Un modelo de ratón in vivo de anestesia intravenosa total durante la cirugía de resección del cáncer

Resumen

Este artículo describe un método para modelar la anestesia intravenosa total (TIVA) durante la cirugía de resección del cáncer en ratones. El objetivo es replicar las características clave de la administración de anestesia a pacientes con cáncer. El método permite investigar cómo la técnica anestésica afecta la recurrencia del cáncer después de la cirugía de resección.

Resumen

La anestesia es un componente rutinario de la atención del cáncer que se utiliza para procedimientos diagnósticos y terapéuticos. La técnica anestésica se ha implicado recientemente en el impacto de los resultados del cáncer a largo plazo, posiblemente a través de la modulación de las respuestas adrenérgico-inflamatorias que afectan el comportamiento de las células cancerosas y la función de las células inmunes. La evidencia emergente indica que la anestesia intravenosa total (AIV) basada en propofol puede ser beneficiosa para los resultados del cáncer a largo plazo en comparación con la anestesia volátil inhalada. Sin embargo, los hallazgos clínicos disponibles son inconsistentes. Los estudios preclínicos que identifican los mecanismos subyacentes involucrados son críticamente necesarios para guiar el diseño de estudios clínicos que acelerarán la comprensión. La mayoría de los modelos preclínicos de anestesia se han extrapolado del uso de anestesia en la investigación in vivo y no están diseñados de manera óptima para estudiar el impacto de la anestesia en sí como el punto final primario. Este documento describe un método para administrar anestesia con propofol-TIVA en un modelo de ratón de resección de cáncer de mama que replica aspectos clave de la administración clínica en pacientes con cáncer. El modelo se puede utilizar para estudiar los mecanismos de acción de la anestesia en los resultados del cáncer en diversos tipos de cáncer y se puede extrapolar a otras áreas no cancerosas de la investigación preclínica de la anestesia.

Introducción

Más de 60 % de los pacientes con cáncer reciben anestesia para la resección quirúrgica¹. Actualmente, no existen guías clínicas específicas que determinen la elección de la anestesia utilizada en pacientes con cáncer. Las encuestas de anestesiólogos indican una preferencia por la anestesia volátil, incluso durante la cirugía del cáncer ^2,3. Sin embargo, hay un creciente cuerpo de evidencia de que el uso de anestesia intravenosa total (TIVA) a base de propofol durante la cirugía del cáncer puede asociarse con mejores resultados posoperatorios (supervivencia libre de progresión, supervivencia general) en comparación con la anestesia volátil⁴. Estudios clínicos posteriores continúan reportando resultados contradictorios 5,6,7,8. Estos hallazgos respaldan la necesidad de estudios preclínicos para comprender mejor los efectos mecanicistas de diferentes agentes anestésicos en los resultados relacionados con el cáncer.

Sin embargo, en los estudios in vivo que modelan la cirugía del cáncer, la anestesia es con frecuencia una parte incidental del procedimiento. La justificación para la elección de la anestesia a menudo no es el foco del diseño experimental, y su impacto en los puntos finales relacionados con el cáncer puede no ser evaluado. Por ejemplo, los estudios in vivo que requieren mantenimiento de anestesia para la cirugía del cáncer utilizan con mayor frecuencia anestesia volátil inhalada⁹. Cuando el propofol ha sido utilizado en estudios in vivo , ha sido administrado por dosificación en bolo único con administración intraperitoneal, que no replica los protocolos oncoanestésicos clínicos¹⁰. Ese enfoque de administración de propofol induce una anestesia ligera que es adecuada para procedimientos rápidos. Sin embargo, no permite el mantenimiento de la anestesia que se requiere para la cirugía de resección del cáncer que puede ser prolongada. Además, la cinética de absorción de la administración intraperitoneal es distinta de los métodos clínicos de administración.

Se desarrolló un modelo de TIVA basada en propofol para la cirugía de resección del cáncer para abordar esta necesidad. Se desarrolló un protocolo para el mantenimiento sostenido de la anestesia con titulación del agente anestésico para permitir la respuesta al estímulo quirúrgico para replicar aspectos clave de la administración del anestésico a los pacientes sometidos a cirugía de cáncer. El protocolo resultante se utiliza con un modelo de ratón de cáncer para proporcionar TIVA durante la cirugía de resección del cáncer. Se evalúa el efecto sobre los resultados relacionados con el cáncer a corto y largo plazo.

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Protocolo

Todos los estudios en animales se llevaron a cabo bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Monash. En este estudio, se utilizaron ratones Balb / c hembras de 6-8 semanas de edad.

1. Preparar las células cancerosas

1. Cultivar células tumorales en medio. Cultivo de 66cl4 de células de cáncer de mama murino en alfa-MEM que contienen 10% de FBS y 200 mM de glutamina. Las células deben enviar mensajes de texto negativos para micoplasma. OPCIONAL: Utilice células que se transducen de manera estable para expresar luciferasa de luciérnaga para imágenes de bioluminiscencia para permitir el monitoreo de la recurrencia del cáncer después de la cirugía de resección¹¹ (consulte el paso 4).
   NOTA: La línea celular y el medio mencionados anteriormente fueron utilizados en este estudio.
2. Cultivar células a 37 °C con 5% de_CO2. Células de paso asépticamente en una campana a <80% de confluencia. Utilice células de paso bajo en la fase de crecimiento logarítmico para obtener resultados óptimos in vivo .
3. Levantar las células adherentes con 0,5 mg/ml de tripsina en PBS con 10 mM EDTA; 2 ml para un matraz T75. Cuando se levante, agregue medio para inactivar la tripsina y lave las células en PBS.
4. Contar las células con un hemocitómetro. Diluir las células en PBS para inyección. Para 66cl4 células de cáncer de mama, inyecte 1 x 10⁵ células en 20 μL de PBS por ratón.
5. Coloque las células en hielo antes de la inyección.

2. Generar un modelo de ratón de cáncer de mama

1. Use isoflurano al 4% para anestesiar al ratón en una cámara de inducción. Luego, mantenga la anestesia con 2% -3% de isoflurano usando un cono nasal. Confirme la anestesia adecuada por falta de respuesta al pellizco del dedo del pie.
2. Prepare el lugar de la inyección limpiando la cuarta área izquierda de la almohadilla mamaria con un hisopo con alcohol de un solo uso.
3. Extraiga las células tumorales (ver paso 1.4) en una jeringa Hamilton de 25 μL conectada a una aguja hipodérmica estéril de 27 G.
4. Inyecte las células en la cuarta almohadilla mamaria izquierda. Use fórceps para asegurar y levantar la piel. Inyecte aproximadamente 1 mm del pezón.
5. OPCIONAL: Si las células están marcadas con luciferasa, confirme la inyección exitosa de células tumorales mediante imágenes de bioluminiscencia. Inyectar 100 μL de 150 mg/kg de D-luciferina en la vena lateral de la cola de los ratones anestesiados utilizando una jeringa de insulina de 0,5 ml con una aguja hipodérmica de 30 G.
6. OPCIONAL: Coloque el ratón en un sistema de imágenes de bioluminiscencia con la almohadilla mamaria hacia arriba. Espere 2 minutos desde la inyección de luciferina para una absorción tisular óptima de luciferina, luego imagen durante 10 s.
7. Coloque al ratón en una jaula limpia y permita que se recupere de la anestesia.
8. Continuar monitoreando el bienestar animal según las pautas institucionales de ética animal.

3. Inducir anestesia estable con administración intravenosa de propofol

1. Monitoree el crecimiento del tumor primario usando la medición del calibrador y calcule el volumen del tumor usando la ecuación: Volumen (mm³) = (largo x (ancho)2 ÷ ² ).
2. Realizar cirugía de resección tumoral en ratones cuando el tumor primario alcanza el volumen requerido (aquí, 80-90 mm³).
3. Configure una bomba de jeringa automatizada con una jeringa de insulina de 30 G 1 ml que contenga la formulación de propofol (2% Lipuro propofol) (Figura 1A).
4. Inducir la anestesia del ratón en una cámara de inducción con sevoflurano o isoflurano al 3%.
   NOTA: Aquí, se utilizó sevoflurano ya que es el volátil predominante utilizado clínicamente.
5. Transfiera el ratón a una almohadilla térmica a 37 °C durante la cirugía. Mantenga brevemente la anestesia con 2% -3% de sevoflurano usando un cono nasal.
6. Aplique lubricante acuoso en los ojos para evitar que se sequen.
7. Inyecte 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea para analgesia.
8. Para prepararse para la cirugía, afeite el abdomen y prepare la piel para la cirugía con una solución de yodo-povidona. Limpie la piel con una toallita con alcohol o estéril.
9. Para administrar TIVA a base de propofol, cannule la vena lateral de la cola con una aguja hipodérmica estéril de 30 G conectada a un catéter de poliuretano estéril. Confirme la colocación correcta mediante un flashback de sangre en el catéter (Figura 1B). Ajustar la administración de sevoflurano según sea necesario durante la canulación intravenosa para mantener una profundidad estable de anestesia demostrada por la pérdida del reflejo corneal y pedal, y la frecuencia respiratoria < 100 respiraciones por minuto.
10. Comience propofol-TIVA administrando propofol al 2% como bolo inicial de 27 mg/kg durante más de 1 min. Suspender la administración de sevoflurano.
11. Continuar la infusión de propofol a una velocidad de mantenimiento de 2,2-4,0 mg/kg/min para mantener una profundidad estable de la anestesia durante la cirugía (Figura 1C).

4. Resecar el tumor primario

1. Haga una incisión recta de 1 cm inferior al tumor en la región de la cuarta almohadilla mamaria izquierda. Resecar cuidadosamente el tumor y el ganglio linfático inguinal izquierdo mediante disección con fórceps romos.
2. OPCIONAL: Si usa células tumorales marcadas con luciferasa, use imágenes de bioluminiscencia para confirmar márgenes quirúrgicos claros. Inyecte 150 mg/kg de D-luciferina en la vena lateral de la cola, espere 2 min y luego tome una imagen durante 60 s utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia. Si se identifica un tumor residual, reseque tejido adicional de la almohadilla grasa mamaria y vuelva a crear una imagen para lograr márgenes claros.
3. Asegure la hemostasia en el sitio quirúrgico y cierre la piel con suturas de nylon 5-0. Asegúrese de que el pelaje no ingrese al sitio quirúrgico.
4. Al concluir la cirugía de resección, suspender la anestesia. Coloque el ratón en una jaula limpia sobre una almohadilla térmica a 37 °C y permita que se recupere de la anestesia.
5. Monitoree cada 15 minutos después de la anestesia hasta que el ratón haya vuelto al estado de alerta normal. Luego, monitoree el ratón cada 12 h durante 48 h después de la cirugía.
6. Administrar 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea cada 12 h durante 48 h después de la cirugía.
7. Después de 7-10 días, retire las suturas con cortadores de puntadas curvas estériles bajo anestesia breve con sevoflurano o isoflurano.

5. Realice un seguimiento de la recurrencia del cáncer con imágenes in vivo

1. Utilice imágenes de bioluminiscencia para rastrear la recurrencia del cáncer después de la cirugía de resección de forma no invasiva. Utilice un sistema de imágenes de bioluminiscencia para monitorear a los ratones una vez por semana en busca de evidencia de recurrencia tumoral primaria o recurrencia a distancia, comenzando la semana siguiente a la cirugía.
2. Inducir la anestesia del ratón en una cámara de inducción con isoflurano al 4%. Luego, transfiera el ratón a una almohadilla térmica de 37 ° C durante la anestesia y mantenga la anestesia con isoflurano al 2% -4% usando un cono nasal.
3. Aplique lubricante acuoso en los ojos para evitar que se sequen.
4. Inyecte D-luciferina 150 mg/kg en la vena lateral de la cola. Espere 2 minutos, luego mida la bioluminiscencia durante una exposición de 60 s para detectar la recurrencia del tumor primario o metástasis a distancia.
5. Si el tumor primario recidiva y se vuelve palpable, comience a monitorear el crecimiento del tumor utilizando mediciones de calibrador.
6. Al final del experimento, mata humanamente a los ratones de acuerdo con el protocolo aprobado. Aquí, se utilizó CO₂ , seguido de luxación cervical.

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Resultados

Este método describe un modelo de anestesia intravenosa total (TIVA) con propofol durante la cirugía de resección del cáncer en ratones. El propofol se administra en este modelo de ratón a través de un catéter intravenoso utilizando una bomba de jeringa (Figura 1A, B) para replicar la administración de TIVA en el entorno clínico de la anestesia para la cirugía del cáncer. El uso de la bomba de jeringa minimiza la exposición a la anestesia volátil al permitir una...

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Discusión

Este estudio informa sobre un protocolo para administrar anestesia intravenosa total (TIVA) con propofol en un modelo de ratón de cáncer de mama que replica aspectos clave de la práctica clínica para TIVA en pacientes que requieren cirugía de cáncer. El protocolo permite la investigación de resultados clínicamente relevantes a corto y largo plazo después de la cirugía de cáncer en un modelo de ratón de progresión del cáncer, incluida la medición de los niveles de citoquinas y la recurrencia del cáncer (

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline	Fresnius Kabi	AUST R 197198
Artery forceps	Proscitech	TS1322-140
Buprenorphine	Temgesic	TEMG I
Heated surgical mat	Custom	-
Hypodermic needle (30 G, 1 mL insulin syringe)	Terumo	NN3013R
IVIS Lumina	PerkinElmer	126274
Luciferin	Promega	P1041/2/3
Polyurethane catheter	Intramedic	427401
Povidone Iodine	Betadine	AUST R 29562
Propofol Lipuro, 2%	Braun	3521490
Sevoflurane	Baxter	ANZ2L9117
Sevoflurane vaporiser	Vetquip	VQ1334
Sterile gauze	Multigate Medical Products	11-600A
Surgical scissors	Proscitech	TS1044
Sutures, 5-0 nylon	Dynek	V504
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Syringes (1 mL)	Terumo	SS+01T