Optimierung des Aufbaus und der Bedingungen für das Ex-vivo-Elektroretinogramm zur Untersuchung der Netzhautfunktion bei kleinen und großen Augen

Zusammenfassung

Die Modifikation bestehender Multielektroden-Array- oder Patch-Clamp-Geräte macht das Ex-vivo-Elektroretinogramm breiter zugänglich. Verbesserte Methoden zur Aufzeichnung und Aufrechterhaltung von Ex-vivo-Lichtantworten erleichtern die Untersuchung der Photorezeptor- und ON-bipolaren Zellfunktion in der gesunden Netzhaut, Tiermodellen von Augenkrankheiten und menschlichen Spendernetzhaut.

Zusammenfassung

Messungen der retinalen neuronalen Lichtreaktionen sind entscheidend für die Untersuchung der Physiologie der gesunden Netzhaut, die Bestimmung pathologischer Veränderungen bei Netzhauterkrankungen und das Testen therapeutischer Interventionen. Das ex vivo Elektroretinogramm (ERG) ermöglicht die Quantifizierung von Beiträgen einzelner Zelltypen in der isolierten Netzhaut durch Zugabe spezifischer pharmakologischer Wirkstoffe und die Bewertung gewebeintrinsischer Veränderungen unabhängig von systemischen Einflüssen. Retinale Lichtantworten können mit einem speziellen Ex-vivo-ERG-Probenhalter und Aufnahmeaufbau gemessen werden, der von bestehenden Patchklemmen oder Mikroelektroden-Array-Geräten modifiziert wurde. Insbesondere die Untersuchung von ON-bipolaren Zellen, aber auch von Photorezeptoren, wurde durch den langsamen, aber fortschreitenden Rückgang der Lichtantworten im ex vivo ERG im Laufe der Zeit behindert. Die erhöhte Perfusionsgeschwindigkeit und die Einstellung der Perfusattemperatur verbessern die Ex-vivo-Netzhautfunktion und maximieren die Reaktionsamplitude und -stabilität. Das ex vivo ERG ermöglicht auf einzigartige Weise die Untersuchung einzelner retinaler neuronaler Zelltypen. Darüber hinaus ermöglichen Verbesserungen zur Maximierung der Reaktionsamplituden und -stabilität die Untersuchung von Lichtreaktionen in Netzhautproben von großen Tieren sowie menschlichen Spenderaugen, was das ex vivo ERG zu einer wertvollen Ergänzung des Repertoires an Techniken macht, die zur Untersuchung der Netzhautfunktion verwendet werden.

Einleitung

Die Elektroretinographie misst die Netzhautfunktion als Reaktion auf Licht¹. Es ist integraler Bestandteil des Studiums der Netzhautphysiologie und Pathophysiologie und der Messung des Erfolgs von Therapien für Netzhauterkrankungen. Das In-vivo-ERG wird häufig zur Beurteilung der Netzhautfunktion in intakten Organismen verwendet, weist jedoch signifikante Einschränkungen^{auf 2,3}. Unter diesen wird die quantitative Analyse einzelner retinaler Zelltypen im in vivo ERG erschwert, da es die Summe der möglichen Veränderungen und damit überlagerten Reaktionen von allen Netzhautzellen zu Lichtreizen aufzeichnet⁴. Darüber hinaus erlaubt es nicht ohne weiteres die Zugabe von Medikamenten zur Netzhaut, ist anfällig für systemische Einflüsse und hat ein relativ niedriges Signal-Rausch-Verhältnis. Diese Nachteile werden in der ex vivo ERG eliminiert, die die Funktion der isolierten Netzhaut 2,3,5,6 untersucht. Das ex vivo ERG ermöglicht die Aufzeichnung großer und stabiler Reaktionen von spezifischen retinalen Zelltypen durch Zugabe pharmakologischer Inhibitoren und einfache Bewertung von Therapeutika, die dem Superfusat zugesetzt werden können. Gleichzeitig beseitigt es Einflüsse systemischer Effekte und eliminiert physiologische Geräusche (z.B. Herzschlag oder Atmung).

Bei der ex vivo ERG werden Netzhäute oder Netzhautproben isoliert und photorezeptorseitig nach oben auf der Kuppel des Probenhalters ^3,5 montiert. Der Probenhalter wird zusammengebaut, mit einem Perfusionssystem verbunden, das die Netzhaut mit erhitzten, sauerstoffhaltigen Medien versorgt, und auf den Tisch eines Mikroskops gestellt, das modifiziert wurde, um computergesteuerte Lichtreize zu liefern. Um die durch Licht hervorgerufenen Reaktionen aufzuzeichnen, wird der Probenhalter an einen Verstärker, einen Digitizer und ein Aufzeichnungssystem angeschlossen (Abbildung 1). Diese Technik ermöglicht die Isolierung von Reaktionen von Stäbchen- und Zapfen-Photorezeptoren, ON-Bipolarzellen und Müller-Glia, indem die Parameter der Lichtstimuli verändert und pharmakologische Wirkstoffe hinzugefügt werden.

Eine vorhandene Patchklemme oder ein Multi-Elektroden-Array (MEA) kann in die Aufzeichnung von Ex-vivo-ERG umgewandelt werden, entweder in Verbindung mit einem handelsüblichen Ex-vivo-ERG-Adapter oder einem benutzerdefinierten CNC-bearbeiteten Probenhalter (Computer Numerical Control) aus Polycarbonat, um Lichtreaktionen in Netzhaut von Kleintiermodellen wie Mäusen zu messen. Diese Modifikation erhöht die Zugänglichkeit von ex vivo ERG und minimiert gleichzeitig den Bedarf an Spezialgeräten. Das Design des Probenhalters vereinfacht die Montagetechnik und integriert Elektroden, wodurch die Notwendigkeit einer Manipulation von Mikroelektroden im Vergleich zu zuvor berichteten transretinalen Ex-vivo-ERG-Methoden entfällt⁷. Die Perfusionsrate und die Temperatur im Probenhalter sind wichtige Faktoren, die die Reaktionseigenschaften von Photorezeptoren und ON-Bipolarzellen beeinflussen. Durch die Anpassung dieser Bedingungen kann das ex vivo ERG zuverlässig von der isolierten Netzhaut der Maus über längere Zeiträume aufgezeichnet werden. Optimierte experimentelle Bedingungen ermöglichen ex vivo ERG-Aufnahmen in Netzhautstempeln von größeren Netzhäuten, einschließlich großer Tieraugen und menschlicher Spenderaugen⁸.

Protokoll

Alle Experimente mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Institutional Animal Studies Committee der University of Utah genehmigt. Schweineaugen zur Demonstration dieses Videos wurden postmortal aus dem Schlachthof (Sustainable Swine Resources, Johnsonville) erhalten. Die Augen wurden von menschlichen Spendern nach Hirn- oder Herztod mit Zustimmung zur Forschungsnutzung durch die Utah Lions Eye Bank, die San Diego Eye Bank oder Lifesharing erhalten, die von der FDA, der Association of Organ Procurement Organizations (AOPO) und der Eye Banks of America Association vollständig akkreditiert sind. Die Verwendung menschlicher Spenderaugen hatte Ausnahmestatus an der University of Utah (IRB Nr. 00106658) und ScrippsHealth IRB (IRB Nr. 16-6781).

1. Einrichtung der ex vivo ERG

1. Um einen Multielektroden-Array-Aufbau umzuwandeln, verbinden Sie den ex vivo ERG-Probenhalter über eine Kopfstufe mit einem Differenzverstärker, der in den Analogeingang der Schnittstellenkarte des Multielektroden-Array-Systems gesteckt wird. Verwenden Sie die Aufzeichnungssoftware für das Multielektrodenarray, um die Eingangsdaten des ex vivo ERG aufzuzeichnen und zu speichern. Stellen Sie die Verstärkung des Differenzverstärkers auf 100 ein und fügen Sie je nach Spezifikation des Digitizers eine zusätzliche 10-fache Spannungsverstärkung hinzu. Stellen Sie den Tiefpassfilter auf 100 Hz ein.
2. Um einen Patch-Klemmaufbau umzurüsten, verbinden Sie den ex vivo ERG-Probenhalter über eine Kopfstufe mit einem Differenzverstärker, der mit der Kopfstufe des Patchklemmverstärkers verbunden ist. Verwenden Sie die Patchklemmsystemsoftware und den Digitizer, um die Eingangsdaten des ex vivo ERG aufzuzeichnen und zu speichern. Stellen Sie die Verstärkung des Differenzverstärkers auf 100 ein und legen Sie eine zusätzliche 10-fache Spannungsverstärkung über die Patch-Klemmkopfstufe an. Stellen Sie den Tiefpassfilter auf 100 Hz ein.
3. Verbinden Sie LEDs mit den entsprechenden Wellenlängen (z. B. ca. 530 nm, um Stäbchen-Photorezeptor- und ON-Bipolarzellantworten hervorzurufen) mit dem Mikroskop. Steuern Sie die LEDs mit einer Aufnahmesoftware, die das Auslösen von Lichtreizen ermöglicht. Um Lichtreize zu steuern, verwenden Sie einen LED-Treiber, der über analoge Ausgänge eines Digitizers gesteuert wird.
4. Kalibrieren Sie die Lichtleistung der LEDs an der Position der Netzhaut im Probenhalter mit einer Fotodiode. Falls erforderlich, setzen Sie Neutraldichtefilter in den Lichtpfad ein, um die Lichtintensität zu dimmen.
5. Verwenden Sie einen handelsüblichen oder speziell angefertigten Ex-vivo-ERG-Probenhalter.
   HINWEIS: Zeichnungen für die CNC-Bearbeitung aus Polycarbonat können auf Anfrage bei den Autoren angefordert werden.
6. Um die Elektrode vorzubereiten, führen Sie eine Ag/AgCl-Pelletelektrode in einen Luer-Anschluss mit Gewinde ein. Füllen Sie die Innenseite des Luer-Steckers mit Heißkleber und stecken Sie eine 2 mm Buchse von der Seite ohne Gewinde in den Heißkleber. Löten Sie einen Silberdraht der EP1-Elektrode an die 2 mm Buchse. Schrauben Sie die fertige Elektrode mit einem O-Ring am Gewinde in die Elektrodenanschlüsse des ex vivo ERG-Probenhalters.
   HINWEIS: Elektroden können für eine lange Zeit verwendet werden. Wenn sich die Pelletoberfläche ansammelt und/oder dunkel wird (dies kann zu einer hohen Offsetspannung und/oder elektrischen Drift führen), kann sie mit feinem Schleifpapier "poliert" werden.
7. Mindestens 1 Tag vor dem Versuch Filterpapiere mit Epoxidkleber auf die Kuppeln des ex vivo ERG-Probenhalters kleben, um sicherzustellen, dass der Klebstoff den Elektrodenkanal nicht blockiert (siehe ^Video 3).

2. Tierische Zubereitung

1. Dunkle angepasste Tiere für mindestens 6 Stunden oder über Nacht.

3. Vorbereitung der Ausrüstung

1. Füllen Sie die Perfusionsleitung des ex vivo ERG mit Ames' Medium, das mit 5% Kohlendioxid und 95% Sauerstoff besprüht ist. Verbinden Sie die Perfusionsleitung mit einem Heizelement mit einer Gleichstromquelle oder einem Wärmeregler in der Nähe des Probenhalters, um das Medium des Ames zu erwärmen, so dass die Netzhaut bei ca. 35-38 °C gehalten wird.
2. Füllen Sie beide Hälften des ex vivo ERG-Probenhalters mit Elektrodenlösung, verschließen Sie die Perfusionsleitung mit Luerstopfen, verbinden Sie die Elektroden und montieren Sie den Probenhalter mit vier Schrauben (siehe Video ³).
3. Überprüfen Sie den Widerstand und die Offset-Spannung zwischen den Elektroden im montierten Probenhalter, indem Sie die Sonden des Multimeters in die Elektroden einführen.
   HINWEIS: Wenn keine Verstopfungen vorhanden sind und die Elektroden in gutem Zustand sind, sollte der Widerstand unter 100 kΩ und die Offsetspannung unter 5 mV liegen.
4. Verbinden Sie den montierten Probenhalter mit der Perfusionslinie und legen Sie ihn auf den Tisch eines Mikroskops, das so eingerichtet ist, dass Lichtblitze abgegeben werden. Stellen Sie sicher, dass der Probenhalter und die Perfusionsleitung keine Luftblasen enthalten.

4. Gewebevorbereitung

1. Opfern Sie das Tier mit CO₂ und enukleieren Sie sofort die Augen oder erhalten Sie große Tier- oder menschliche Spenderaugen.
2. Reinigen Sie die Kugel von den verbleibenden Bindegeweben und extraokularen Muskeln. Schneiden Sie den Sehnerv ab.
3. Legen Sie auf Filterpapier vorsichtig einen kleinen Schnitt mit einer Rasierklinge entlang der Ora serrata, etwa 1 mm vom Limbus im Mausauge entfernt. Führen Sie eine feine Vannas-Schere in den Schnitt ein und schneiden Sie entlang des Limbus, um den vorderen Teil des Auges mit der Linse zu entfernen.
4. Stellen Sie die Augenmuschel in eine Schale, die Ames' Medium enthält. Fassen Sie die Sklera mit einer feinen Pinzette und achten Sie darauf, die Netzhaut nicht zu berühren. Führen Sie eine Vannas-Schere zwischen Netzhaut und Sklera ein und schneiden Sie die Sklera von der Peripherie in Richtung des zentralen Teils. Achten Sie darauf, die Netzhaut nicht zu berühren oder zu beschädigen.
5. Immobilisieren Sie die Sklera, indem Sie eine Seite des Einschnitts mit einer Vannas-Schere gegen den Boden der Präparierschale halten. Fassen Sie die Sklera mit einer Pinzette auf der anderen Seite des Einschnitts. Entfernen Sie die Sklera, ohne die Netzhaut zu berühren oder zu beschädigen, indem Sie die Sklera auf beiden Seiten des Einschnitts auseinanderziehen, um eine Isolierung der Netzhaut mit minimaler Schädigung des Gewebes zu ermöglichen.
6. Entfernen Sie das vordere Segment mit der Linse vom anderen Auge und lagern Sie die Augenmuschel bei Raumtemperatur in Ames' Lösung, die mit 5% Kohlendioxid und 95% Sauerstoff beblasen ist.
   HINWEIS: Funktionelle Lichtreaktionen von Augen, die auf diese Weise gespeichert werden, können für mehrere Stunden erhalten werden.
7. Bei großen Augen, einschließlich menschlicher Spenderaugen, reinigen Sie die Kugel des verbleibenden Bindegewebes und entfernen Sie das vordere Segment und die Linse, ähnlich wie bei dem für das Mausauge beschriebenen Verfahren. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Schnitt etwa 3 mm vom Limbus zu machen. Führen Sie eine gebogene Dissektionsschere in den Schnitt ein und schneiden Sie entlang des Limbus, um den vorderen Teil des Auges mit der Linse zu entfernen. Erhalten Sie Netzhautproben für die Ex-vivo-Elektroretinographie mit einem 3-6 mm Einweg-Biopsiestempel.

5. Anbringen des Gewebes am Probenhalter

1. Legen Sie die untere Hälfte des Probenhalters in eine große Petrischale und füllen Sie sie mit sauerstoffreichem Ames-Medium, so dass die Kuppel des Probenhalters einfach untergetaucht ist.
2. Fassen Sie den Rand der Netzhaut vorsichtig mit einer feinen Pinzette an und übertragen Sie die Netzhaut auf die Kuppel des ex vivo Probenhalters, Photorezeptorseite nach oben.
3. Heben Sie den Probenhalter aus der Ames-Lösung und achten Sie darauf, dass die Netzhaut an Ort und Stelle bleibt.
4. Trocknen Sie die Platte des Probenhalters vollständig ab, um Rauschen, elektrisches Übersprechen und Signalshunting zu minimieren.
5. Montieren Sie beide Hälften des Probenhalters mit vier Schrauben und verbinden Sie die Perfusionsleitung. Trocknen Sie die Elektrode in der unteren Hälfte des Probenhalters und verbinden Sie das Anodenkabel mit der inneren Netzhautseite und das Kathodenkabel mit der Photorezeptorseite.
6. Durchimpfen Sie den Probenhalter mit mindestens 1 ml/min sauerstoffreichem Ames-Medium für 10-20 Minuten, um Zeit für die Stabilisierung der Lichtreaktionen zu haben.

6. Erfassung der neuronalen Zellfunktion der Netzhaut

1. Zeichnen Sie Antwortfamilien auf, indem Sie die Netzhaut Lichtblitzen zunehmender Intensität aussetzen. Erfassen Sie beispielsweise Maus-Stäbchen-Photorezeptor-Antwortfamilien mit Lichtintensitäten im Bereich von etwa 10 bis 1.000 Photonen / μm 2 und solche von Maus-ON-Bipolarzellen mit Lichtintensitäten von etwa 0,6 bis 20 Photonen / μm².
2. Messung der Lichtreaktionen von Photorezeptoren (a-Welle) in Gegenwart von 100 μM Bariumchlorid, das Kaliumkanäle in Müller-Gliazellen blockiert, und 40 μM DL-AP4, das die glutamaterge Signalübertragung an ON-bipolare Zellen blockiert (Abbildung 2B).
3. Um die b-Welle zu isolieren, die aus der Funktion der ON-Bipolarzellen stammt, werden zunächst kombinierte Lichtreaktionen von Photorezeptor- und ON-Bipolarzellen in Gegenwart von Bariumchlorid allein aufgezeichnet (Abbildung 2A). Dann 5-10 min mit Ames' Medium, das Bariumchlorid sowie DL-AP4 enthält, durchbluten und die Photorezeptorreaktionen auf die gleichen Lichtreize wie zuvor aufzeichnen (Abbildung 2B). Subtrahieren Sie Photorezeptorantworten von kombinierten Photorezeptor- und ON-bipolaren Zellantworten und berechnen Sie so allein die ON-bipolaren Zelllichtantworten (Abbildung 2C).

7. Optimierung der ON-Bipolarzellfunktion

HINWEIS: Die b-Welle, die von den ON-Bipolarzellen ausgeht, reagiert sehr empfindlich auf die Temperatur im Probenhalter und die Perfusionsrate.

1. Halten Sie eine Perfusionsrate von mindestens 0,5 ml / min aufrecht, um die b-Welle zu erhalten.
   HINWEIS: Eine höhere Perfusionsrate von 1-2 ml / min ist vorzuziehen, um eine große und stabile Reaktion von ON-Bipolarzellen aufrechtzuerhalten.
2. Stellen Sie sicher, dass bei einer gegebenen Perfusionsrate die Temperatur im Probenhalter in der Nähe der Netzhaut nahe der Körpertemperatur liegt (d. h. ca. 35-38 °C).
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Temperatur des Perfusats einzustellen, das erhitzt wird, bevor es den ex vivo ERG-Probenhalter erreicht, so dass es sich im optimalen Temperaturbereich an der Netzhaut befindet.
3. Lagern Sie Augenmuscheln für spätere Experimente vor Licht geschützt und in sauerstoffreichem Ames-Medium bei Raumtemperatur, um normale A- und B-Wellen für mehrere Stunden aufrechtzuerhalten.

Ergebnisse

Ex vivo ERG ermöglicht die Aufzeichnung reproduzierbarer und stabiler Photorezeptor- und ON-bipolarer Zelllichtantworten, beispielsweise von der Netzhaut der Maus (Abbildung 2A-C). Die Aufzeichnung von Photorezeptorantworten menschlicher Spendernetzhaut ist mit bis zu 5 h postmortaler Verzögerung der Enukleation (Abbildung 2D) und von ON-bipolaren Zellantworten mit einer Enukleationsverzögerung von <20 min (

Diskussion

Ursprünglich 1865 von Holmgren entwickelt, um die retinalen Lichtantworten der Amphibiennetzhaut¹⁰ zu messen, verhinderten technische Einschränkungen zunächst eine breite Anwendung. Dennoch identifizierten wegweisende Studien von Ragnar Granit und anderen die zellulären Ursprünge des ERG und maßen Photorezeptor- und ON-bipolare Zellantworten ex vivo^11,12,13. Seitdem haben verfeinerte Method...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mm socket	WPI	2026-10	materials to prepare electrode
Ag/AgCl Electrode	World Precision Instruments	EP1	materials to prepare electrode
Ames' medium	Sigma Aldrich	A1420	perfusion media
barium chloride	Sigma Aldrich	B0750	potassium channel blocker
DL-AP4	Tocris	0101	broad spectrum glutamatergic antagonist
OcuScience Ex Vivo ERG Adapter	OcuScience	n/a	ex vivo ERG specimen holder
Threaded luer connector	McMaster-Carr	51525K222 or 51525K223	materials to prepare electrode