Kanser Rezeksiyon Cerrahisi Sırasında Total İntravenöz Anestezinin In Vivo Fare Modeli

Özet

Bu yazıda farelerde kanser rezeksiyon cerrahisi sırasında total intravenöz anestezinin (TIVA) modellenmesinde kullanılan bir yöntem anlatılmaktadır. Amaç, anestezi uygulamasının temel özelliklerini kanserli hastalara çoğaltmaktır. Yöntem, anestezik tekniğin rezeksiyon cerrahisinden sonra kanser nüksünü nasıl etkilediğinin araştırılmasına izin verir.

Özet

Anestezi, kanser bakımının tanısal ve terapötik prosedürler için kullanılan rutin bir bileşenidir. Anestezik teknik son zamanlarda, muhtemelen kanser hücresi davranışını ve bağışıklık hücresi fonksiyonunu etkileyen adrenerjik-enflamatuar yanıtların modülasyonu yoluyla uzun vadeli kanser sonuçlarını etkilemede rol oynamıştır. Ortaya çıkan kanıtlar, propofol bazlı total intravenöz anestezinin (TIVA), inhale uçucu anestezi ile karşılaştırıldığında uzun süreli kanser sonuçları için yararlı olabileceğini düşündürmektedir. Ancak mevcut klinik bulgular tutarsızdır. İlgili altta yatan mekanizmaları tanımlayan klinik öncesi çalışmalara, içgörüyü hızlandıracak klinik çalışmaların tasarımına rehberlik etmek için kritik olarak ihtiyaç duyulmaktadır. Çoğu preklinik anestezi modeli, in vivo araştırmalarda anestezi kullanımından ekstrapolasyon yapılmıştır ve anestezinin kendisinin birincil son nokta olarak etkisini incelemek için en uygun şekilde tasarlanmamıştır. Bu yazıda, kanser hastalarında klinik doğumun kilit yönlerini kopyalayan bir fare meme kanseri rezeksiyonu modelinde propofol-TIVA anestezisi verilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Model, anestezinin çeşitli kanser türlerinde kanser sonuçları üzerindeki etki mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir ve klinik öncesi anestezi araştırmasının diğer kanser dışı alanlarına ekstrapolasyon yapılabilir.

Giriş

Kanserli hastaların% 60'ından fazlası cerrahi rezeksiyon için anestezi alır¹. Şu anda, kanser hastalarında kullanılan anestezi seçimini belirleyen spesifik bir klinik kılavuz bulunmamaktadır. Anestezistlerin anketleri, kanser cerrahisi sırasında da dahil olmak üzere uçucu bazlı anestezi tercihini göstermektedir ^2,3. Bununla birlikte, kanser cerrahisi sırasında propofol bazlı total intravenöz anestezi (TIVA) kullanımının, uçucu anestezi⁴ ile karşılaştırıldığında daha iyi postoperatif sonuçlarla (progresyonsuz sağkalım, genel sağkalım) ilişkili olabileceğine dair artan sayıda kanıt vardır. Sonraki klinik çalışmalar^çelişkili sonuçlar bildirmeye devam etmektedir 5,6,7,8. Bu bulgular, farklı anestezik ajanların kanserle ilişkili sonuçlar üzerindeki mekanik etkilerini daha iyi anlamak için klinik öncesi çalışmalara duyulan ihtiyacı desteklemektedir.

Bununla birlikte, kanser cerrahisini modelleyen in vivo çalışmalarda, anestezi sıklıkla prosedürün tesadüfi bir parçasıdır. Anestezi seçiminin gerekçesi genellikle deneysel tasarımın odak noktası değildir ve kansere bağlı sonlanım noktaları üzerindeki etkisi değerlendirilemeyebilir. Örneğin, kanser cerrahisi için anestezinin sürdürülmesini gerektiren in vivo çalışmalarda en sık inhale uçucu anestezi⁹ kullanılmaktadır. Propofolün in vivo çalışmalarda kullanıldığı yerlerde, klinik onko-anestezik protokolleri çoğaltmayan intraperitoneal doğum ile tek bolus dozlaması ile sağlanmıştır¹⁰. Propofol uygulamasının bu yaklaşımı, hızlı prosedürler için uygun olan hafif anesteziyi indükler. Ancak kanser rezeksiyonu ameliyatı için gerekli olan ve uzaması mümkün olan anestezinin sürdürülmesine izin vermez. Ayrıca, intraperitoneal doğumun absorpsiyon kinetiği klinik uygulama yöntemlerinden farklıdır.

Bu ihtiyacı karşılamak için kanser rezeksiyon cerrahisi için propofol tabanlı bir TIVA modeli geliştirilmiştir. Kanser cerrahisi geçiren hastalara anestezik sunumun kilit yönlerini çoğaltmak için cerrahi uyarana yanıt vermek için anestezik ajanın titrasyonu ile anestezinin sürekli sürdürülmesi için bir protokol geliştirilmiştir. Ortaya çıkan protokol, kanser rezeksiyon ameliyatı sırasında TIVA sağlamak için bir fare kanser modeli ile birlikte kullanılır. Kısa ve uzun dönem kansere bağlı sonuçlar üzerindeki etkisi değerlendirilir.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları, Monash Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin onayı altında gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada 6-8 haftalık dişi Balb/c fareler kullanılmıştır.

1. Kanser hücrelerini hazırlayın

1. Kültür tümör hücreleri ortada. Kültür 66cl4 murin meme kanseri hücreleri alfa-MEM'de %10 FBS ve 200 mM glutamin içerir. Hücreler mikoplazma için negatif metin oluşturmalıdır. İSTEĞE BAĞLI: Rezeksiyon cerrahisi^11'den sonra kanser nüksünün izlenmesini sağlamak için biyolüminesans görüntüleme için ateşböceği lusiferazı eksprese etmek için kararlı bir şekilde dönüştürülmüş hücreler kullanın (bkz. adım 4).
   NOT: Bu çalışmada hücre çizgisi ve yukarıda belirtilen ortam kullanılmıştır.
2. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO_{2 ile büyütün}. Pasaj hücreleri aseptik olarak bir başlıkta% <80 akıcılıkta. Optimal in vivo sonuçlar için logaritmik büyüme fazında düşük geçişli hücreler kullanın.
3. 10 mM EDTA ile PBS'de 0.5 mg / mL tripsin ile yapışkan hücreleri kaldırın; T75 şişe için 2 mL. Kaldırıldığında, tripsini inaktive etmek için ortam ekleyin ve hücreleri PBS'de yıkayın.
4. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Enjeksiyon için PBS'deki hücreleri seyreltin. 66cl4 meme kanseri hücreleri için, fare başına 20 μL PBS'ye 1 x 10⁵ hücre enjekte edin.
5. Enjeksiyondan önce hücreleri buzun üzerine yerleştirin.

2. Meme kanserinin fare modelini oluşturun

1. Fareyi bir indüksiyon odasında uyuşturmak için% 4 izofluran kullanın. Daha sonra, bir burun konisi kullanarak% 2-3 izofluran ile anesteziyi sürdürün. Ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermeyerek uygun anesteziyi onaylayın.
2. Tek kullanımlık alkollü çubukla dördüncü sol meme yağ yastığı bölgesini silerek enjeksiyon bölgesini hazırlayın.
3. Tümör hücrelerini (bkz. adım 1.4) steril bir 27 G hipodermik iğneye bağlı 25 μL Hamilton şırıngasına hazırlayın.
4. Hücreleri dördüncü sol meme yağ yastığına enjekte edin. Cildi sabitlemek ve kaldırmak için forseps kullanın. Meme ucundan yaklaşık 1 mm enjekte edin.
5. İSTEĞE BAĞLI: Hücreler lusiferaz ile etiketlenmişse, biyolüminesans görüntüleme ile tümör hücrelerinin başarılı bir şekilde enjekte edildiğini onaylayın. 30 G hipodermik iğne ile 0.5 mL'lik bir insülin şırıngası kullanarak anestezi uygulanan farelerin lateral kuyruk damarına 100 μL 150 mg / kg D-luciferin enjekte edin.
6. İSTEĞE BAĞLI: Fareyi, meme yağ yastığı yukarı bakacak şekilde bir biyolüminesans görüntüleme sistemine yerleştirin. Lusiferinin optimal doku alımı için lusiferin enjeksiyonundan 2 dakika bekleyin, ardından 10 s boyunca görüntü.
7. Fareyi temiz bir kafese yerleştirin ve anesteziden kurtulmasına izin verin.
8. Kurumsal hayvan etiği kurallarına göre hayvan refahını izlemeye devam edin.

3. Propofolün intravenöz verilmesi ile stabil anesteziyi indükleyin

1. Kaliper ölçümünü kullanarak primer tümörün büyümesini izleyin ve denklemi kullanarak tümör hacmini hesaplayın: Hacim (mm³) = (uzunluk x (genişlik)2 ÷ ² ).
2. Primer tümör gerekli hacme ulaştığında farelerde tümör rezeksiyon ameliyatı yapın (burada, 80-90^mm3).
3. Propofol formülasyonu (% 2 Lipuro propofol) içeren 30 G 1 mL insülin şırıngasına sahip otomatik bir şırınga pompası kurun (Şekil 1A).
4. % 3 sevofluran veya izofluran içeren bir indüksiyon odasında farenin anestezisini indükleyin.
   NOT: Burada, klinik olarak kullanılan baskın uçucu madde olduğu için sevofluran kullanılmıştır.
5. Ameliyat süresince fareyi 37 °C'lik bir ısıtma yastığına aktarın. Bir burun konisi kullanarak% 2 -% 3 sevofluran ile anesteziyi kısaca sürdürün.
6. Kurumayı önlemek için gözlere sulu yağlayıcı uygulayın.
7. Analjezi için deri altından 0.05 mg/kg büprenorfin enjekte edin.
8. Ameliyata hazırlanmak için karnı tıraş edin ve cildi bir iyot-povidon çözeltisi ile ameliyat için hazırlayın. Cildi alkol veya steril bir mendil kullanarak silin.
9. Propofol bazlı TIVA vermek için, steril bir poliüretan kateterine bağlı steril bir 30 G hipodermik iğne kullanarak lateral kuyruk damarını kanüle edin. Kateterin içine kan geri dönüşü ile doğru yerleşimi onaylayın (Şekil 1B). Kornea ve pedal refleksi kaybı ile gösterilen stabil bir anestezi derinliğini ve dakikada 100 nefese < solunum hızını korumak için intravenöz kanülasyon sırasında sevofluran verilmesini gerektiği gibi ayarlayın.
10. Propofol-TİVA'yı, 1 dakikadan fazla bir süre boyunca 27 mg / kg'lık bir başlangıç bolusu olarak% 2 propofol uygulayarak başlatın. Serofluran uygulamasını durdurun.
11. Ameliyat süresince stabil bir anestezi derinliğini korumak için propofol infüzyonuna 2.2-4.0 mg / kg / dak bakım hızında devam edin (Şekil 1C).

4. Primer tümörü rezeke edin

1. Sol dördüncü meme yağ yastığı bölgesinde tümörden daha düşük düz 1 cm'lik bir kesi yapın. Künt forseps ile diseksiyon kullanarak tümörü ve sol inguinal lenf nodunu dikkatlice rezeke edin.
2. İSTEĞE BAĞLI: Lusiferaz etiketli tümör hücreleri kullanıyorsanız, net cerrahi sınırları doğrulamak için biyolüminesans görüntüleme kullanın. Yanal kuyruk damarına 150 mg / kg D-lusiferin enjekte edin, 2 dakika bekleyin ve ardından bir biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanarak 60 s boyunca görüntü alın. Kalıntı bir tümör tespit edilirse, meme yağ yastığından ek dokuyu rezeke edin ve net marjlar elde etmek için yeniden görüntüleyin.
3. Ameliyat bölgesinde hemostaz sağlayın ve 5-0 naylon sütür kullanarak cildi kapatın. Kürkün cerrahi bölgeye girmediğinden emin olun.
4. Rezeksiyon ameliyatının sonunda anesteziyi durdurun. Fareyi 37 °C ısıtma yastığı üzerinde temiz bir kafese yerleştirin ve anesteziden kurtulmasını sağlayın.
5. Anesteziden sonra fare normal uyanıklığa dönene kadar her 15 dakikada bir izleyin. Ardından, ameliyattan sonra fareyi her 12 saatte bir 48 saat boyunca izleyin.
6. Ameliyattan sonra 48 saat boyunca her 12 saatte bir deri altından 0.05 mg / kg buprenorfin uygulayın.
7. 7-10 gün sonra, kısa sevofluran veya izofluran anestezisi altında steril kavisli dikiş kesiciler kullanarak dikişleri çıkarın.

5. İn vivo görüntüleme ile kanser nüksünü izleyin

1. Rezeksiyon cerrahisinden sonra invaziv olmayan kanser nüksünü izlemek için biyolüminesans görüntüleme kullanın. Primer tümör nüksünün veya uzak nüksün kanıtı için fareleri haftada bir kez izlemek için bir biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanın, ameliyattan sonraki haftadan başlayarak.
2. % 4 izofluran içeren bir indüksiyon odasında farenin anestezisini indükleyin. Daha sonra, fareyi anestezi süresi boyunca 37 ° C'lik bir ısıtma yastığına aktarın ve bir burun konisi kullanarak% 2-4 izofluran ile anesteziyi sürdürün.
3. Kurumayı önlemek için gözlere sulu yağlayıcı uygulayın.
4. Yanal kuyruk damarına 150 mg/kg D-lusiferin enjekte edin. 2 dakika bekleyin, ardından primer tümörün veya uzak metastazın nüksetmesini tespit etmek için 60 sn'lik bir maruziyet üzerinde biyolüminesansı ölçün.
5. Primer tümör tekrarlarsa ve elle tutulur hale gelirse, kumpas ölçümlerini kullanarak tümör büyümesini izlemeye başlayın.
6. Deneyin sonunda, onaylanmış protokole göre fareleri insancıl bir şekilde öldürün. Burada CO₂ kullanıldı, bunu servikal çıkık izledi.

Sonuçlar

Bu yöntem, farelerde kanser rezeksiyon cerrahisi sırasında propofol ile total intravenöz anestezi (TIVA) modelini tanımlamaktadır. Propofol, bu fare modelinde, kanser cerrahisi için anestezinin klinik ortamında TIVA verilmesini çoğaltmak için bir şırınga pompası (Şekil 1A, B) kullanılarak intravenöz bir kateter yoluyla verilir. Şırınga pompasının kullanımı, inhalasyonel anestezi ile ilk indüksiyondan intravenöz doğuma hızlı bir dönüşüm sağl...

Tartışmalar

Bu çalışma, kanser cerrahisi gerektiren hastalarda TIVA için klinik uygulamanın kilit yönlerini kopyalayan bir fare meme kanseri modelinde propofol ile toplam intravenöz anestezi (TIVA) uygulanması için bir protokol hakkında rapor vermektedir. Protokol, sitokin düzeylerinin ve kanser nüksünün ölçülmesi de dahil olmak üzere kanser progresyonunun bir fare modelinde kanser cerrahisinden sonra hem kısa vadeli hem de uzun vadeli klinik olarak ilgili sonuçların araştırılmasına izin verir (Şekil

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline	Fresnius Kabi	AUST R 197198
Artery forceps	Proscitech	TS1322-140
Buprenorphine	Temgesic	TEMG I
Heated surgical mat	Custom	-
Hypodermic needle (30 G, 1 mL insulin syringe)	Terumo	NN3013R
IVIS Lumina	PerkinElmer	126274
Luciferin	Promega	P1041/2/3
Polyurethane catheter	Intramedic	427401
Povidone Iodine	Betadine	AUST R 29562
Propofol Lipuro, 2%	Braun	3521490
Sevoflurane	Baxter	ANZ2L9117
Sevoflurane vaporiser	Vetquip	VQ1334
Sterile gauze	Multigate Medical Products	11-600A
Surgical scissors	Proscitech	TS1044
Sutures, 5-0 nylon	Dynek	V504
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Syringes (1 mL)	Terumo	SS+01T