 기반 TIVA 모델이 개발되었습니다. 암 수술을 받은 환자에게 마취제 전달의 주요 측면을 복제하기 위해 외과적 자극에 대한 반응을 허용하기 위해 마취제의 적정과 함께 마취의 지속적인 유지를 위한 프로토콜이 개발되었습니다. 결과 프로토콜은 암 절제 수술 동안 TIVA를 제공하기 위해 암의 마우스 모델과 함께 사용됩니다. 단기 및 장기 암 관련 결과에 대한 영향을 평가합니다.

프로토콜

모든 동물 연구는 Monash University의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인하에 수행되었습니다. 이 연구에서는 6-8 주 된 암컷 Balb / c 마우스를 사용했습니다.

1. 암세포 준비

1. 배지에서 종양 세포를 배양합니다. 배양 66cl4 뮤린 유방암 세포를 10% FBS 및 200 mM 글루타민을 함유하는 알파-MEM에서. 세포는 마이코플라스마에 대해 음성 텍스트를 사용해야 합니다. 선택사항: 절제 수술¹¹ 후 암 재발 모니터링을 가능하게 하기 위해 생물발광 영상화를 위해 반딧불이 루시퍼라제를 발현하도록 안정적으로 형질도입된 세포를 사용한다(단계 4 참조).
   참고: 위에서 언급한 세포주와 배지가 이 연구에 사용되었습니다.
2. 세포를 37°C에서 5%_CO2로 성장시킨다. <80% 컨플루언시에서 후드에서 무균적으로 세포를 통과시킵니다. 최적의 생체 내 결과를 위해 대수 성장 단계에서 저계대 세포를 사용합니다.
3. 10mM EDTA가 있는 PBS에서 0.5mg/mL의 트립신으로 부착 세포를 들어 올립니다. T75 플라스크의 경우 2mL. 들어 올릴 때 배지를 추가하여 트립신을 비활성화하고 세포를 PBS로 세척합니다.
4. 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 주입을 위해 세포를 PBS로 희석하십시오. 66cl4 유방암 세포의 경우 마우스당 20μL의 PBS에 1 x 10⁵ 세포를 주입합니다.
5. 주사하기 전에 세포를 얼음 위에 놓습니다.

2. 유방암 마우스 모델 생성

1. 유도 챔버에서 마우스를 마취하기 위해 4% 이소플루란을 사용합니다. 그런 다음 코 콘을 사용하여 2%-3% 이소플루란으로 마취를 유지하십시오. 발가락 꼬집음에 대한 반응이 없어 적절한 마취를 확인하십시오.
2. 일회용 알코올 면봉을 사용하여 네 번째 왼쪽 유방 지방 패드 부위를 닦아 주사 부위를 준비하십시오.
3. 멸균 된 27G 피하 주사 바늘에 부착 된 25 μL Hamilton 주사기에 종양 세포 (1.4 단계 참조)를 추출합니다.
4. 네 번째 왼쪽 유방 지방 패드에 세포를 주입하십시오. 집게를 사용하여 피부를 고정하고 들어 올리십시오. 젖꼭지에서 약 1mm 주입하십시오.
5. 선택 사항: 세포에 루시페라아제 태그가 부착된 경우 생물발광 영상으로 종양 세포의 성공적인 주입을 확인합니다. 30G 피하 주사 바늘이 있는 0.5mL 인슐린 주사기를 사용하여 마취된 마우스의 측면 꼬리 정맥에 150mg/kg D-루시페린 100μL를 주사합니다.
6. 선택 사항: 유방 지방 패드가 위를 향하도록 하여 마우스를 생물 발광 이미징 시스템에 놓습니다. 루시페린의 최적의 조직 흡수를 위해 루시페린 주사 후 2분 동안 기다린 다음 10초 동안 이미지를 촬영합니다.
7. 마우스를 깨끗한 케이지에 넣고 마취에서 회복되도록하십시오.
8. 기관 동물 윤리 지침에 따라 동물 복지를 계속 모니터링하십시오.

3. 프로포폴의 정맥 내 전달로 안정적인 마취 유도

1. 캘리퍼스 측정을 사용하여 원발성 종양의 성장을 모니터링하고 방정식을 사용하여 종양 부피를 계산합니다: 부피(mm³) = (길이 x (너비)2 ÷ ² ).
2. 원발 종양이 필요한 부피 (여기서는 80-90 mm³)에 도달하면 마우스에서 종양 절제 수술을 수행하십시오.
3. 프로포폴 제형(2% 리푸로 프로포폴)이 포함된 30G 1mL 인슐린 주사기로 자동 주사기 펌프를 설정합니다(그림 1A).
4. 유도 챔버에서 마우스의 마취를 3% 세보플루란 또는 이소플루란으로 유도한다.
   참고: 여기서, 세보플루란은 임상적으로 사용되는 주된 휘발성이므로 사용되었다.
5. 수술 기간 동안 마우스를 37°C 가열 패드로 옮깁니다. 코 콘을 사용하여 2 % -3 % 세보 플루 란으로 마취를 간략하게 유지하십시오.
6. 건조를 방지하기 위해 눈에 수성 윤활제를 바르십시오.
7. 진통제를 위해 0.05 mg / kg의 부 프레 노르 핀을 피하 주사하십시오.
8. 수술을 준비하려면 복부를 면도하고 요오드 포비돈 용액으로 수술을 위해 피부를 준비하십시오. 알코올 또는 멸균 물티슈로 피부를 닦으십시오.
9. 프로포폴 기반 TIVA를 전달하려면 멸균 폴리 우레탄 카테터에 부착 된 멸균 30G 피하 주사 바늘을 사용하여 측면 꼬리 정맥을 캐뉼 레이트하십시오. 혈액 플래시백을 통해 카테터에 올바른 배치를 확인합니다(그림 1B). 각막 및 페달 반사의 손실로 입증 된 안정적인 마취 깊이를 유지하기 위해 정맥 캐뉼러 동안 필요에 따라 세보 플루 란의 전달을 조정하고 분당 100 회 호흡< 호흡합니다.
10. 2 분 이상 동안 27 mg / kg의 초기 볼 루스로 1 % propofol을 투여하여 propofol-TIVA를 시작하십시오. 세보 플루 란 투여를 중단하십시오.
11. 수술 기간 동안 안정적인 마취 깊이를 유지하기 위해 2.2-4.0 mg / kg / min의 유지 속도로 propofol을 계속 주입하십시오 (그림 1C).

4. 원발성 종양 절제

1. 왼쪽 네 번째 유방 지방 패드의 영역에서 종양보다 열등한 직선 1cm 절개를하십시오. 무딘 집게로 해부를 사용하여 종양과 왼쪽 사타구니 림프절을 조심스럽게 절제하십시오.
2. 선택 사항: 루시페라제 태그가 있는 종양 세포를 사용하는 경우 생물발광 이미징을 사용하여 명확한 수술 마진을 확인합니다. 150mg/kg D-루시페린을 측면 꼬리 정맥에 주입하고 2분 동안 기다린 다음 생물 발광 이미징 시스템을 사용하여 60초 동안 이미징합니다. 잔류 종양이 확인되면 유방 지방 패드에서 추가 조직을 절제하고 다시 이미지화하여 명확한 여백을 얻습니다.
3. 수술 부위의 지혈을 확인하고 5-0 나일론 봉합사를 사용하여 피부를 닫습니다. 모피가 수술 부위에 들어 가지 않도록하십시오.
4. 절제 수술이 끝나면 마취를 중단하십시오. 마우스를 37°C 가열 패드의 깨끗한 케이지에 넣고 마취에서 회복되도록 합니다.
5. 마우스가 정상적인 각성으로 돌아올 때까지 마취 후 15분마다 모니터링합니다. 그런 다음 수술 후 48시간 동안 12시간마다 마우스를 모니터링합니다.
6. 수술 후 0.05 시간 동안 12 시간마다 부 프레 노르 핀 48 mg / kg을 피하 투여하십시오.
7. 7-10 일 후, 간단한 세보 플루 란 또는 이소 플루 란 마취하에 멸균 곡선 스티치 커터를 사용하여 봉합사를 제거하십시오.

5. 생체 내 영상으로 암 재발 추적

1. 생물 발광 이미징을 사용하여 절제 수술 후 암 재발을 비침습적으로 추적합니다. 생물 발광 이미징 시스템을 사용하여 수술 다음 주일부터 원발성 종양 재발 또는 원격 재발의 증거가 있는지 일주일에 한 번 마우스를 모니터링합니다.
2. 유도 챔버에서 마우스의 마취를 4% 이소플루란으로 유도한다. 그런 다음 마우스를 마취 기간 동안 37°C 가열 패드로 옮기고 코 콘을 사용하여 2%-4% 이소플루란으로 마취를 유지합니다.
3. 건조를 방지하기 위해 눈에 수성 윤활제를 바르십시오.
4. D- 루시페린 150 mg / kg을 측면 꼬리 정맥에 주사하십시오. 2분 동안 기다린 다음 60초 노출에 대한 생물 발광을 측정하여 원발성 종양의 재발 또는 원격 전이를 감지합니다.
5. 원발성 종양이 재발하고 만져지면 캘리퍼스 측정을 사용하여 종양 성장 모니터링을 시작합니다.
6. 실험이 끝나면 승인 된 프로토콜에 따라 마우스를 인도적으로 죽입니다. 여기서,_CO2 를 사용하고, 이어서 자궁경부 탈구를 사용하였다.

결과

이 방법은 마우스에서 암 절제 수술 중 propofol을 사용한 총 정맥 마취 (TIVA) 모델을 설명합니다. Propofol은 암 수술을 위한 마취의 임상 환경에서 TIVA의 전달을 복제하기 위해 주사기 펌프(그림 1A,B)를 사용하는 정맥 카테터를 통해 이 마우스 모델에서 전달됩니다. 주사기 펌프를 사용하면 흡입 마취에 의한 초기 유도에서 정맥 내 전달로 신속하게 전환 할 수 있으므...

토론

이 연구는 암 수술이 필요한 환자에서 TIVA에 대한 임상 실습의 주요 측면을 복제하는 유방암 마우스 모델에서 propofol과 함께 총 정맥 마취 (TIVA)를 투여하는 프로토콜에 대해보고합니다. 이 프로토콜을 사용하면 사이토카인 수준 및 암 재발 측정을 포함하여 암 진행의 마우스 모델에서 암 수술 후 단기 및 장기 임상적으로 관련된 결과를 모두 조사할 수 있습니다(그림 2 및

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline	Fresnius Kabi	AUST R 197198
Artery forceps	Proscitech	TS1322-140
Buprenorphine	Temgesic	TEMG I
Heated surgical mat	Custom	-
Hypodermic needle (30 G, 1 mL insulin syringe)	Terumo	NN3013R
IVIS Lumina	PerkinElmer	126274
Luciferin	Promega	P1041/2/3
Polyurethane catheter	Intramedic	427401
Povidone Iodine	Betadine	AUST R 29562
Propofol Lipuro, 2%	Braun	3521490
Sevoflurane	Baxter	ANZ2L9117
Sevoflurane vaporiser	Vetquip	VQ1334
Sterile gauze	Multigate Medical Products	11-600A
Surgical scissors	Proscitech	TS1044
Sutures, 5-0 nylon	Dynek	V504
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Syringes (1 mL)	Terumo	SS+01T