Ottimizzazione della configurazione e delle condizioni per l'elettroretinogramma ex vivo per studiare la funzione della retina in occhi piccoli e grandi

Riepilogo

La modifica dell'array multielettrodo esistente o delle apparecchiature patch clamp rende l'elettroretinogramma ex vivo più ampiamente accessibile. Metodi migliorati per registrare e mantenere le risposte alla luce ex vivo facilitano lo studio della funzione dei fotorecettori e delle cellule bipolari ON nella retina sana, nei modelli animali di malattie degli occhi e nelle retine dei donatori umani.

Abstract

Le misurazioni delle risposte alla luce neuronale retinica sono fondamentali per studiare la fisiologia della retina sana, determinare i cambiamenti patologici nelle malattie retiniche e testare gli interventi terapeutici. L'elettroretinogramma ex vivo (ERG) consente la quantificazione dei contributi dei singoli tipi cellulari nella retina isolata mediante aggiunta di agenti farmacologici specifici e la valutazione dei cambiamenti intrinseci tissutali indipendentemente dalle influenze sistemiche. Le risposte alla luce retinica possono essere misurate utilizzando un supporto per campioni ERG ex vivo specializzato e una configurazione di registrazione, modificata da patch clamp o apparecchiature array di microelettrodi esistenti. In particolare, lo studio delle cellule ON-bipolari, ma anche dei fotorecettori, è stato ostacolato dal lento ma progressivo declino delle risposte luminose nell'ERG ex vivo nel tempo. L'aumento della velocità di perfusione e la regolazione della temperatura del perfufato migliorano la funzione retinica ex vivo e massimizzano l'ampiezza e la stabilità della risposta. L'ERG ex vivo consente unicamente lo studio dei singoli tipi di cellule neuronali retiniche. Inoltre, i miglioramenti per massimizzare le ampiezze e la stabilità della risposta consentono lo studio delle risposte alla luce in campioni di retina di animali di grandi dimensioni, nonché negli occhi di donatori umani, rendendo l'ERG ex vivo una preziosa aggiunta al repertorio di tecniche utilizzate per studiare la funzione retinica.

Introduzione

L'elettroretinografia misura la funzione retinica in risposta alla luce¹. È parte integrante dello studio della fisiologia e della fisiopatologia della retina e della misurazione del successo delle terapie per le malattie della retina. L'ERG in vivo è ampiamente utilizzato per valutare la funzione retinica in organismi intatti, ma presenta limitazioni significative ^2,3. Tra questi, l'analisi quantitativa dei singoli tipi di cellule retiniche nell'ERG in vivo è ostacolata, poiché registra la somma dei potenziali cambiamenti, e quindi delle risposte sovrapposte, da tutte le cellule retiniche agli stimoli luminosi⁴. Inoltre, non consente facilmente l'aggiunta di farmaci alla retina, è vulnerabile alle influenze sistemiche e ha un rapporto segnale-rumore relativamente basso. Questi svantaggi vengono eliminati nell'ERG ex vivo che indaga la funzione della retina isolata 2,3,5,6. L'ERG ex vivo consente la registrazione di risposte ampie e stabili da specifici tipi di cellule retiniche mediante aggiunta di inibitori farmacologici e una facile valutazione degli agenti terapeutici, che possono essere aggiunti al superfusato. Allo stesso tempo, rimuove le influenze degli effetti sistemici ed elimina il rumore fisiologico (ad esempio, il battito cardiaco o la respirazione).

Nell'ERG ex vivo, le retine o i campioni retinici sono isolati e montati con il lato fotorecettore rivolto verso l'alto sulla cupola del portacampioni ^3,5. Il supporto del campione è assemblato, collegato a un sistema di perfusione che fornisce alla retina mezzi riscaldati e ossigenati e posizionato sul palco di un microscopio, che è stato modificato per fornire stimoli luminosi controllati dal computer. Per registrare le risposte suscitate dalla luce, il portacampioni è collegato a un amplificatore, un digitalizzatore e un sistema di registrazione (Figura 1). Questa tecnica consente l'isolamento delle risposte dai fotorecettori dei bastoncelli e dei coni, dalle cellule bipolari ON e dalla glia di Müller modificando i parametri degli stimoli luminosi e aggiungendo agenti farmacologici.

Una patch clamp esistente o una configurazione MEA (Multi-Electrode Array) può essere convertita per registrare ex vivo ERG, in combinazione con un adattatore ERG ex vivo disponibile in commercio o un supporto per campioni lavorato a controllo numerico computerizzato (CNC) in policarbonato personalizzato, per misurare le risposte alla luce nelle retine di piccoli modelli animali, come i topi. Questa modifica aumenta l'accessibilità dell'ERG ex vivo, riducendo al minimo la necessità di attrezzature specializzate. Il design del portacampioni semplifica la tecnica di montaggio e integra gli elettrodi, eliminando la necessità di manipolazione dei microelettrodi rispetto ai metodi ERG transretinici ex vivo precedentemente riportati⁷. La velocità di perfusione e la temperatura all'interno del portacampioni sono fattori importanti che influenzano le proprietà di risposta dei fotorecettori e delle cellule bipolari ON. Regolando queste condizioni, l'ERG ex vivo può essere registrato in modo affidabile dalla retina isolata del topo per periodi di tempo prolungati. Le condizioni sperimentali ottimizzate consentono registrazioni ERG ex vivo in punzoni retinici da retine più grandi, inclusi occhi di grandi animali e occhi di donatori umani⁸.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati condotti in conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per gli studi sugli animali dell'Università dello Utah. Gli occhi di maiale per la dimostrazione di questo video sono stati ottenuti postmortem dal macello (Sustainable Swine Resources, Johnsonville). Gli occhi sono stati ottenuti da donatori umani dopo la morte cerebrale o cardiaca con il consenso per l'uso nella ricerca attraverso la Utah Lions Eye Bank, la San Diego Eye Bank o Lifesharing, che sono pienamente accreditati dalla FDA, dall'Association of Organ Procurement Organizations (AOPO) e dalla Eye Banks of America Association. L'uso di occhi di donatori umani aveva lo status di esenzione presso l'Università dello Utah (IRB n. 00106658) e ScrippsHealth IRB (IRB n. 16-6781).

1. Istituzione dell'ERG ex vivo

1. Per convertire una configurazione di array multielettrodo, collegare il supporto del campione ERG ex vivo tramite uno stadio di testa a un amplificatore differenziale, che viene collegato all'ingresso analogico della scheda di interfaccia del sistema array multielettrodo. Utilizzare il software di registrazione per l'array multielettrodo per registrare e memorizzare i dati di input dall'ERG ex vivo . Impostare il guadagno dell'amplificatore differenziale su 100 e aggiungere un'ulteriore amplificazione di tensione 10x a seconda delle specifiche del digitalizzatore. Impostare il filtro passa-basso su 100 Hz.
2. Per convertire una configurazione patch clamp è collegare il portacampioni ERG ex vivo tramite uno stadio di testa a un amplificatore differenziale, collegato allo stadio di testa dell'amplificatore patch morsetto. Utilizzare il software del sistema patch clamp e il digitalizzatore per registrare e memorizzare i dati di input dall'ERG ex vivo. Impostare il guadagno dell'amplificatore differenziale su 100 e applicare un'ulteriore amplificazione di tensione 10x tramite lo stadio della testa del morsetto patch. Impostare il filtro passa-basso su 100 Hz.
3. Collegare i LED con le lunghezze d'onda appropriate (ad esempio, circa 530 nm per suscitare risposte del fotorecettore e delle cellule bipolari ON) al microscopio. Controlla i LED con un software di registrazione che consente l'attivazione di stimoli luminosi. Per controllare gli stimoli luminosi, utilizzare un driver LED controllato da uscite analogiche da un digitalizzatore.
4. Calibrare l'emissione luminosa dei LED nella posizione della retina nel supporto del campione utilizzando un fotodiodo. Se necessario, inserire filtri a densità neutra nel percorso della luce per attenuare l'intensità della luce.
5. Utilizzare un portacampioni ERG ex vivo disponibile in commercio o costruito su misura.
   NOTA: I disegni per la lavorazione CNC in policarbonato possono essere ottenuti dagli autori su richiesta.
6. Per preparare l'elettrodo, inserire un elettrodo a pellet Ag/AgCl in un connettore luer filettato. Riempire l'interno del connettore luer con colla a caldo e inserire una presa da 2 mm nella colla a caldo dal lato non filettato. Saldare un filo d'argento dell'elettrodo EP1 alla presa da 2 mm. Avvitare l'elettrodo finito, con un o-ring sulla filettatura, nelle porte dell'elettrodo del portacampioni ERG ex vivo .
   NOTA: Gli elettrodi possono essere utilizzati per un lungo periodo. Se la superficie del pellet accumula sporco e/o diventa scura (ciò può causare un'elevata tensione di offset e/o deriva elettrica), può essere "lucidata" con carta vetrata fine.
7. Almeno 1 giorno prima della sperimentazione, incollare le carte da filtro sulle cupole del portacampioni ERG ex vivo utilizzando colla epossidica, assicurandosi che la colla non ostruisca il canale dell'elettrodo (vedi ³ per il video).

2. Preparazione degli animali

1. Gli animali scuri adattano per almeno 6 ore o durante la notte.

3. Preparazione dell'attrezzatura

1. Riempire la linea di perfusione dell'ERG ex vivo con il mezzo di Ames gorgogliato con il 5% di anidride carbonica e il 95% di ossigeno. Collegare la linea di perfusione a un elemento riscaldante con una sorgente di corrente continua o un regolatore di calore vicino al supporto del campione per riscaldare il mezzo di Ames, in modo che la retina sia mantenuta a circa 35-38 °C.
2. Riempire entrambe le metà del portacampioni ERG ex vivo con una soluzione di elettrodi, sigillare la linea di perfusione con tappi luer, collegare gli elettrodi e assemblare il supporto del campione con quattro viti (vedere ³ per il video).
3. Controllare la resistenza e la tensione di offset tra gli elettrodi nel supporto del campione assemblato inserendo le sonde del multimetro negli elettrodi.
   NOTA: Se non ci sono blocchi e gli elettrodi sono in buone condizioni, la resistenza deve essere inferiore a 100 kΩ e la tensione di offset inferiore a 5 mV.
4. Collegare il supporto del campione assemblato alla linea di perfusione e posizionarlo sul palco di un microscopio impostato per fornire lampi di luce. Assicurarsi che il portacampioni e la linea di perfusione non contengano bolle d'aria.

4. Preparazione dei tessuti

1. Sacrificare l'animale con CO₂ ed enucleare immediatamente gli occhi, o ottenere grandi occhi di animali o donatori umani.
2. Pulire il globo del tessuto connettivo rimanente e dei muscoli extraoculari. Tagliare il nervo ottico.
3. Su carta da filtro, posizionare con cura una piccola incisione con una lama di rasoio lungo l'ora serrata, a circa 1 mm dal limbus nell'occhio del topo. Inserire sottili forbici vannas nell'incisione e tagliare lungo il limbus per rimuovere la porzione anteriore dell'occhio con la lente.
4. Spostare la concia oculare in un piatto contenente il mezzo di Ames. Afferrare la sclera con una pinza fine, facendo attenzione a non toccare la retina. Inserire le forbici vannas tra la retina e la sclera e tagliare la sclera dalla periferica verso la parte centrale. Fare attenzione a non toccare o danneggiare la retina.
5. Immobilizzare la sclera tenendo un lato dell'incisione con le forbici vannas contro il fondo del piatto di dissezione. Afferrare la sclera con una pinza sull'altro lato dell'incisione. Rimuovere la sclera senza toccare o danneggiare la retina separando la sclera su entrambi i lati dell'incisione per consentire l'isolamento della retina con danni minimi al tessuto.
6. Rimuovere il segmento anteriore con la lente dall'occhio e conservare la concia oculare a temperatura ambiente nella soluzione di Ames bollente con il 5% di anidride carbonica e il 95% di ossigeno.
   NOTA: Le risposte funzionali alla luce degli occhi memorizzati in questo modo possono essere ottenute per diverse ore.
7. Negli occhi grandi, compresi gli occhi dei donatori umani, pulire il globo del tessuto connettivo rimanente e rimuovere il segmento anteriore e la lente, in modo simile alla procedura descritta per l'occhio del topo. Usa un bisturi per fare un taglio a circa 3 mm dal limbus. Inserire forbici da dissezione curve nell'incisione e tagliare lungo il limbus per rimuovere la porzione anteriore dell'occhio con la lente. Ottenere campioni retinici per elettroretinografia ex vivo con un punch bioptico monouso da 3-6 mm.

5. Montaggio del tessuto sul portacampioni

1. Posizionare la metà inferiore del portacampioni in una grande capsula di Petri e riempire con mezzo di Ames ossigenato in modo che la cupola del portacampioni sia appena sommersa.
2. Afferrare con attenzione il bordo della retina con una pinza fine e trasferire la retina sulla cupola del portacampioni ex vivo , lato fotorecettore rivolto verso l'alto.
3. Sollevare il supporto del campione dalla soluzione di Ames, avendo cura che la retina rimanga in posizione.
4. Asciugare completamente la piastra del portacampioni per ridurre al minimo il rumore, la diafonia elettrica e lo smistamento del segnale.
5. Assemblare entrambe le metà del portacampioni con quattro viti e collegare la linea di perfusione. Asciugare l'elettrodo nella metà inferiore del supporto del campione e collegare il cavo anodico al lato retinico interno e il cavo catodico al lato fotorecettore.
6. Perfondere il supporto del campione con almeno 1 ml / min di mezzo di Ames ossigenato per 10-20 minuti per consentire la stabilizzazione delle risposte alla luce.

6. Registrazione della funzione delle cellule neuronali retiniche

1. Registra le famiglie di risposta esponendo la retina a lampi di luce di intensità crescente. Ad esempio, registrare le famiglie di risposta dei fotorecettori dei tondini con intensità luminose che vanno da circa 10 a 1.000 fotoni / μm 2 e quelle delle cellule bipolari ON del topo con intensità luminose che vanno da circa 0,6 a 20 fotoni / μm².
2. Misurare le risposte alla luce dei fotorecettori (onda a) in presenza di 100 μM di cloruro di bario, che blocca i canali del potassio nelle cellule gliali di Müller, e 40 μM DL-AP4, che blocca la trasmissione del segnale glutammatergico alle cellule bipolari ON (Figura 2B).
3. Per isolare l'onda b, che ha origine dalla funzione delle cellule bipolari ON, registrare prima le risposte luminose combinate sia dal fotorecettore che dalle cellule bipolari ON in presenza del solo cloruro di bario (Figura 2A). Quindi, perfondere per 5-10 minuti con il mezzo di Ames contenente cloruro di bario, così come DL-AP4, e registrare le risposte dei fotorecettori agli stessi stimoli luminosi di prima (Figura 2B). Sottrarre le risposte dei fotorecettori dalle risposte combinate del fotorecettore e delle cellule bipolari ON, calcolando così solo le risposte alla luce delle cellule bipolari ON (Figura 2C).

7. Ottimizzazione della funzione delle cellule bipolari ON

NOTA: L'onda b, che proviene dalle cellule bipolari ON, è altamente sensibile alla temperatura nel supporto del campione e alla velocità di perfusione.

1. Mantenere una velocità di perfusione di almeno 0,5 ml/min per ottenere l'onda b.
   NOTA: Un tasso di perfusione più elevato di 1-2 ml / min è preferibile per mantenere una risposta ampia e stabile dalle cellule bipolari ON.
2. Assicurarsi che per una data velocità di perfusione, la temperatura nel portacampioni vicino alla retina sia vicina alla temperatura corporea (cioè circa 35-38 °C).
   NOTA: È importante regolare la temperatura del perfuffato, che viene riscaldato prima che raggiunga il portacampioni ERG ex vivo , in modo che rientri nell'intervallo di temperatura ottimale alla retina.
3. Conservare le conchiglie oculari per una successiva sperimentazione al riparo dalla luce e nel mezzo ossigenato di Ames a temperatura ambiente per mantenere le normali onde a e b per diverse ore.

Risultati

Ex vivo ERG consente la registrazione di risposte fotorecettoriali e cellule bipolari riproducibili e stabili, ad esempio, dalla retina del topo (Figura 2A-C). La registrazione delle risposte dei fotorecettori dalle retine dei donatori umani è possibile con un ritardo postmortem fino a 5 ore dell'enucleazione (Figura 2D) e delle risposte delle cellule bipolari ON con un ritardo di enucleazione di <20 minuti (

Discussione

Originariamente sviluppato nel 1865 da Holmgren per misurare le risposte alla luce retinica dalla retina anfibia¹⁰, i vincoli tecnici inizialmente impedirono all'ERG di essere ampiamente utilizzato. Tuttavia, studi seminali di Ragnar Granit e altri hanno identificato le origini cellulari dell'ERG e misurato le risposte dei fotorecettori e delle cellule bipolari ON ex vivo^11,12,13. Da allora, meto...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mm socket	WPI	2026-10	materials to prepare electrode
Ag/AgCl Electrode	World Precision Instruments	EP1	materials to prepare electrode
Ames' medium	Sigma Aldrich	A1420	perfusion media
barium chloride	Sigma Aldrich	B0750	potassium channel blocker
DL-AP4	Tocris	0101	broad spectrum glutamatergic antagonist
OcuScience Ex Vivo ERG Adapter	OcuScience	n/a	ex vivo ERG specimen holder
Threaded luer connector	McMaster-Carr	51525K222 or 51525K223	materials to prepare electrode