تحسين الإعداد والظروف لمخطط كهربية الشبكية خارج الجسم الحي لدراسة وظيفة شبكية العين في العيون الصغيرة والكبيرة

Summary

إن تعديل مجموعة الأقطاب المتعددة أو معدات مشبك التصحيح الحالية يجعل مخطط كهربية الشبكية خارج الجسم الحي متاحا على نطاق أوسع. تسهل الطرق المحسنة لتسجيل استجابات الضوء خارج الجسم الحي والحفاظ عليها دراسة وظيفة مستقبلات الضوء والخلايا ثنائية القطب في شبكية العين السليمة ، والنماذج الحيوانية لأمراض العيون ، وشبكية العين من متبرع بشري.

Abstract

تعد قياسات استجابات الضوء العصبي في شبكية العين أمرا بالغ الأهمية للتحقيق في فسيولوجيا شبكية العين السليمة ، وتحديد التغيرات المرضية في أمراض الشبكية ، واختبار التدخلات العلاجية. يسمح مخطط كهربية الشبكية خارج الجسم الحي (ERG) بتحديد المساهمات من أنواع الخلايا الفردية في شبكية العين المعزولة عن طريق إضافة عوامل دوائية محددة وتقييم التغيرات الجوهرية للأنسجة بشكل مستقل عن التأثيرات الجهازية. يمكن قياس استجابات ضوء الشبكية باستخدام حامل عينة ERG متخصص خارج الجسم الحي وإعداد التسجيل ، ويتم تعديله من مشبك التصحيح الحالي أو معدات صفيف الأقطاب الكهربائية الدقيقة. على وجه الخصوص ، تم إعاقة دراسة الخلايا ثنائية القطب ON ، ولكن أيضا المستقبلات الضوئية ، بسبب الانخفاض البطيء ولكن التدريجي لاستجابات الضوء في ERG خارج الجسم الحي بمرور الوقت. تعمل زيادة سرعة التروية وتعديل درجة حرارة النفاذية على تحسين وظيفة الشبكية خارج الجسم الحي وزيادة سعة الاستجابة والاستقرار. يسمح ERG خارج الجسم الحي بشكل فريد بدراسة أنواع الخلايا العصبية الشبكية الفردية. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح التحسينات لزيادة سعة الاستجابة والاستقرار إلى أقصى حد بالتحقيق في استجابات الضوء في عينات شبكية العين من الحيوانات الكبيرة ، وكذلك عيون المتبرعين من البشر ، مما يجعل ERG خارج الجسم الحي إضافة قيمة إلى ذخيرة التقنيات المستخدمة للتحقيق في وظيفة الشبكية.

Introduction

يقيس تخطيط كهربية الشبكية وظيفة الشبكية استجابة للضوء¹. إنه جزء لا يتجزأ من دراسة فسيولوجيا الشبكية والفيزيولوجيا المرضية ، وقياس نجاح علاجات أمراض الشبكية. يستخدم ERG في الجسم الحي على نطاق واسع لتقييم وظيفة الشبكية في الكائنات الحية السليمة ، ولكن له قيود كبيرة ^2,3. من بين هذه ، يتم إعاقة التحليل الكمي لأنواع خلايا الشبكية الفردية في الجسم الحي ERG ، لأنه يسجل مجموع التغييرات المحتملة ، وبالتالي تراكب الاستجابات ، من جميع خلايا الشبكية إلى المنبهات الضوئية⁴. علاوة على ذلك ، فإنه لا يسمح بسهولة بإضافة الأدوية إلى شبكية العين ، وهو عرضة للتأثيرات الجهازية ، ولديه نسبة إشارة إلى ضوضاء منخفضة نسبيا. يتم التخلص من هذه العيوب في خارج الجسم الحي ERG الذي يبحث في وظيفة شبكية العين^{المعزولة 2}،³،^5،6. يسمح ERG خارج الجسم الحي بتسجيل استجابات كبيرة ومستقرة من أنواع معينة من خلايا الشبكية عن طريق إضافة مثبطات دوائية وتقييم سهل للعوامل العلاجية ، والتي يمكن إضافتها إلى superfusate. في الوقت نفسه ، يزيل تأثيرات التأثيرات الجهازية ويزيل الضوضاء الفسيولوجية (مثل ضربات القلب أو التنفس).

في خارج الجسم الحي ERG ، يتم عزل شبكية العين أو عينات الشبكية وتثبيتها على جانب المستقبلات الضوئية لأعلى على قبة حامل العينة ^3,5. يتم تجميع حامل العينة ، وتوصيله بنظام التروية الذي يزود شبكية العين بوسائط ساخنة ومؤكسجة ، ويوضع على مرحلة المجهر ، والذي تم تعديله لتقديم محفزات ضوئية يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر. لتسجيل الاستجابات المستنبطة بالضوء ، يتم توصيل حامل العينة بمكبر للصوت ومحول رقمي ونظام تسجيل (الشكل 1). تسمح هذه التقنية بعزل الاستجابات عن المستقبلات الضوئية للقضيب والمخروط ، والخلايا ثنائية القطب ON-القطب، و Müller glia عن طريق تغيير معلمات المحفزات الضوئية وإضافة عوامل دوائية.

يمكن تحويل مشبك التصحيح الحالي أو إعداد الصفيف متعدد الأقطاب الكهربائية (MEA) لتسجيل ERG خارج الجسم الحي ، إما بالاقتران مع محول ERG خارج الجسم الحي المتاح تجاريا أو حامل عينة مخصص للتحكم العددي بالكمبيوتر من البولي كربونات (CNC) ، لقياس استجابات الضوء في شبكية العين من نماذج الحيوانات الصغيرة ، مثل الفئران. يزيد هذا التعديل من إمكانية الوصول إلى ERG خارج الجسم الحي مع تقليل الحاجة إلى المعدات المتخصصة. يبسط تصميم حامل العينة تقنية التركيب ويدمج الأقطاب الكهربائية ، مما يلغي الحاجة إلى معالجة الأقطاب الكهربائية الدقيقة مقارنة بطرق ERG عبر الشبكية خارج الجسم الحي المبلغ عنها سابقا⁷. يعد معدل التروية ودرجة الحرارة داخل حامل العينة من العوامل المهمة التي تؤثر على خصائص الاستجابة من المستقبلات الضوئية والخلايا ثنائية القطب ON. من خلال ضبط هذه الظروف ، يمكن تسجيل ERG خارج الجسم الحي بشكل موثوق من شبكية الفأر المعزولة على مدى فترات طويلة من الزمن. تسمح الظروف التجريبية المحسنة بتسجيلات ERG خارج الجسم الحي في لكمات شبكية العين من شبكية أكبر ، بما في ذلك عيون الحيوانات الكبيرة وعيون المتبرع البشري⁸.

Protocol

أجريت جميع التجارب باستخدام الفئران وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الدراسات الحيوانية المؤسسية في جامعة يوتا. تم الحصول على عيون الخنازير لعرض هذا الفيديو بعد الوفاة من المسلخ (موارد الخنازير المستدامة ، جونسونفيل). تم الحصول على العيون من متبرعين بشريين بعد الموت الدماغي أو القلبي بموافقة للاستخدام البحثي من خلال بنك يوتا ليونز للعيون أو بنك سان دييغو للعيون أو Lifesharing ، وهي معتمدة بالكامل من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية ورابطة منظمات شراء الأعضاء (AOPO) وجمعية بنوك العيون الأمريكية. كان لاستخدام عيون المتبرعين البشريين حالة إعفاء في جامعة يوتا (IRB رقم 00106658) و ScrippsHealth IRB (IRB رقم 16-6781).

1. إعداد ERG خارج الجسم الحي

1. لتحويل إعداد صفيف متعدد الأقطاب ، قم بتوصيل حامل عينة ERG خارج الجسم الحي عبر مرحلة الرأس بمكبر صوت تفاضلي ، يتم توصيله بالإدخال التناظري للوحة الواجهة لنظام الصفيف متعدد الأقطاب الكهربائية. استخدم برنامج التسجيل للصفيف متعدد الأقطاب لتسجيل وتخزين بيانات الإدخال من ERG خارج الجسم الحي . اضبط كسب مكبر الصوت التفاضلي على 100 وأضف تضخيم جهد إضافي 10x اعتمادا على مواصفات جهاز التحويل الرقمي. اضبط مرشح الترددات المنخفضة على 100 هرتز.
2. لتحويل إعداد مشبك التصحيح ، قم بتوصيل حامل عينة ERG خارج الجسم الحي عبر مرحلة الرأس بمكبر صوت تفاضلي ، متصل بمرحلة الرأس لمضخم مشبك التصحيح. استخدم برنامج نظام مشبك التصحيح والتحويل الرقمي لتسجيل وتخزين بيانات الإدخال من ex vivo ERG. اضبط كسب مكبر الصوت التفاضلي على 100 وقم بتطبيق تضخيم جهد إضافي 10x عبر مرحلة رأس مشبك التصحيح. اضبط مرشح الترددات المنخفضة على 100 هرتز.
3. قم بتوصيل مصابيح LED بأطوال موجية مناسبة (على سبيل المثال ، حوالي 530 نانومتر لاستنباط مستقبلات ضوئية للقضيب واستجابات الخلايا ثنائية القطب ON) بالمجهر. تحكم في مصابيح LED باستخدام برنامج التسجيل الذي يتيح تشغيل محفزات الضوء. للتحكم في محفزات الضوء ، استخدم برنامج تشغيل LED يتم التحكم فيه بواسطة مخرجات تناظرية من محول رقمي.
4. قم بمعايرة ناتج الضوء لمصابيح LED في موضع شبكية العين في حامل العينة باستخدام الصمام الثنائي الضوئي. إذا لزم الأمر ، أدخل مرشحات الكثافة المحايدة في مسار الضوء لتعتيم شدة الضوء.
5. استخدم حامل عينة ERG متاح تجاريا أو مصمم خصيصا خارج الجسم الحي .
   ملاحظة: يمكن الحصول على رسومات التصنيع باستخدام الحاسب الآلي من البولي كربونات من المؤلفين عند الطلب.
6. لتحضير القطب ، أدخل قطب حبيبات Ag / AgCl في موصل luer ملولب. املأ الجزء الداخلي من موصل luer بالغراء الساخن وأدخل مقبس 2 مم في الغراء الساخن من الجانب غير الملولب. لحام سلك فضي من القطب EP1 إلى مقبس 2 مم. قم بربط القطب النهائي ، بحلقة o على الخيط ، في منافذ القطب لحامل عينة ERG خارج الجسم الحي .
   ملاحظة: يمكن استخدام الأقطاب الكهربائية لفترة طويلة. إذا تراكم سطح الحبيبات الأوساخ و / أو أصبح مظلما (يمكن أن يتسبب ذلك في ارتفاع جهد الإزاحة و / أو الانجراف الكهربائي) ، فيمكن "صقله" باستخدام ورق صنفرة ناعم.
7. قبل يوم واحد على الأقل من التجريب ، قم بتصفية أوراق الغراء على قباب حامل عينة ERG خارج الجسم الحي باستخدام غراء الإيبوكسي ، مما يضمن أن الغراء لا يعيق قناة القطب (انظر ³ للفيديو).

2. إعداد الحيوانات

1. الظلام التكيف مع الحيوانات لمدة 6 ساعات على الأقل أو بين عشية وضحاها.

3. إعداد المعدات

1. املأ خط التروية في ex vivo ERG بوسط Ames المليء ب 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ أكسجين. قم بتوصيل خط التروية بعنصر تسخين بمصدر تيار مستمر أو وحدة تحكم في الحرارة بالقرب من حامل العينة لتدفئة وسط أميس ، بحيث يتم الاحتفاظ بشبكية العين عند حوالي 35-38 درجة مئوية.
2. املأ نصفي حامل عينة ERG خارج الجسم الحي بمحلول قطب كهربائي ، وأغلق خط التروية بسدادات luer ، وقم بتوصيل الأقطاب الكهربائية ، وقم بتجميع حامل العينة بأربعة براغي (انظر ³ للحصول على فيديو).
3. تحقق من المقاومة وإزاحة الجهد بين الأقطاب الكهربائية في حامل العينة المجمعة عن طريق إدخال مجسات المتر المتعدد في الأقطاب الكهربائية.
   ملاحظة: إذا لم يكن هناك انسداد ، وكانت الأقطاب الكهربائية في حالة جيدة ، فيجب أن تكون المقاومة أقل من 100 كيلو أوم وتعويض الجهد أقل من 5 مللي فولت.
4. قم بتوصيل حامل العينة المجمع بخط التروية وضعه على مرحلة المجهر الذي تم إعداده لتوصيل ومضات ضوئية. تأكد من أن حامل العينة وخط التروية لا يحتويان على أي فقاعات هواء.

4. إعداد الأنسجة

1. التضحية بالحيوان مع CO₂ واستئصال العينين على الفور ، أو الحصول على عيون كبيرة من الحيوانات أو المتبرعين بالبشر.
2. تنظيف الكرة الأرضية من النسيج الضام المتبقية والعضلات خارج العين. تقليم العصب البصري.
3. على ورق الترشيح ، ضع شقا صغيرا بعناية بشفرة حلاقة على طول ora serrata ، على بعد حوالي 1 مم من الحافة في عين الفأر. أدخل مقص الفانا الناعم في الشق واقطعه على طول الحافة لإزالة الجزء الأمامي من العين بالعدسة.
4. انقل كوب العين إلى طبق يحتوي على وسط أميس. أمسك الصلبة بالملقط الناعم ، مع الحرص على عدم لمس شبكية العين. أدخل مقص الفانا بين الشبكية والصلبة وقطع الصلبة من الطرف المحيطي نحو الجزء المركزي. احرص على عدم لمس أو إتلاف الشبكية.
5. شل حركة الصلبة عن طريق الإمساك بجانب واحد من الشق بمقص الفانا مقابل الجزء السفلي من طبق التشريح. أمسك الصلبة بالملقط على الجانب الآخر من الشق. قم بإزالة الصلبة دون لمس أو إتلاف الشبكية عن طريق فصل الصلبة على جانبي الشق للسماح بعزل الشبكية بأقل قدر من الضرر للأنسجة.
6. قم بإزالة الجزء الأمامي بالعدسة من العين الزميلة وقم بتخزين كوب العين في درجة حرارة الغرفة في محلول أميس المليء ب 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ أكسجين.
   ملاحظة: يمكن الحصول على استجابات الضوء الوظيفية من العيون المخزنة بهذه الطريقة لعدة ساعات.
7. في العيون الكبيرة ، بما في ذلك عيون المتبرع البشري ، قم بتنظيف الكرة الأرضية من النسيج الضام المتبقي وإزالة الجزء الأمامي والعدسة ، على غرار الإجراء الموصوف لعين الفأر. استخدم مشرطا لعمل قطع حوالي 3 مم من الليمبوس. أدخل مقص تشريح منحني في الشق واقطعه على طول الحافة لإزالة الجزء الأمامي من العين بالعدسة. الحصول على عينات شبكية العين لتخطيط كهربية الشبكية خارج الجسم الحي مع لكمة خزعة يمكن التخلص منها 3-6 مم.

5. تركيب الأنسجة على حامل العينة

1. ضع النصف السفلي من حامل العينة في طبق بتري كبير واملأه بوسط أميس المؤكسج بحيث يتم غمر قبة حامل العينة.
2. أمسك بعناية حافة الشبكية بالملقط الدقيق وانقل الشبكية إلى قبة حامل العينة خارج الجسم الحي ، وجانب المستقبلات الضوئية متجها لأعلى.
3. ارفع حامل العينة من محلول أميس ، مع الحرص على بقاء شبكية العين في مكانها.
4. جفف لوحة حامل العينة تماما لتقليل الضوضاء والحديث الكهربائي وتحويل الإشارة.
5. قم بتجميع نصفي حامل العينة بأربعة براغي وقم بتوصيل خط التروية. قم بتجفيف القطب في النصف السفلي من حامل العينة وقم بتوصيل كابل الأنود بجانب الشبكية الداخلي وكابل الكاثود بجانب المستقبلات الضوئية.
6. قم بتزويد حامل العينة بما لا يقل عن 1 مل / دقيقة من وسط أميس المؤكسج لمدة 10-20 دقيقة لإتاحة الوقت لاستقرار استجابات الضوء.

6. تسجيل وظيفة الخلايا العصبية في شبكية العين

1. سجل عائلات الاستجابة عن طريق تعريض شبكية العين لومضات ضوئية ذات كثافة متزايدة. على سبيل المثال ، سجل عائلات استجابة المستقبلات الضوئية لقضيب الماوس مع شدة الضوء التي تتراوح من حوالي 10 إلى 1000 فوتون / ميكرومتر 2 وتلك الموجودة في خلايا الفأر ON-bipolar مع شدة الضوء التي تتراوح من 0.6 إلى 20 فوتونا / ميكرومتر² تقريبا.
2. قياس استجابات ضوء المستقبلات الضوئية (a-wave) في وجود كلوريد الباريوم 100 ميكرومتر ، الذي يمنع قنوات البوتاسيوم في خلايا مولر الدبقية ، و 40 ميكرومتر DL-AP4 ، الذي يمنع نقل إشارة الجلوتاماترجيك إلى الخلايا ثنائية القطب (الشكل 2 ب).
3. لعزل الموجة b ، التي تنشأ من وظيفة الخلايا ثنائية القطب ON ، قم أولا بتسجيل استجابات الضوء المجمعة من كل من الخلايا المستقبلة للضوء والخلايا ثنائية القطب ON في وجود كلوريد الباريوم وحده (الشكل 2 أ). بعد ذلك ، استخدم لمدة 5-10 دقائق مع وسط أميس الذي يحتوي على كلوريد الباريوم ، وكذلك DL-AP4 ، وسجل استجابات المستقبلات الضوئية لنفس محفزات الضوء كما كان من قبل (الشكل 2 ب). اطرح استجابات المستقبلات الضوئية من استجابات الخلايا المستقبلة للضوء والخلايا ثنائية القطب ON-bipolar ، وبالتالي حساب استجابات ضوء الخلية ON-bipolar وحدها (الشكل 2C).

7. تحسين وظيفة الخلية ثنائية القطب ON-القطب

ملاحظة: الموجة b ، التي تنشأ من الخلايا ثنائية القطب ON ، حساسة للغاية لدرجة الحرارة في حامل العينة ومعدل التروية.

1. حافظ على معدل تروية لا يقل عن 0.5 مل / دقيقة للحصول على الموجة b.
   ملاحظة: يفضل معدل تروية أعلى من 1-2 مل / دقيقة للحفاظ على استجابة كبيرة ومستقرة من الخلايا ثنائية القطب.
2. تأكد من أنه بالنسبة لمعدل تروية معين ، تكون درجة الحرارة في حامل العينة بالقرب من الشبكية قريبة من درجة حرارة الجسم (أي حوالي 35-38 درجة مئوية).
   ملاحظة: من المهم ضبط درجة حرارة perfusate ، والتي يتم تسخينها قبل أن تصل إلى حامل عينة ERG خارج الجسم الحي ، بحيث تكون ضمن نطاق درجة الحرارة المثلى في شبكية العين.
3. قم بتخزين أكواب العين للتجربة اللاحقة محمية من الضوء وفي وسط أميس المؤكسج في درجة حرارة الغرفة للحفاظ على موجات A و B الطبيعية لعدة ساعات.

النتائج

خارج الجسم الحي يتيح ERG تسجيل مستقبلات ضوئية قابلة للتكرار ومستقرة واستجابات ضوء الخلية ثنائية القطب ON-القطب ، على سبيل المثال ، من شبكية العين (الشكل 2A-C). يمكن تسجيل استجابات المستقبلات الضوئية من شبكية العين من متبرع بشري مع تأخير يصل إلى 5 ساعات بع?...

Discussion

تم تطويره في الأصل في عام 1865 بواسطة Holmgren لقياس استجابات ضوء الشبكية من شبكية العين^{البرمائية 10} ، وقد حالت القيود التقنية في البداية دون استخدام ERG على نطاق واسع. ومع ذلك ، حددت الدراسات الأساسية التي أجراها راجنار جرانيت وآخرون الأصول الخلوية ل ERG وقياس المستقبلات الضوئية واست?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mm socket	WPI	2026-10	materials to prepare electrode
Ag/AgCl Electrode	World Precision Instruments	EP1	materials to prepare electrode
Ames' medium	Sigma Aldrich	A1420	perfusion media
barium chloride	Sigma Aldrich	B0750	potassium channel blocker
DL-AP4	Tocris	0101	broad spectrum glutamatergic antagonist
OcuScience Ex Vivo ERG Adapter	OcuScience	n/a	ex vivo ERG specimen holder
Threaded luer connector	McMaster-Carr	51525K222 or 51525K223	materials to prepare electrode