작고 큰 눈의 망막 기능을 연구하기 위해 생체 외 망막 전도의 설정 및 조건 최적화

요약

기존 다중 전극 어레이 또는 패치 클램프 장비를 수정하면 생체 외 망막전전도에 더 널리 접근할 수 있습니다. 생체 외 광 반응을 기록하고 유지하는 개선된 방법은 건강한 망막, 안과 질환의 동물 모델 및 인간 기증자 망막에서 광수용체 및 ON-양극성 세포 기능의 연구를 용이하게 합니다.

초록

망막 신경 광 반응의 측정은 건강한 망막의 생리학을 조사하고, 망막 질환의 병리학 적 변화를 결정하고, 치료 적 개입을 테스트하는 데 중요합니다. 생체 외 망막 전도(ERG)를 사용하면 특정 약리학적 제제를 추가하고 전신 영향과 독립적으로 조직 내재적 변화를 평가하여 분리된 망막의 개별 세포 유형에서 기여도를 정량화할 수 있습니다. 망막 광 반응은 기존 패치 클램프 또는 미세 전극 어레이 장비에서 수정된 특수 생체 외 ERG 시편 홀더 및 기록 설정을 사용하여 측정할 수 있습니다. 특히, ON- 양극성 세포뿐만 아니라 광 수용체에 대한 연구는 시간이 지남에 따라 생체 외 ERG에서 빛 반응의 느리지 만 점진적인 감소로 인해 방해를 받았다. 관류 속도 증가 및 관류액 온도 조정은 생체 외 망막 기능을 향상시키고 응답 진폭과 안정성을 극대화합니다. 생체 외 ERG는 개별 망막 신경 세포 유형에 대한 연구를 독특하게 허용합니다. 또한 반응 진폭과 안정성을 최대화하기 위한 개선을 통해 대형 동물의 망막 샘플과 인간 기증자의 눈에서 빛 반응을 조사할 수 있으므로 생체 외 ERG는 망막 기능을 조사하는 데 사용되는 기술의 레퍼토리에 귀중한 추가 기능이 됩니다.

서문

전기 망막 촬영은 빛에 대한 반응으로 망막 기능을 측정합니다¹. 망막 생리학 및 병태생리학을 연구하고 망막 질환 치료의 성공을 측정하는 데 필수적입니다. 생체 내 ERG는 손상되지 않은 유기체에서 망막 기능을 평가하는 데 널리 사용되지만 상당한 한계가 있습니다 ^2,3. 이 중 생체 내 ERG에서 개별 망막 세포 유형의 정량 분석은 모든 망막 세포에서 빛 자극⁴에 이르는 잠재적 변화의 합을 기록하고 따라서 반응을 오버레이하기 때문에 방해를 받습니다. 또한 망막에 약물을 쉽게 첨가 할 수 없으며 전신 영향에 취약하며 신호 대 잡음비가 상대적으로 낮습니다. 이러한 단점은 단리된 망막 ^2,3,5,6의 기능을 조사하는 생체외 ERG에서 제거된다. ex vivo ERG는 약리학적 억제제를 첨가하고 과염기에 첨가할 수 있는 치료제를 쉽게 평가하여 특정 망막 세포 유형에서 크고 안정적인 반응을 기록할 수 있습니다. 동시에 전신 효과의 영향을 제거하고 생리적 소음 (예 : 심장 박동 또는 호흡)을 제거합니다.

생체외 ERG에서, 망막 또는 망막 샘플은 단리되고, 시편 홀더(^3,5)의 돔 상에 광수용체-측이 위로 향하도록 장착된다. 시편 홀더를 조립하고 망막에 가열되고 산소가 공급되는 매체를 공급하는 관류 시스템에 연결하고 컴퓨터로 제어되는 빛 자극을 전달하도록 수정된 현미경 스테이지에 놓습니다. 빛에 의해 유도된 응답을 기록하기 위해 시편 홀더는 증폭기, 디지타이저 및 기록 시스템에 연결됩니다(그림 1). 이 기술은 빛 자극의 매개 변수를 변경하고 약리학 적 약제를 추가하여 막대 및 원뿔 광 수용체, ON- 양극성 세포 및 Müller glia에서 반응을 분리 할 수 있습니다.

기존 패치 클램프 또는 다중 전극 어레이(MEA) 설정은 상용 생체 외 ERG 어댑터 또는 맞춤형 폴리카보네이트 컴퓨터 수치 제어(CNC) 가공 시편 홀더와 함께 생체 외 ERG를 기록하도록 변환하여 마우스와 같은 작은 동물 모델의 망막에서 광 반응을 측정할 수 있습니다. 이 수정은 생체 외 ERG의 접근성을 높이는 동시에 특수 장비의 필요성을 최소화합니다. 시편 홀더의 설계는 장착 기술을 단순화하고 전극을 통합하여 이전에 보고된 경망막 ex vivo ERG 방법⁷에 비해 미세 전극을 조작할 필요가 없습니다. 시편 홀더 내부의 관류 속도와 온도는 광 수용체와 ON- 양극성 세포의 반응 특성에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. 이러한 조건을 조정함으로써, 생체외 ERG는 장기간에 걸쳐 분리된 마우스 망막으로부터 신뢰성 있게 기록될 수 있다. 최적화된 실험 조건은 큰 동물의 눈과 인간 기증^{자의 눈을 포함한} 더 큰 망막의 망막 펀치에서 생체 외 ERG 기록을 가능하게 합니다8.

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프로토콜

마우스를 사용한 모든 실험은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 수행되었으며 유타 대학의 기관 동물 연구위원회의 승인을 받았습니다. 이 비디오의 시연을 위한 돼지 눈은 도축장(지속 가능한 돼지 자원, 존슨빌)에서 사후 검시를 받았습니다. 눈은 FDA, 장기 조달 기관 협회 (AOPO) 및 미국 안구 은행 협회의 정식 인증을받은 유타 라이온스 안구 은행, 샌디에이고 안구 은행 또는 Lifesharing을 통해 연구 사용에 대한 동의를 받아 뇌 또는 심장사 후 인간 기증자로부터 얻었습니다. 인간 기증자 눈의 사용은 유타 대학교 (IRB 번호 00106658)와 ScrippsHealth IRB (IRB 번호 16-6781)에서 면제 상태였습니다.

1. 생체 외 ERG 설정

1. 다중 전극 어레이 설정을 변환하려면 헤드 스테이지를 통해 ex vivo ERG 시편 홀더를 다중 전극 어레이 시스템의 인터페이스 보드의 아날로그 입력에 연결된 차동 증폭기에 연결합니다. 다중 전극 어레이용 기록 소프트웨어를 사용하여 생체 외 ERG의 입력 데이터를 기록하고 저장합니다. 차동 증폭기의 게인을 100으로 설정하고 디지타이저 사양에 따라 10x 전압 증폭을 추가합니다. 저역 통과 필터를 100Hz로 설정합니다.
2. 패치 클램프 설정을 변환하려면 헤드 스테이지를 통해 ex vivo ERG 시편 홀더를 패치 클램프 증폭기의 헤드 스테이지에 연결된 차동 증폭기에 연결합니다. 패치 클램프 시스템 소프트웨어 및 디지타이저를 사용하여 생체 외 ERG의 입력 데이터를 기록하고 저장합니다. 차동 증폭기의 이득을 100으로 설정하고 패치 클램프 헤드 스테이지를 통해 추가 10x 전압 증폭을 적용합니다. 저역 통과 필터를 100Hz로 설정합니다.
3. 적절한 파장(예: 막대 광수용체 및 ON-양극성 세포 반응을 유도하기 위해 약 530nm)의 LED를 현미경에 연결합니다. 빛 자극을 트리거할 수 있는 녹음 소프트웨어로 LED를 제어합니다. 광 자극을 제어하려면 디지타이저의 아날로그 출력으로 제어되는 LED 드라이버를 사용하십시오.
4. 포토다이오드를 사용하여 시편 홀더의 망막 위치에서 LED의 광 출력을 보정합니다. 필요한 경우 중성 밀도 필터를 광 경로에 삽입하여 광도를 어둡게 합니다.
5. 상업적으로 이용 가능하거나 맞춤 제작된 생체 외 ERG 시편 홀더를 사용하십시오.
   알림: 폴리 카보네이트의 CNC 가공 도면은 요청시 저자로부터 얻을 수 있습니다.
6. 전극을 준비하려면 Ag/AgCl 펠릿 전극을 나사산 루어 커넥터에 삽입합니다. 루어 커넥터 내부를 뜨거운 접착제로 채우고 나사산이 없는 쪽에서 뜨거운 접착제에 2mm 소켓을 삽입합니다. EP1 전극의 은선을 2mm 소켓에 납땜합니다. 나사산에 O-링이 있는 완성된 전극을 생체 외 ERG 시편 홀더의 전극 포트에 나사로 고정합니다.
   알림: 전극은 오랫동안 사용할 수 있습니다. 펠릿 표면에 먼지가 쌓이거나 어두워지면 (높은 오프셋 전압 및 / 또는 전기 드리프트가 발생할 수 있음) 미세한 사포를 사용하여 "연마"할 수 있습니다.
7. 실험 최소 1일 전에 에폭시 접착제를 사용하여 ex vivo ERG 시편 홀더의 돔에 여과지를 접착하여 접착제가 전극 채널을 방해하지 않도록 합니다(비디오는 ³ 참조).

2. 동물 준비

1. 어두운 적응 동물 최소 6 시간 또는 하룻밤.

3. 장비 준비

1. 생체 외 ERG의 관류 라인을 5% 이산화탄소와 95% 산소로 버블링된 Ames의 배지로 채웁니다. 관류 라인을 시편 홀더 근처의 DC 전류원 또는 열 컨트롤러가있는 발열체에 연결하여 Ames의 매체를 따뜻하게하여 망막이 약 35-38 ° C로 유지되도록합니다.
2. 생체 외 ERG 시편 홀더의 양쪽 절반을 전극 용액으로 채우고 루어 스토퍼로 관류 라인을 밀봉하고 전극을 연결하고 4개의 나사로 시편 홀더를 조립합니다(비디오는 ³개 참조).
3. 멀티 미터의 프로브를 전극에 삽입하여 조립 된 시편 홀더의 전극 사이의 저항 및 오프셋 전압을 확인하십시오.
   알림: 막힘이없고 전극 상태가 양호한 경우 저항은 100kΩ 미만이고 오프셋 전압은 5mV 미만이어야합니다.
4. 조립된 시편 홀더를 관류 라인에 연결하고 빛을 전달하도록 설정된 현미경 스테이지에 놓습니다. 시편 홀더와 관류 라인에 기포가 없는지 확인하십시오.

4. 조직 준비

1. 동물을_CO2 로 희생시키고 즉시 눈을 핵 처리하거나, 큰 동물 또는 인간 공여자의 눈을 얻는다.
2. 나머지 결합 조직과 외안근의 지구본을 청소하십시오. 시신경을 잘라냅니다.
3. 여과지에 마우스 눈의 윤부에서 약 1mm 떨어진 오라 세라 타를 따라 면도날로 작은 절개를 조심스럽게 놓습니다. 미세한 반나 가위를 절개 부위에 삽입하고 윤부를 따라 절단하여 렌즈로 눈의 앞쪽 부분을 제거합니다.
4. 아이컵을 Ames의 배지가 들어 있는 접시에 옮깁니다. 망막에 닿지 않도록주의하면서 미세한 집게로 공막을 잡으십시오. 망막과 공막 사이에 vannas 가위를 삽입하고 공막을 주변에서 중앙 부분으로 자릅니다. 망막을 만지거나 손상시키지 않도록주의하십시오.
5. 해부 접시의 바닥에 vannas 가위로 절개의 한쪽을 잡고 공막을 고정하십시오. 절개 부위의 다른쪽에있는 집게로 공막을 잡으십시오. 조직 손상을 최소화하면서 망막을 분리할 수 있도록 절개 부위의 양쪽에 있는 공막을 당겨 망막을 건드리거나 손상시키지 않고 공막을 제거합니다.
6. 동료 눈에서 렌즈가 있는 앞쪽 부분을 제거하고 5% 이산화탄소와 95% 산소가 함유된 Ames의 용액에 아이 컵을 실온에서 보관하십시오.
   알림: 이러한 방식으로 저장된 눈의 기능적 빛 반응은 몇 시간 동안 얻을 수 있습니다.
7. 인간 기증자의 눈을 포함한 큰 눈에서는 마우스 눈에 대해 설명된 절차와 유사하게 나머지 결합 조직의 지구를 청소하고 앞쪽 세그먼트와 수정체를 제거합니다. 메스를 사용하여 윤부에서 약 3mm 정도 자릅니다. 구부러진 해부 가위를 절개 부위에 삽입하고 윤부를 따라 절단하여 렌즈로 눈의 앞쪽 부분을 제거합니다. 3-6mm 일회용 생검 펀치로 생체 외 전기 망막 조영술을 위한 망막 표본을 얻습니다.

5. 표본 홀더에 조직 장착

1. 시편 홀더의 아래쪽 절반을 큰 페트리 접시에 넣고 산소가 공급된 Ames의 배지로 채워 시편 홀더의 돔이 잠기도록 합니다.
2. 미세한 집게로 망막의 가장자리를 조심스럽게 잡고 망막을 생체 외 시편 홀더의 돔으로 옮기고 광 수용체 쪽이 위를 향하게합니다.
3. Ames의 용액에서 표본 홀더를 들어 올려 망막이 제자리에 유지되도록 주의하십시오.
4. 소음, 전기 누화 및 신호 션트를 최소화하기 위해 시편 홀더의 플레이트를 완전히 건조시킵니다.
5. 시편 홀더의 양쪽 절반을 4 개의 나사로 조립하고 관류 라인을 연결하십시오. 시편 홀더의 하반부에있는 전극을 건조시키고 양극 케이블을 내부 망막 측에 연결하고 음극 케이블을 광 수용체 측에 연결합니다.
6. 검체 홀더에 최소 1mL/min의 산소가 함유된 Ames' 배지를 10-20분 동안 관류하여 빛 반응이 안정화될 시간을 허용합니다.

6. 망막 신경 세포 기능 기록

1. 망막을 점점 더 강렬한 섬광에 노출시켜 반응 가족을 기록합니다. 예를 들어, 약 10 - 1,000 광자/μm2 범위의 광도를 갖는 마우스 막대 광수용체 반응 패밀리와 약 0.6 - 20 광자/^μm2 범위의 광도를 갖는 마우스 ON-양극성 세포의 반응 패밀리를 기록한다.
2. Müller 신경교 세포의 칼륨 채널을 차단하는 100μM 염화바륨과 ON-양극성 세포로의 글루타메이트성 신호 전달을 차단하는 40μM DL-AP4가 있는 상태에서 광수용체 광 반응(a-wave)을 측정합니다(그림 2B).
3. ON- 양극성 세포의 기능에서 비롯된 b- 파를 분리하려면 먼저 염화 바륨 단독의 존재하에 광 수용체와 ON- 양극성 세포 모두의 결합 된 광 반응을 기록합니다 (그림 2A). 그런 다음 염화바륨과 DL-AP4가 포함된 Ames의 배지로 5-10분 동안 관류하고 이전과 동일한 광 자극에 대한 광수용체 반응을 기록합니다(그림 2B). 결합된 광수용체 및 ON-양극성 세포 반응에서 광수용체 반응을 빼서 ON-양극성 세포 광 반응만 계산합니다(그림 2C).

7. ON-양극성 세포 기능 최적화

참고: ON-양극성 세포에서 발생하는 b-wave는 시편 홀더의 온도와 관류 속도에 매우 민감합니다.

1. b-wave를 얻기 위해 최소 0.5mL/분의 관류 속도를 유지하십시오.
   참고: ON-양극성 세포에서 크고 안정적인 반응을 유지하려면 1-2mL/min의 더 높은 관류 속도가 바람직합니다.
2. 주어진 관류 속도에 대해 망막 근처의 시편 홀더의 온도가 체온에 가깝도록하십시오 (즉, 약 35-38 ° C).
   알림: 생체 외 ERG 시편 홀더에 도달하기 전에 가열되는 관류액의 온도를 조정하여 망막에서 최적의 온도 범위 내에 있도록 하는 것이 중요합니다.
3. 나중에 실험을 위해 빛으로부터 보호되고 실온에서 산소가 공급된 Ames의 배지에 아이 컵을 보관하여 몇 시간 동안 정상적인 a-파 및 b-파를 유지하십시오.

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결과

생체 외 ERG를 사용하면 예를 들어 마우스 망막에서 재현 가능하고 안정적인 광수용체 및 ON-양극성 세포 광 반응을 기록할 수 있습니다(그림 2A-C). 인간 기증자 망막의 광수용체 반응 기록은 핵 제거의 사후 최대 5시간 지연(그림 2D) 및 <20분의 핵 제거 지연(그림 2E)으로 ON-양극성 세포 반응의 기록이 ...

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토론

원래 Holmgren이 양서류 망막¹⁰의 망막 빛 반응을 측정하기 위해 1865년에 개발한 이 제품은 기술적 제약으로 인해 ERG가 널리 사용되지 못했습니다. 그럼에도 불구하고 Ragnar Granit과 다른 사람들의 획기적인 연구는 ERG의 세포 기원을 확인하고 생체 외^11,12,13에서 광 수용체 및 ON- 양극성 세포 반응을 측정했?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mm socket	WPI	2026-10	materials to prepare electrode
Ag/AgCl Electrode	World Precision Instruments	EP1	materials to prepare electrode
Ames' medium	Sigma Aldrich	A1420	perfusion media
barium chloride	Sigma Aldrich	B0750	potassium channel blocker
DL-AP4	Tocris	0101	broad spectrum glutamatergic antagonist
OcuScience Ex Vivo ERG Adapter	OcuScience	n/a	ex vivo ERG specimen holder
Threaded luer connector	McMaster-Carr	51525K222 or 51525K223	materials to prepare electrode