Um modelo de camundongo In Vivo de anestesia intravenosa total durante a cirurgia de ressecção do câncer

Resumo

Este artigo descreve um método para modelar a anestesia venosa total (TIVA) durante a cirurgia de ressecção de câncer em camundongos. O objetivo é replicar as principais características da administração anestésica a pacientes com câncer. O método permite investigar como a técnica anestésica afeta a recorrência do câncer após a cirurgia de ressecção.

Resumo

A anestesia é um componente de rotina do tratamento do câncer que é usado para procedimentos diagnósticos e terapêuticos. A técnica anestésica tem sido recentemente implicada em impactar os resultados do câncer a longo prazo, possivelmente através da modulação de respostas adrenérgico-inflamatórias que afetam o comportamento das células cancerígenas e a função das células imunes. Evidências emergentes sugerem que a anestesia intravenosa total (TIVA) baseada em propofol pode ser benéfica para os desfechos de câncer a longo prazo quando comparada à anestesia volátil inalatória. No entanto, os achados clínicos disponíveis são inconsistentes. Estudos pré-clínicos que identifiquem os mecanismos subjacentes envolvidos são criticamente necessários para orientar o desenho de estudos clínicos que acelerem a percepção. A maioria dos modelos pré-clínicos de anestesia foi extrapolada a partir do uso de anestesia em pesquisas in vivo e não são projetados de forma ideal para estudar o impacto da própria anestesia como desfecho primário. Este artigo descreve um método para a administração de anestesia propofol-TIVA em um modelo de camundongo de ressecção de câncer de mama que replica aspectos-chave da entrega clínica em pacientes com câncer. O modelo pode ser usado para estudar mecanismos de ação da anestesia sobre os resultados do câncer em diversos tipos de câncer e pode ser extrapolado para outras áreas não cancerígenas da pesquisa em anestesia pré-clínica.

Introdução

Mais de 60% dos pacientes com câncer recebem anestesia para ressecção cirúrgica¹. Atualmente, não existem diretrizes clínicas específicas que determinem a escolha da anestesia utilizada em pacientes com câncer. Levantamentos com anestesiologistas indicam preferência pela anestesia volátil, inclusive durante a cirurgia oncológica ^2,3. No entanto, há um crescente corpo de evidências de que o uso de anestesia venosa total (TIVA) baseada em propofol durante a cirurgia oncológica pode estar associado a melhores resultados pós-operatórios (sobrevida livre de progressão, sobrevida global) quando comparado à anestesia volátil⁴. Estudos clínicos subsequentes continuam a relatar resultados contraditórios 5,6,7,8. Esses achados reforçam a necessidade de estudos pré-clínicos para entender melhor os efeitos mecanicistas de diferentes agentes anestésicos nos desfechos relacionados ao câncer.

No entanto, em estudos in vivo que modelam a cirurgia de câncer, a anestesia é frequentemente uma parte incidental do procedimento. A justificativa para a escolha da anestesia muitas vezes não é o foco do delineamento experimental, e seu impacto nos desfechos relacionados ao câncer pode não ser avaliado. Por exemplo, estudos in vivo que requerem manutenção da anestesia para cirurgia oncológica mais comumente utilizam anestesia volátil inalatória⁹. Nos casos em que o propofol tem sido utilizado em estudos in vivo , ele foi administrado por dose única em bolus com administração intraperitoneal, que não replica protocolos clínicos onco-anestésicos¹⁰. Essa abordagem da administração de propofol induz anestesia leve que é adequada para procedimentos rápidos. No entanto, não permite a manutenção da anestesia que é necessária para a cirurgia de ressecção do câncer, que pode ser prolongada. Além disso, a cinética de absorção do parto intraperitoneal é distinta dos métodos clínicos de administração.

Um modelo de TIVA baseada em propofol para cirurgia de ressecção de câncer foi desenvolvido para atender a essa necessidade. Um protocolo para manutenção sustentada da anestesia com titulação do agente anestésico para permitir a resposta ao estímulo cirúrgico foi desenvolvido para replicar aspectos-chave da entrega anestésica a pacientes submetidos à cirurgia oncológica. O protocolo resultante é usado com um modelo de câncer em camundongo para fornecer TIVA durante a cirurgia de ressecção do câncer. O efeito sobre os resultados relacionados ao câncer de curto e longo prazo é avaliado.

Protocolo

Todos os estudos em animais foram realizados sob a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Monash. Neste estudo, foram utilizadas fêmeas de camundongos Balb/c com idades entre 6-8 semanas.

1. Prepare as células cancerosas

1. Cultura de células tumorais em meio. Cultura de células de câncer mamário murino 66cl4 em alfa-MEM contendo 10% de FBS e 200 mM de glutamina. As células devem enviar texto negativo para micoplasma. OPCIONAL: Use células que são transduzidas de forma estável para expressar luciferase de vagalume para imagens de bioluminescência para permitir o monitoramento da recorrência do câncer após a cirurgia de ressecção¹¹ (ver etapa 4).
   NOTA: A linhagem celular e o meio mencionado acima foram utilizados neste estudo.
2. Cultivar células a 37 °C com 5% de CO₂. Células de passagem assepticamente em um exaustor com <80% de confluência. Use células de baixa passagem na fase de crescimento logarítmico para obter ótimos resultados in vivo.
3. Levantar as células aderentes com 0,5 mg/mL de tripsina em PBS com EDTA 10 mM; 2 ml para um balão T75. Quando levantado, adicione o meio para desativar a tripsina e lave as células em PBS.
4. Conte as células usando um hemocitômetro. Dilua as células em PBS para injeção. Para 66cl4 células cancerígenas mamárias, injete 1 x 10⁵ células em 20 μL de PBS por rato.
5. Coloque as células no gelo antes da injeção.

2. Gerar um modelo de rato de câncer de mama

1. Use isoflurano a 4% para anestesiar o camundongo em uma câmara de indução. Em seguida, mantenha a anestesia com isoflurano a 2%-3% usando um cone nasal. Confirme a anestesia adequada por falta de resposta à beliscão do dedo do pé.
2. Prepare o local da injeção limpando a quarta área da almofada mamária esquerda usando um cotonete com álcool de uso único.
3. Desenhe as células tumorais (ver passo 1.4) numa seringa Hamilton de 25 μL ligada a uma agulha hipodérmica estéril de 27 G.
4. Injete as células na quarta almofada mamária esquerda. Use fórceps para prender e levantar a pele. Injete aproximadamente 1 mm do mamilo.
5. OPCIONAL: Se as células forem marcadas com luciferase, confirme a injeção bem-sucedida de células tumorais por imagem de bioluminescência. Injete 100 μL de 150 mg/kg de D-luciferina na veia lateral da cauda dos camundongos anestesiados usando uma seringa de insulina de 0,5 mL com uma agulha hipodérmica de 30 G.
6. OPCIONAL: Coloque o rato num sistema de imagem de bioluminescência com a almofada de gordura mamária virada para cima. Aguarde 2 minutos da injeção de luciferina para uma absorção tecidual ideal de luciferina e, em seguida, a imagem por 10 s.
7. Coloque o rato numa gaiola limpa e deixe-o recuperar da anestesia.
8. Continuar a monitorar o bem-estar animal de acordo com as diretrizes institucionais de ética animal.

3. Induzir anestesia estável com administração intravenosa de propofol

1. Monitorar o crescimento do tumor primário usando a medida do paquímetro e calcular o volume do tumor usando a equação: Volume (mm³) = (comprimento x (largura)2 ÷ ² ).
2. Realize a cirurgia de ressecção tumoral em camundongos quando o tumor primário atingir o volume necessário (aqui, 80-90 mm³).
3. Configure uma bomba de seringa automatizada com uma seringa de insulina 30 G 1 mL contendo formulação de propofol (Lipuro propofol a 2%) (Figura 1A).
4. Induzir anestesia do rato numa câmara de indução com sevoflurano ou isoflurano a 3%.
   NOTA: Aqui, o sevoflurano foi utilizado, pois este é o volátil predominante usado clinicamente.
5. Transfira o rato para uma almofada de aquecimento a 37 °C durante a cirurgia. Mantenha brevemente a anestesia com sevoflurano a 2%-3% usando um cone nasal.
6. Aplique lubrificante aquoso nos olhos para evitar a secagem.
7. Injete 0,05 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea para analgesia.
8. Para se preparar para a cirurgia, raspe o abdômen e prepare a pele para a cirurgia com uma solução de iodo-povidona. Limpe a pele usando um álcool ou lenço umedecido.
9. Para administrar a TIVA à base de propofol, canular a veia lateral da cauda usando uma agulha hipodérmica estéril de 30 G presa a um cateter de poliuretano estéril. Confirme a colocação correta por flashback de sangue no cateter (Figura 1B). Ajustar a administração de sevoflurano conforme necessário durante a canulação intravenosa para manter uma profundidade estável de anestesia demonstrada pela perda do reflexo corneano e pedal, e frequência respiratória < 100 respirações por minuto.
10. Iniciar propofol-TIVA administrando propofol a 2% como bolus inicial de 27 mg/kg por mais de 1 min. Cessar a administração de sevoflurano.
11. Continue a infusão de propofol a uma taxa de manutenção de 2,2-4,0 mg/kg/min para manter uma profundidade estável de anestesia durante a cirurgia (Figura 1C).

4. Ressecar o tumor primário

1. Faça uma incisão reta de 1 cm inferior ao tumor na região da almofada mamária quarta esquerda. Ressecar cuidadosamente o tumor e o linfonodo inguinal esquerdo usando dissecção com pinça contundente.
2. OPCIONAL: Se estiver usando células tumorais marcadas com luciferase, use imagens de bioluminescência para confirmar margens cirúrgicas claras. Injete 150 mg/kg de D-luciferina na veia lateral da cauda, aguarde 2 minutos e, em seguida, faça uma imagem por 60 s usando um sistema de imagem de bioluminescência. Se um tumor residual for identificado, resssecte o tecido adicional da almofada mamária e refaça a imagem para obter margens claras.
3. Assegure-se da hemostasia no local da cirurgia e feche a pele usando suturas de nylon 5-0. Certifique-se de que a pele não entre no local da cirurgia.
4. Na conclusão da cirurgia de ressecção, cesse a anestesia. Coloque o rato numa gaiola limpa numa almofada de aquecimento a 37 °C e deixe-o recuperar da anestesia.
5. Monitore a cada 15 minutos após a anestesia até que o rato tenha retornado ao estado de alerta normal. Em seguida, monitore o mouse a cada 12 h por 48 h após a cirurgia.
6. Administrar 0,05 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea a cada 12 h durante 48 h após a cirurgia.
7. Após 7-10 dias, remova as suturas usando cortadores de ponto curvos estéreis sob breve anestesia com sevoflurano ou isoflurano.

5. Acompanhe a recorrência do câncer com imagens in vivo

1. Use imagens de bioluminescência para rastrear a recorrência do câncer após a cirurgia de ressecção de forma não invasiva. Use um sistema de imagem de bioluminescência para monitorar os camundongos uma vez por semana em busca de evidências de recorrência do tumor primário ou recorrência à distância, começando na semana seguinte à cirurgia.
2. Induzir anestesia do rato numa câmara de indução com isoflurano a 4%. Em seguida, transfira o rato para uma almofada de aquecimento a 37 °C durante a anestesia e mantenha a anestesia com isoflurano a 2%-4% utilizando um cone nasal.
3. Aplique lubrificante aquoso nos olhos para evitar a secagem.
4. Injete D-luciferina 150 mg/kg na veia lateral da cauda. Aguarde 2 minutos e, em seguida, meça a bioluminescência ao longo de uma exposição de 60 s para detectar a recorrência do tumor primário ou metástase à distância.
5. Se o tumor primário se repetir e se tornar palpável, inicie o monitoramento do crescimento do tumor usando medidas de paquímetro.
6. No final do experimento, mate humanamente os ratos de acordo com o protocolo aprovado. Aqui, utilizou-se CO₂ , seguido de luxação cervical.

Resultados

Este método descreve um modelo de anestesia venosa total (TIVA) com propofol durante a cirurgia de ressecção de câncer em camundongos. O propofol é administrado neste modelo de camundongo através de um cateter intravenoso usando uma bomba de seringa (Figura 1A,B) para replicar a administração de TIVA no ambiente clínico de anestesia para cirurgia de câncer. O uso da bomba de seringa minimiza a exposição à anestesia volátil, permitindo a rápida conversão da in...

Discussão

Este estudo relata um protocolo para administração de anestesia venosa total (TIVA) com propofol em um modelo de camundongo de câncer de mama que replica aspectos-chave da prática clínica para TIVA em pacientes que necessitam de cirurgia oncológica. O protocolo permite a investigação de desfechos clinicamente relevantes a curto e longo prazo após a cirurgia de câncer em um modelo de camundongo de progressão do câncer, incluindo a medição dos níveis de citocinas e recorrência do câncer (Figura

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline	Fresnius Kabi	AUST R 197198
Artery forceps	Proscitech	TS1322-140
Buprenorphine	Temgesic	TEMG I
Heated surgical mat	Custom	-
Hypodermic needle (30 G, 1 mL insulin syringe)	Terumo	NN3013R
IVIS Lumina	PerkinElmer	126274
Luciferin	Promega	P1041/2/3
Polyurethane catheter	Intramedic	427401
Povidone Iodine	Betadine	AUST R 29562
Propofol Lipuro, 2%	Braun	3521490
Sevoflurane	Baxter	ANZ2L9117
Sevoflurane vaporiser	Vetquip	VQ1334
Sterile gauze	Multigate Medical Products	11-600A
Surgical scissors	Proscitech	TS1044
Sutures, 5-0 nylon	Dynek	V504
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Syringes (1 mL)	Terumo	SS+01T