작고 큰 눈의 망막 기능을 연구하기 위해 생체 외 망막 전도의 설정 및 조건 최적화

요약

기존 다중 전극 어레이 또는 패치 클램프 장비를 수정하면 생체 외 망막전전도에 더 널리 접근할 수 있습니다. 생체 외 광 반응을 기록하고 유지하는 개선된 방법은 건강한 망막, 안과 질환의 동물 모델 및 인간 기증자 망막에서 광수용체 및 ON-양극성 세포 기능의 연구를 용이하게 합니다.

초록

망막 신경 광 반응의 측정은 건강한 망막의 생리학을 조사하고, 망막 질환의 병리학 적 변화를 결정하고, 치료 적 개입을 테스트하는 데 중요합니다. 생체 외 망막 전도(ERG)를 사용하면 특정 약리학적 제제를 추가하고 전신 영향과 독립적으로 조직 내재적 변화를 평가하여 분리된 망막의 개별 세포 유형에서 기여도를 정량화할 수 있습니다. 망막 광 반응은 기존 패치 클램프 또는 미세 전극 어레이 장비에서 수정된 특수 생체 외 ERG 시편 홀더 및 기록 설정을 사용하여 측정할 수 있습니다. 특히, ON- 양극성 세포뿐만 아니라 광 수용체에 대한 연구는 시간이 지남에 따라 생체 외 ERG에서 빛 반응의 느리지 만 점진적인 감소로 인해 방해를 받았다. 관류 속도 증가 및 관류액 온도 조정은 생체 외 망막 기능을 향상시키고 응답 진폭과 안정성을 극대화합니다. 생체 외 ERG는 개별 망막 신경 세포 유형에 대한 연구를 독특하게 허용합니다. 또한 반응 진폭과 안정성을 최대화하기 위한 개선을 통해 대형 동물의 망막 샘플과 인간 기증자의 눈에서 빛 반응을 조사할 수 있으므로 생체 외 ERG는 망막 기능을 조사하는 데 사용되는 기술의 레퍼토리에 귀중한 추가 기능이 됩니다.

서문

전기 망막 촬영은 빛에 대한 반응으로 망막 기능을 측정합니다¹. 망막 생리학 및 병태생리학을 연구하고 망막 질환 치료의 성공을 측정하는 데 필수적입니다. 생체 내 ERG는 손상되지 않은 유기체에서 망막 기능을 평가하는 데 널리 사용되지만 상당한 한계가 있습니다 ^2,3. 이 중 생체 내 ERG에서 개별 망막 세포 유형의 정량 분석은 모든 망막 세포에서 빛 자극⁴에 이르는 잠재적 변화의 합을 기록하고 따라서 반응을 오버레이하기 때문에 방해를 받습니다. 또한 망막에 약물을 쉽게 첨가 할 수 없으며 전신 영향에 취약하며 신호 대 잡음비가 상대적으로 낮습니다. 이러한 단점은 단리된 망막 ^2,3,5,6의 기능을 조사하는 생체외 ERG에서 제거된다. ex vivo ERG는 약리학적 억제제를 첨가하고 과염기에 첨가할 수 있는 치....

프로토콜

마우스를 사용한 모든 실험은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 수행되었으며 유타 대학의 기관 동물 연구위원회의 승인을 받았습니다. 이 비디오의 시연을 위한 돼지 눈은 도축장(지속 가능한 돼지 자원, 존슨빌)에서 사후 검시를 받았습니다. 눈은 FDA, 장기 조달 기관 협회 (AOPO) 및 미국 안구 은행 협회의 정식 인증을받은 유타 라이온스 안구 은행, 샌디에이고 안구 은행 또는 Lifesharing을 통해 연구 사용에 대한 동의를 받아 뇌 또는 심장사 후 인간 기증자로부터 얻었습니다. 인간 기증자 눈의 사용은 유타 대학교 (IRB 번호 00106658)와 ScrippsHealth IRB (IRB 번호 16-6781)에서 면제 상태였습니다.

1. 생체 외 ERG 설정

1. 다중 전극 어레이 설정을 변환하려면 헤드 스테이지를 통해 ex vivo ERG 시편 홀더를 다중 전극 어레이 시스템의 인터페이스 보드의 아날로그 입력에 연결된 차동 증폭기에 연결합니다. 다중 전극 어레이용 기록 소프트웨어를 사용하여 생체 외 ERG의 입력 데이터를 기록하고 저장합니다. 차동 증폭기의 게인을 100으로 설....

결과

생체 외 ERG를 사용하면 예를 들어 마우스 망막에서 재현 가능하고 안정적인 광수용체 및 ON-양극성 세포 광 반응을 기록할 수 있습니다(그림 2A-C). 인간 기증자 망막의 광수용체 반응 기록은 핵 제거의 사후 최대 5시간 지연(그림 2D) 및 <20분의 핵 제거 지연(그림 2E)으로 ON-양극성 세포 반응의 기록이 .......

토론

원래 Holmgren이 양서류 망막¹⁰의 망막 빛 반응을 측정하기 위해 1865년에 개발한 이 제품은 기술적 제약으로 인해 ERG가 널리 사용되지 못했습니다. 그럼에도 불구하고 Ragnar Granit과 다른 사람들의 획기적인 연구는 ERG의 세포 기원을 확인하고 생체 외^11,12,13에서 광 수용체 및 ON- 양극성 세포 반응을 측정했?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mm socket	WPI	2026-10	materials to prepare electrode
Ag/AgCl Electrode	World Precision Instruments	EP1	materials to prepare electrode
Ames' medium	Sigma Aldrich	A1420	perfusion media
barium chloride	Sigma Aldrich	B0750	potassium channel blocker
DL-AP4	Tocris	0101	broad spectrum glutamatergic antagonist
OcuScience Ex Vivo ERG Adapter	OcuScience	n/a	ex vivo ERG specimen holder
Threaded luer connector	McMaster-Carr	51525K222 or 51525K223	materials to prepare electrode