Optimisation de la configuration et des conditions de l’électrorétinogramme ex vivo pour étudier la fonction de la rétine dans les petits et grands yeux

Résumé

La modification de l’équipement existant de réseau multiélectrodes ou de pince patch rend l’électrorétinogramme ex vivo plus largement accessible. Des méthodes améliorées pour enregistrer et maintenir les réponses lumineuses ex vivo facilitent l’étude du photorécepteur et de la fonction des cellules ON-bipolaires dans la rétine saine, des modèles animaux de maladies oculaires et des rétines de donneurs humains.

Résumé

Les mesures des réponses lumineuses neuronales rétiniennes sont essentielles pour étudier la physiologie de la rétine saine, déterminer les changements pathologiques dans les maladies de la rétine et tester les interventions thérapeutiques. L’électrorétinogramme ex vivo (ERG) permet de quantifier les contributions de types cellulaires individuels dans la rétine isolée par l’ajout d’agents pharmacologiques spécifiques et l’évaluation des changements tissulaires intrinsèques indépendamment des influences systémiques. Les réponses lumineuses rétiniennes peuvent être mesurées à l’aide d’un porte-échantillon ERG ex vivo spécialisé et d’une installation d’enregistrement, modifiés à partir d’un équipement de pince patch ou de réseau de microélectrodes existant. En particulier, l’étude des cellules ON-bipolaires, mais aussi des photorécepteurs, a été entravée par le déclin lent mais progressif des réponses lumineuses dans l’ERG ex vivo au fil du temps. L’augmentation de la vitesse de perfusion et l’ajustement de la température du perfusat améliorent la fonction rétinienne ex vivo et maximisent l’amplitude et la stabilité de la réponse. L’ERG ex vivo permet uniquement l’étude de types individuels de cellules neuronales rétiniennes. En outre, les améliorations visant à maximiser les amplitudes de réponse et la stabilité permettent d’étudier les réponses lumineuses dans des échantillons de rétine de grands animaux, ainsi que dans des yeux de donneurs humains, faisant de l’ERG ex vivo un ajout précieux au répertoire des techniques utilisées pour étudier la fonction rétinienne.

Introduction

L’électrorétinographie mesure la fonction rétinienne en réponse à la lumière¹. Il fait partie intégrante de l’étude de la physiologie et de la physiopathologie rétiniennes et de la mesure du succès des thérapies pour les maladies de la rétine. L’ERG in vivo est largement utilisé pour évaluer la fonction rétinienne dans les organismes intacts, mais il présente des limites importantes ^2,3. Parmi ceux-ci, l’analyse quantitative des différents types de cellules rétiniennes dans l’ERG in vivo est entravée, car elle enregistre la somme des changements potentiels, et donc des réponses superposées, de toutes les cellules rétiniennes aux stimuli lumineux⁴. En outre, il ne permet pas facilement l’ajout de médicaments à la rétine, est vulnérable aux influences systémiques et a un rapport signal sur bruit relativement faible. Ces inconvénients sont éliminés dans l’ERG ex vivo qui étudie la fonction de la rétine isolée 2,3,5,6. L’ERG ex vivo permet l’enregistrement de réponses importantes et stables de types de cellules rétiniennes spécifiques par l’ajout d’inhibiteurs pharmacologiques et l’évaluation facile des agents thérapeutiques, qui peuvent être ajoutés au superfusat. En même temps, il élimine les influences des effets systémiques et élimine les bruits physiologiques (par exemple, le rythme cardiaque ou la respiration).

Dans l’ERG ex vivo, les rétines ou les échantillons rétiniens sont isolés et montés côté photorécepteur vers le haut sur le dôme du porte-échantillon ^3,5. Le porte-échantillon est assemblé, connecté à un système de perfusion qui alimente la rétine en milieux oxygénés chauffés, et placé sur la scène d’un microscope, qui a été modifié pour délivrer des stimuli lumineux contrôlés par ordinateur. Pour enregistrer les réponses suscitées par la lumière, le porte-échantillon est connecté à un amplificateur, un numériseur et un système d’enregistrement (Figure 1). Cette technique permet d’isoler les réponses des photorécepteurs des bâtonnets et des cônes, des cellules ON-bipolaires et de la glie de Müller en modifiant les paramètres des stimuli lumineux et en ajoutant des agents pharmacologiques.

Une pince patch existante ou une configuration MEA (multi-électrodes array) peut être convertie pour enregistrer l’ERG ex vivo, soit en conjonction avec un adaptateur ERG ex vivo disponible dans le commerce, soit avec un porte-échantillon personnalisé usiné par commande numérique par ordinateur (CNC) en polycarbonate, pour mesurer les réponses lumineuses dans les rétines à partir de petits modèles animaux, tels que des souris. Cette modification augmente l’accessibilité des GRE ex vivo tout en minimisant le besoin d’équipement spécialisé. La conception du porte-échantillon simplifie la technique de montage et intègre des électrodes, éliminant ainsi le besoin de manipuler des microélectrodes par rapport aux méthodes ERG ex vivo transrétiniennes précédemment signalées⁷. Le taux de perfusion et la température à l’intérieur du porte-échantillon sont des facteurs importants qui affectent les propriétés de réponse des photorécepteurs et des cellules ON-bipolaires. En ajustant ces conditions, l’ERG ex vivo peut être enregistré de manière fiable à partir de la rétine isolée de la souris sur des périodes prolongées. Des conditions expérimentales optimisées permettent des enregistrements ERG ex vivo dans des poinçons rétiniens provenant de rétines plus grandes, y compris de grands yeux d’animaux et des yeux de donneurs humains⁸.

Protocole

Toutes les expériences utilisant des souris ont été menées conformément au Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité institutionnel d’études animales de l’Université de l’Utah. Des yeux de porc pour la démonstration de cette vidéo ont été obtenus post-mortem de l’abattoir (Sustainable Swine Resources, Johnsonville). Les yeux ont été obtenus de donneurs humains après une mort cérébrale ou cardiaque avec le consentement à des fins de recherche par l’intermédiaire de l’Utah Lions Eye Bank, de la San Diego Eye Bank ou de Lifesharing, qui sont entièrement accrédités par la FDA, l’Association of Organ Procurement Organizations (AOPO) et l’Eye Banks of America Association. L’utilisation d’yeux de donneurs humains avait le statut d’exemption à l’Université de l’Utah (IRB no. 00106658) et ScrippsHealth IRB (IRB no. 16-6781).

1. Mise en place du GRE ex vivo

1. Pour convertir une configuration de réseau multiélectrode, connectez le porte-échantillon ERG ex vivo via un étage de tête à un amplificateur différentiel, qui est branché sur l’entrée analogique de la carte d’interface du système multiélectrode. Utilisez le logiciel d’enregistrement du réseau multiélectrodes pour enregistrer et stocker les données d’entrée de l’ERG ex vivo . Réglez le gain de l’amplificateur différentiel sur 100 et ajoutez une amplification de tension supplémentaire de 10x en fonction des spécifications du numériseur. Réglez le filtre passe-bas sur 100 Hz.
2. Pour convertir une configuration de pince patch, connectez le porte-échantillon ERG ex vivo via un étage de tête à un amplificateur différentiel, qui est connecté à l’étage de tête de l’amplificateur de pince patch. Utilisez le logiciel de système de pince patch et le numériseur pour enregistrer et stocker les données d’entrée de l’ERG ex vivo . Réglez le gain de l’amplificateur différentiel sur 100 et appliquez une amplification de tension 10x supplémentaire via la platine de la tête de pince. Réglez le filtre passe-bas sur 100 Hz.
3. Connectez des LED avec les longueurs d’onde appropriées (par exemple, environ 530 nm pour provoquer des réponses du photorécepteur des bâtonnets et des cellules ON-bipolaires) au microscope. Contrôlez les LED avec un logiciel d’enregistrement qui permet le déclenchement de stimuli lumineux. Pour contrôler les stimuli lumineux, utilisez un pilote LED contrôlé par des sorties analogiques d’un numériseur.
4. Calibrer le flux lumineux des LED à la position de la rétine dans le porte-échantillon à l’aide d’une photodiode. Si nécessaire, insérez des filtres de densité neutre dans le trajet lumineux pour atténuer l’intensité lumineuse.
5. Utilisez un porte-spécimen ERG ex vivo disponible dans le commerce ou fabriqué sur mesure.
   NOTE: Les dessins pour l’usinage CNC à partir de polycarbonate peuvent être obtenus auprès des auteurs sur demande.
6. Pour préparer l’électrode, insérez une électrode à granulés Ag/AgCl dans un connecteur luer fileté. Remplissez l’intérieur du connecteur luer avec de la colle chaude et insérez une douille de 2 mm dans la colle chaude du côté non fileté. Souder un fil argenté de l’électrode EP1 à la douille de 2 mm. Vissez l’électrode finie, avec un joint torique sur le filetage, dans les orifices d’électrode du porte-échantillon ERG ex vivo .
   REMARQUE: Les électrodes peuvent être utilisées pendant une longue période. Si la surface de la pastille accumule de la saleté et/ou devient sombre (cela peut provoquer une tension de décalage élevée et/ou une dérive électrique), elle peut être « polie » à l’aide de papier de verre fin.
7. Au moins 1 jour avant l’expérimentation, collez des papiers filtres sur les dômes du porte-échantillon ERG ex vivo à l’aide de colle époxy, en veillant à ce que la colle n’obstrue pas le canal d’électrode (voir ³ pour la vidéo).

2. Préparation des animaux

1. Animaux sombres adaptatifs pendant au moins 6 h ou toute la nuit.

3. Préparation de l’équipement

1. Remplissez la ligne de perfusion de l’ERG ex vivo avec le milieu d’Ames barboté avec 5% de dioxyde de carbone et 95% d’oxygène. Connectez la conduite de perfusion à un élément chauffant avec une source de courant continu ou un contrôleur de chaleur près du porte-échantillon pour réchauffer le milieu d’Ames, de sorte que la rétine soit maintenue à environ 35-38 ° C.
2. Remplissez les deux moitiés du porte-échantillon ERG ex vivo avec une solution d’électrode, scellez la ligne de perfusion avec des bouchons luer, connectez les électrodes et assemblez le porte-échantillon avec quatre vis (voir ³ pour la vidéo).
3. Vérifiez la résistance et la tension de décalage entre les électrodes dans le porte-échantillon assemblé en insérant les sondes du multimètre dans les électrodes.
   REMARQUE: S’il n’y a pas de blocages et que les électrodes sont en bon état, la résistance doit être inférieure à 100 kΩ et la tension de décalage inférieure à 5 mV.
4. Connectez le porte-échantillon assemblé à la ligne de perfusion et placez-le sur la scène d’un microscope configuré pour délivrer des éclairs lumineux. Assurez-vous que le porte-échantillon et la conduite de perfusion ne contiennent pas de bulles d’air.

4. Préparation des tissus

1. Sacrifiez l’animal avec du CO₂ et énucléez immédiatement les yeux, ou obtenez de grands yeux de donneurs animaux ou humains.
2. Nettoyez le globe du tissu conjonctif restant et des muscles extraoculaires. Coupez le nerf optique.
3. Sur du papier filtre, placez soigneusement une petite incision avec une lame de rasoir le long de l’ora serrata, à environ 1 mm du limbe dans l’œil de souris. Insérez de fins ciseaux vannas dans l’incision et coupez le long du limbe pour enlever la partie antérieure de l’œil avec le cristallin.
4. Déplacez la coupe pour les yeux dans un plat contenant le médium d’Ames. Saisissez la sclérotique avec une pince fine, en prenant soin de ne pas toucher la rétine. Insérez des ciseaux vannas entre la rétine et la sclérotique et coupez la sclérotique de la partie périphérique vers la partie centrale. Veillez à ne pas toucher ou endommager la rétine.
5. Immobiliser la sclérotique en tenant un côté de l’incision avec des ciseaux vannas contre le fond du plat de dissection. Saisissez la sclérotique avec une pince de l’autre côté de l’incision. Retirez la sclérotique sans toucher ou endommager la rétine en écartant la sclérotique de chaque côté de l’incision pour permettre l’isolement de la rétine avec un minimum de dommages au tissu.
6. Retirez le segment antérieur avec la lentille de l’œil et conservez l’œilleton à température ambiante dans la solution d’Ames contenant 5% de dioxyde de carbone et 95% d’oxygène.
   REMARQUE: Les réponses lumineuses fonctionnelles des yeux stockés de cette manière peuvent être obtenues pendant plusieurs heures.
7. Dans les grands yeux, y compris les yeux de donneurs humains, nettoyez le globe du tissu conjonctif restant et retirez le segment antérieur et le cristallin, de la même manière que la procédure décrite pour l’œil de souris. Utilisez un scalpel pour faire une coupe à environ 3 mm du limbe. Insérez des ciseaux de dissection incurvés dans l’incision et coupez le long du limbe pour enlever la partie antérieure de l’œil avec le cristallin. Obtenir des échantillons rétiniens pour l’électrorétinographie ex vivo avec un poinçon de biopsie jetable de 3 à 6 mm.

5. Montage du tissu sur le porte-échantillon

1. Placez la moitié inférieure du porte-échantillon dans une grande boîte de Petri et remplissez-la de milieu d’Ames oxygéné de sorte que le dôme du porte-spécimen soit simplement submergé.
2. Saisissez soigneusement le bord de la rétine avec une pince fine et transférez la rétine sur le dôme du porte-échantillon ex vivo , côté photorécepteur tourné vers le haut.
3. Soulevez le porte-échantillon de la solution d’Ames, en veillant à ce que la rétine reste en place.
4. Séchez complètement la plaque du porte-échantillon pour minimiser le bruit, la diaphonie électrique et le shunt de signal.
5. Assemblez les deux moitiés du porte-échantillon avec quatre vis et connectez la ligne de perfusion. Sécher l’électrode dans la moitié inférieure du porte-échantillon et connecter le câble anodique au côté interne de la rétine et le câble cathodique au côté photorécepteur.
6. Perfuser le porte-échantillon avec au moins 1 mL/min de milieu d’Ames oxygéné pendant 10 à 20 minutes pour laisser le temps aux réponses lumineuses de se stabiliser.

6. Enregistrement de la fonction des cellules neuronales rétiniennes

1. Enregistrez les familles de réponse en exposant la rétine à des éclairs lumineux d’intensité croissante. Par exemple, enregistrer les familles de photorécepteurs de bâtonnets de souris avec des intensités lumineuses allant d’environ 10 à 1 000 photons/μm 2 et celles de cellules ON-bipolaires de souris avec des intensités lumineuses allant d’environ 0,6 à 20 photons/μm².
2. Mesurer les réponses lumineuses des photorécepteurs (ondes a) en présence de chlorure de baryum de 100 μM, qui bloque les canaux potassiques dans les cellules gliales de Müller, et de DL-AP4 de 40 μM, qui bloque la transmission du signal glutamatergique aux cellules bipolaires ON (Figure 2B).
3. Pour isoler l’onde b, qui provient de la fonction des cellules ON-bipolaires, enregistrez d’abord les réponses lumineuses combinées des cellules photoréceptrices et ON-bipolaires en présence de chlorure de baryum seul (Figure 2A). Ensuite, perfuser pendant 5 à 10 minutes avec le milieu d’Ames contenant du chlorure de baryum, ainsi que DL-AP4, et enregistrer les réponses des photorécepteurs aux mêmes stimuli lumineux qu’auparavant (Figure 2B). Soustrayez les réponses des photorécepteurs des réponses combinées des cellules photoréceptrices et ON-bipolaires, calculant ainsi uniquement les réponses lumineuses des cellules ON-bipolaires (Figure 2C).

7. Optimisation de la fonction des cellules on-bipolaires

REMARQUE: L’onde b, qui provient des cellules bipolaires ON, est très sensible à la température dans le porte-échantillon et au taux de perfusion.

1. Maintenir un taux de perfusion d’au moins 0,5 mL/min pour obtenir l’onde B.
   REMARQUE: Un taux de perfusion plus élevé de 1-2 mL / min est préférable pour maintenir une réponse importante et stable des cellules ON-bipolaires.
2. S’assurer que, pour un taux de perfusion donné, la température dans le porte-échantillon près de la rétine est proche de la température corporelle (c.-à-d. environ 35 à 38 °C).
   REMARQUE: Il est important d’ajuster la température du perfusat, qui est chauffé avant qu’il n’atteigne le porte-échantillon ERG ex vivo , afin qu’il se situe dans la plage de température optimale au niveau de la rétine.
3. Conservez les œillets pour une expérimentation ultérieure à l’abri de la lumière et dans un milieu d’Ames oxygéné à température ambiante pour maintenir les ondes A et B normales pendant plusieurs heures.

Résultats

Ex vivo L’ERG permet d’enregistrer les réponses reproductibles et stables du photorécepteur et de la lumière des cellules ON-bipolaires, par exemple à partir de la rétine de la souris (Figure 2A-C). L’enregistrement des réponses des photorécepteurs des rétines des donneurs humains est possible avec un délai d’énucléation post-mortem allant jusqu’à 5 heures (Figure 2D) et des réponses des cellules ...

Discussion

Développé à l’origine en 1865 par Holmgren pour mesurer les réponses lumineuses rétiniennes de la rétine^{amphibienne 10}, des contraintes techniques ont initialement empêché l’ERG d’être largement utilisé. Néanmoins, des études fondamentales menées par Ragnar Granit et d’autres ont identifié les origines cellulaires de l’ERG et mesuré les réponses des photorécepteurs et des cellules ON-bipolaires ex vivo^11,12,13...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mm socket	WPI	2026-10	materials to prepare electrode
Ag/AgCl Electrode	World Precision Instruments	EP1	materials to prepare electrode
Ames' medium	Sigma Aldrich	A1420	perfusion media
barium chloride	Sigma Aldrich	B0750	potassium channel blocker
DL-AP4	Tocris	0101	broad spectrum glutamatergic antagonist
OcuScience Ex Vivo ERG Adapter	OcuScience	n/a	ex vivo ERG specimen holder
Threaded luer connector	McMaster-Carr	51525K222 or 51525K223	materials to prepare electrode