Optimización de la configuración y las condiciones del electrorretinograma ex vivo para estudiar la función de la retina en ojos pequeños y grandes

Resumen

La modificación de la matriz de electrodos múltiples existente o del equipo de abrazadera de parche hace que el electrorretinograma ex vivo sea más accesible. Los métodos mejorados para registrar y mantener las respuestas de luz ex vivo facilitan el estudio de la función de los fotorreceptores y las células bipolares ON en la retina sana, modelos animales de enfermedades oculares y retinas de donantes humanos.

Resumen

Las mediciones de las respuestas neuronales a la luz de la retina son fundamentales para investigar la fisiología de la retina sana, determinar los cambios patológicos en las enfermedades de la retina y probar intervenciones terapéuticas. El electrorretinograma ex vivo (ERG) permite la cuantificación de las contribuciones de tipos de células individuales en la retina aislada mediante la adición de agentes farmacológicos específicos y la evaluación de los cambios intrínsecos al tejido independientemente de las influencias sistémicas. Las respuestas a la luz retiniana se pueden medir utilizando un soporte de muestra ERG ex vivo especializado y una configuración de grabación, modificada a partir de la abrazadera de parche existente o el equipo de matriz de microelectrodos. En particular, el estudio de las células ON-bipolares, pero también de los fotorreceptores, se ha visto obstaculizado por la disminución lenta pero progresiva de las respuestas a la luz en el ERG ex vivo a lo largo del tiempo. El aumento de la velocidad de perfusión y el ajuste de la temperatura de perfusión mejoran la función retiniana ex vivo y maximizan la amplitud y estabilidad de la respuesta. El ERG ex vivo permite de manera única el estudio de tipos individuales de células neuronales de la retina. Además, las mejoras para maximizar las amplitudes de respuesta y la estabilidad permiten la investigación de respuestas de luz en muestras de retina de animales grandes, así como en ojos de donantes humanos, lo que hace que el ERG ex vivo sea una valiosa adición al repertorio de técnicas utilizadas para investigar la función de la retina.

Introducción

La electrorretinografía mide la función retiniana en respuesta a la luz¹. Es esencial para estudiar la fisiología y fisiopatología de la retina, y medir el éxito de las terapias para las enfermedades de la retina. El ERG in vivo es ampliamente utilizado para evaluar la función retiniana en organismos intactos, pero tiene limitaciones significativas ^2,3. Entre estos, el análisis cuantitativo de los tipos de células retinianas individuales en el ERG in vivo se ve obstaculizado, ya que registra la suma de los cambios potenciales y, por lo tanto, las respuestas superpuestas, de todas las células de la retina a los estímulos de luz⁴. Además, no permite fácilmente la adición de fármacos a la retina, es vulnerable a las influencias sistémicas y tiene una relación señal-ruido relativamente baja. Estas desventajas se eliminan en el ERG ex vivo que investiga la función de la retina aislada 2,3,5,6. El ERG ex vivo permite el registro de respuestas grandes y estables de tipos específicos de células retinianas mediante la adición de inhibidores farmacológicos y una fácil evaluación de los agentes terapéuticos, que se pueden agregar al superfusato. Al mismo tiempo, elimina las influencias de los efectos sistémicos y elimina el ruido fisiológico (por ejemplo, latidos del corazón o respiración).

En el ERG ex vivo, se aíslan retinas o muestras de retina y se montan el lado fotorreceptor hacia arriba en la cúpula del portamuestras ^3,5. El portamuestras se ensambla, se conecta a un sistema de perfusión que suministra a la retina medios calentados y oxigenados, y se coloca en el escenario de un microscopio, que se ha modificado para entregar estímulos de luz controlados por computadora. Para registrar las respuestas provocadas por la luz, el portamuestras está conectado a un amplificador, digitalizador y sistema de grabación (Figura 1). Esta técnica permite el aislamiento de las respuestas de los fotorreceptores de bastones y conos, las células bipolares ON y la glía de Müller cambiando los parámetros de los estímulos de luz y agregando agentes farmacológicos.

Una configuración existente de abrazadera de parche o matriz de electrodos múltiples (MEA) se puede convertir para grabar ERG ex vivo, ya sea junto con un adaptador ERG ex vivo disponible comercialmente o un portamuestras mecanizado con control numérico computarizado (CNC) de policarbonato personalizado, para medir las respuestas de luz en retinas de modelos de animales pequeños, como ratones. Esta modificación aumenta la accesibilidad del ERG ex vivo al tiempo que minimiza la necesidad de equipos especializados. El diseño del portamuestras simplifica la técnica de montaje e integra electrodos, eliminando la necesidad de manipulación de microelectrodos en comparación con los métodos ERG ex vivo transretinianos previamente informados⁷. La velocidad de perfusión y la temperatura dentro del portamuestras son factores importantes que afectan las propiedades de respuesta de los fotorreceptores y las células bipolares ON. Al ajustar estas condiciones, el ERG ex vivo se puede registrar de manera confiable desde la retina aislada del ratón durante períodos prolongados de tiempo. Las condiciones experimentales optimizadas permiten registros ERG ex vivo en punzones retinianos de retinas más grandes, incluidos ojos de animales grandes y ojos de donantes humanos⁸.

Protocolo

Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con la Guía de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Estudios Animales de la Universidad de Utah. Los ojos de cerdo para la demostración de este video se obtuvieron postmortem del matadero (Sustainable Swine Resources, Johnsonville). Los ojos se obtuvieron de donantes humanos después de la muerte cerebral o cardíaca con el consentimiento para uso en investigación a través del Utah Lions Eye Bank, el San Diego Eye Bank o Lifesharing, que están totalmente acreditados por la FDA, la Asociación de Organizaciones de Obtención de Órganos (AOPO) y la Asociación de Bancos de Ojos de América. El uso de ojos de donantes humanos tenía el estado exento en la Universidad de Utah (IRB no. 00106658) y ScrippsHealth IRB (IRB no. 16-6781).

1. Configuración del ERG ex vivo

1. Para convertir una configuración de matriz de electrodos múltiples, conecte el soporte de muestra ERG ex vivo a través de un escenario de cabeza a un amplificador diferencial, que se conecta a la entrada analógica de la placa de interfaz del sistema de matriz de electrodos múltiples. Utilice el software de grabación para la matriz de electrodos múltiples para registrar y almacenar los datos de entrada del ERG ex vivo . Ajuste la ganancia del amplificador diferencial a 100 y agregue una amplificación de voltaje adicional de 10x dependiendo de las especificaciones del digitalizador. Ajuste el filtro de paso bajo a 100 Hz.
2. Para convertir una configuración de abrazadera de parche, conecte el portamuestras ERG ex vivo a través de una etapa de cabeza a un amplificador diferencial, que está conectado a la etapa de cabeza del amplificador de abrazadera de parche. Utilice el software del sistema de abrazadera de conexión y el digitalizador para registrar y almacenar los datos de entrada del ERG ex vivo. Ajuste la ganancia del amplificador diferencial a 100 y aplique una amplificación de voltaje adicional de 10x a través de la etapa del cabezal de abrazadera de parche. Ajuste el filtro de paso bajo a 100 Hz.
3. Conecte los LED con las longitudes de onda apropiadas (por ejemplo, aproximadamente 530 nm para provocar respuestas fotorreceptoras de varillas y células bipolares ON) al microscopio. Controle los LED con un software de grabación que permite la activación de estímulos de luz. Para controlar los estímulos de luz, utilice un controlador LED controlado por salidas analógicas desde un digitalizador.
4. Calibre la salida de luz de los LED en la posición de la retina en el portamuestras utilizando un fotodiodo. Si es necesario, inserte filtros de densidad neutra en la trayectoria de la luz para atenuar la intensidad de la luz.
5. Utilice un portamuestras ERG ex vivo disponible comercialmente o construido a medida.
   NOTA: Los dibujos para el mecanizado CNC de policarbonato se pueden obtener de los autores a pedido.
6. Para preparar el electrodo, inserte un electrodo de pellets Ag/AgCl en un conector luer roscado. Llene el interior del conector luer con pegamento caliente e inserte un zócalo de 2 mm en el pegamento caliente desde el lado no roscado. Suelde un alambre plateado del electrodo EP1 al zócalo de 2 mm. Atornille el electrodo terminado, con una junta tórica en la rosca, en los puertos del electrodo del portamuestras ERG ex vivo .
   NOTA: Los electrodos se pueden usar durante mucho tiempo. Si la superficie del pellet acumula suciedad y/o se oscurece (esto puede causar un alto voltaje de compensación y/o deriva eléctrica), se puede "pulir" con papel de lija fino.
7. Al menos 1 día antes de la experimentación, pegue papeles de filtro en las cúpulas del portamuestras ERG ex vivo con pegamento epoxi, asegurándose de que el pegamento no obstruya el canal del electrodo (ver ³ para ver video).

2. Preparación animal

1. Animales oscuros adaptados durante al menos 6 h o durante la noche.

3. Preparación del equipo

1. Llenar la línea de perfusión del ERG ex vivo con el medio de Ames burbujeado con 5% de dióxido de carbono y 95% de oxígeno. Conecte la línea de perfusión a un elemento calefactor con una fuente de corriente continua o un controlador de calor cerca del portamuestras para calentar el medio de Ames, de modo que la retina se mantenga a aproximadamente 35-38 °C.
2. Llene ambas mitades del portamuestras ERG ex vivo con solución de electrodo, selle la línea de perfusión con tapones luer, conecte los electrodos y ensamble el portamuestras con cuatro tornillos ^{(consulte 3} para ver el video).
3. Compruebe la resistencia y el voltaje de compensación entre los electrodos en el soporte de la muestra ensamblado insertando las sondas del multímetro en los electrodos.
   NOTA: Si no hay obstrucciones y los electrodos están en buenas condiciones, la resistencia debe estar por debajo de 100 kΩ y el voltaje de compensación por debajo de 5 mV.
4. Conecte el portamuestras ensamblado a la línea de perfusión y colóquelo en el escenario de un microscopio configurado para administrar destellos de luz. Asegúrese de que el portamuestras y la línea de perfusión no contengan burbujas de aire.

4. Preparación del tejido

1. Sacrificar al animal con_CO2 e inmediatamente enuclear los ojos, u obtener grandes ojos de animales o donantes humanos.
2. Limpie el globo del tejido conectivo restante y los músculos extraoculares. Recorte el nervio óptico.
3. En papel de filtro, coloque cuidadosamente una pequeña incisión con una cuchilla de afeitar a lo largo de la ora serrata, aproximadamente a 1 mm del limbo en el ojo del ratón. Inserte unas tijeras finas de vannas en la incisión y corte a lo largo del limbo para extraer la porción anterior del ojo con la lente.
4. Mueva la copa ocular a un plato que contenga el medio de Ames. Agarre la esclerótica con fórceps finos, teniendo cuidado de no tocar la retina. Inserte unas tijeras de vannas entre la retina y la esclerótica y corte la esclerótica desde el periférico hacia la parte central. Tenga cuidado de no tocar ni dañar la retina.
5. Inmovilice la esclerótica sosteniendo un lado de la incisión con unas tijeras de vannas contra el fondo del plato de disección. Agarre la esclerótica con fórceps en el otro lado de la incisión. Retire la esclerótica sin tocar ni dañar la retina separando la esclerótica a ambos lados de la incisión para permitir el aislamiento de la retina con un daño mínimo al tejido.
6. Retire el segmento anterior con la lente del otro ojo y guarde la copa ocular a temperatura ambiente en la solución de Ames burbujeada con 5% de dióxido de carbono y 95% de oxígeno.
   NOTA: Las respuestas de luz funcionales de los ojos almacenados de esta manera se pueden obtener durante varias horas.
7. En los ojos grandes, incluidos los ojos de donantes humanos, limpie el globo del tejido conectivo restante y retire el segmento anterior y el cristalino, de manera similar al procedimiento descrito para el ojo del ratón. Use un bisturí para hacer un corte aproximadamente a 3 mm del limbo. Inserte tijeras de disección curvas en la incisión y corte a lo largo del limbo para extraer la porción anterior del ojo con la lente. Obtener muestras de retina para electrorretinografía ex vivo con un punzón de biopsia desechable de 3-6 mm.

5. Montaje del tejido en el portamuestras

1. Coloque la mitad inferior del portamuestras en una placa de Petri grande y llénela con el medio de Ames oxigenado para que la cúpula del portamuestras quede sumergida.
2. Agarre cuidadosamente el borde de la retina con pinzas finas y transfiera la retina a la cúpula del portamuestras ex vivo , con el lado del fotorreceptor hacia arriba.
3. Levante el portamuestras de la solución de Ames, teniendo cuidado de que la retina permanezca en su lugar.
4. Seque completamente la placa del portamuestras para minimizar el ruido, la diafonía eléctrica y la derivación de señales.
5. Ensamble ambas mitades del portamuestras con cuatro tornillos y conecte la línea de perfusión. Seque el electrodo en la mitad inferior del portamuestras y conecte el cable del ánodo al lado interno de la retina y el cable del cátodo al lado fotorreceptor.
6. Perfundir el portamuestras con al menos 1 ml / min de medio de Ames oxigenado durante 10-20 minutos para dar tiempo a que las respuestas a la luz se estabilicen.

6. Registro de la función de las células neuronales de la retina

1. Registre las familias de respuesta exponiendo la retina a destellos de luz de intensidad creciente. Por ejemplo, registre familias de respuesta fotorreceptora de varilla de ratón con intensidades de luz que van desde aproximadamente 10 a 1.000 fotones / μm 2 y las de células bipolares ON de ratón con intensidades de luz que van desde aproximadamente 0,6 a 20 fotones / μm².
2. Medir las respuestas de luz de los fotorreceptores (onda a) en presencia de cloruro de bario de 100 μM, que bloquea los canales de potasio en las células gliales de Müller, y DL-AP4 de 40 μM, que bloquea la transmisión de señales glutamatérgicas a las células bipolares ON (Figura 2B).
3. Para aislar la onda b, que se origina a partir de la función de las células bipolares ON, primero registre respuestas de luz combinadas de células fotorreceptoras y bipolares ON en presencia de cloruro de bario solo (Figura 2A). Luego, perfundir durante 5-10 minutos con el medio de Ames que contiene cloruro de bario, así como DL-AP4, y registrar las respuestas de los fotorreceptores a los mismos estímulos de luz que antes (Figura 2B). Reste las respuestas de los fotorreceptores de las respuestas combinadas de los fotorreceptores y las células ON-bipolares, calculando así las respuestas de luz de las células ON-bipolares solas (Figura 2C).

7. Optimización de la función de la célula bipolar ON

NOTA: La onda b, que se origina en las células bipolares ON, es altamente sensible a la temperatura en el portamuestras y la velocidad de perfusión.

1. Mantener una velocidad de perfusión de al menos 0,5 mL/min para obtener la onda b.
   NOTA: Una tasa de perfusión más alta de 1-2 ml / min es preferible para mantener una respuesta grande y estable de las células ON-bipolares.
2. Asegúrese de que para una velocidad de perfusión dada, la temperatura en el portamuestras cerca de la retina esté cerca de la temperatura corporal (es decir, aproximadamente 35-38 ° C).
   NOTA: Es importante ajustar la temperatura del perfusato, que se calienta antes de que llegue al portamuestras ERG ex vivo , para que esté dentro del rango de temperatura óptimo en la retina.
3. Guarde las copas oculares para su posterior experimentación protegidas de la luz y en el medio de Ames oxigenado a temperatura ambiente para mantener las ondas A y B normales durante varias horas.

Resultados

Ex vivo ERG permite el registro de respuestas de luz de fotorreceptores y células bipolares reproducibles y estables, por ejemplo, de la retina del ratón (Figura 2A-C). El registro de las respuestas de los fotorreceptores de las retinas de donantes humanos es posible con un retraso postmortem de hasta 5 h de la enucleación (Figura 2D) y de las respuestas de las células ON-bipolares con un retraso de enucleación de ...

Discusión

Originalmente desarrollado en 1865 por Holmgren para medir las respuestas de luz retiniana de la retina de anfibios¹⁰, las limitaciones técnicas inicialmente impidieron que el ERG fuera ampliamente utilizado. Sin embargo, los estudios seminales realizados por Ragnar Granit y otros identificaron los orígenes celulares del ERG y midieron las respuestas de los fotorreceptores y las células bipolares ON ex vivo^11,12,13

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mm socket	WPI	2026-10	materials to prepare electrode
Ag/AgCl Electrode	World Precision Instruments	EP1	materials to prepare electrode
Ames' medium	Sigma Aldrich	A1420	perfusion media
barium chloride	Sigma Aldrich	B0750	potassium channel blocker
DL-AP4	Tocris	0101	broad spectrum glutamatergic antagonist
OcuScience Ex Vivo ERG Adapter	OcuScience	n/a	ex vivo ERG specimen holder
Threaded luer connector	McMaster-Carr	51525K222 or 51525K223	materials to prepare electrode