Оптимизация установки и условий для электроретинограммы Ex Vivo для изучения функции сетчатки в маленьких и больших глазах

Резюме

Модификация существующего многоэлектродного массива или патч-зажимного оборудования делает электроретинограмму ex vivo более доступной. Улучшенные методы регистрации и поддержания световых реакций ex vivo облегчают изучение функции фоторецепторов и ON-биполярных клеток в здоровой сетчатке, животных моделей глазных заболеваний и донорской сетчатки человека.

Аннотация

Измерения световых реакций нейронов сетчатки имеют решающее значение для исследования физиологии здоровой сетчатки, определения патологических изменений при заболеваниях сетчатки и тестирования терапевтических вмешательств. Электроретинограмма ex vivo (ERG) позволяет количественно оценить вклад отдельных типов клеток в изолированной сетчатке путем добавления специфических фармакологических агентов и оценки тканевых изменений независимо от системных воздействий. Световые реакции сетчатки могут быть измерены с помощью специализированного держателя образца ex vivo ERG и записывающей установки, модифицированной из существующего зажима патча или микроэлектродного массива. В частности, изучение ON-биполярных клеток, а также фоторецепторов было затруднено медленным, но прогрессирующим снижением световых реакций в EX VIVO ERG с течением времени. Повышенная скорость перфузии и регулировка температуры перфузата улучшают функцию сетчатки ex vivo и максимизируют амплитуду и стабильность отклика. Ex vivo ERG уникально позволяет изучать отдельные типы нейрональных клеток сетчатки. Кроме того, улучшения для максимизации амплитуд отклика и стабильности позволяют исследовать световые реакции в образцах сетчатки от крупных животных, а также в глазах доноров человека, что делает ex vivo ERG ценным дополнением к репертуару методов, используемых для исследования функции сетчатки.

Введение

Электроретинография измеряет функцию сетчатки в ответ на свет¹. Это неотъемлемая часть изучения физиологии и патофизиологии сетчатки, а также измерения успеха терапии заболеваний сетчатки. In vivo ERG широко используется для оценки функции сетчатки у интактных организмов, но имеет значительные ограничения ^2,3. Среди них количественный анализ отдельных типов клеток сетчатки в IN VIVO ERG затруднен, поскольку он регистрирует сумму потенциальных изменений и, следовательно, наложение ответов от всех клеток сетчатки к световым стимулам⁴. Кроме того, он не позволяет добавлять лекарства к сетчатке, уязвим к системным воздействиям и имеет относительно низкое отношение сигнал/шум. Эти недостатки устраняются в ex vivo ERG, который исследует функцию изолированной сетчатки 2,3,5,6. EX vivo ERG позволяет регистрировать большие и стабильные ответы от конкретных типов клеток сетчатки путем добавления фармакологических ингибиторов и легкой оценки терапевтических агентов, которые могут быть добавлены к суперфузату. В то же время он устраняет влияние системных эффектов и устраняет физиологический шум (например, сердцебиение или дыхание).

В EX VIVO ERG сетчатку или образцы сетчатки изолируют и устанавливают фоторецепторной стороной вверх на куполе держателя образца ^3,5. Держатель образца собирается, подключается к перфузионной системе, которая снабжает сетчатку нагретой, насыщенной кислородом средой, и помещается на сцену микроскопа, который был модифицирован для доставки управляемых компьютером световых стимулов. Для записи откликов, вызванных светом, держатель образца подключается к усилителю, дигитайзеру и системе записи (рисунок 1). Этот метод позволяет выделить ответы от палочковых и колбочек фоторецепторов, ON-биполярных клеток и глии Мюллера путем изменения параметров световых раздражителей и добавления фармакологических агентов.

Существующий зажим или многоэлектродный массив (MEA) может быть преобразован для записи ex vivo ERG либо в сочетании с коммерчески доступным адаптером ex vivo ERG, либо с пользовательским поликарбонатным держателем для образцов с числовым программным управлением (ЧПУ) для измерения световых реакций в сетчатке от моделей мелких животных, таких как мыши. Данная модификация повышает доступность ex vivo ERG при минимизации потребности в специализированном оборудовании. Конструкция держателя образца упрощает технику монтажа и интегрирует электроды, устраняя необходимость манипуляций с микроэлектродами по сравнению с ранее сообщенными трансретинальными методами ex vivo ERG⁷. Скорость перфузии и температура внутри держателя образца являются важными факторами, которые влияют на свойства ответа фоторецепторов и ON-биполярных клеток. Регулируя эти условия, EX VIVO ERG может быть надежно зарегистрирован из изолированной сетчатки мыши в течение длительных периодов времени. Оптимизированные экспериментальные условия позволяют записывать EX VIVO ERG в удары сетчатки от более крупных сетчаток, включая большие глаза животных и глаза донора человека⁸.

протокол

Все эксперименты с использованием мышей проводились в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Институциональным комитетом по изучению животных в Университете штата Юта. Глаза свиней для демонстрации этого видео были получены посмертно со скотобойни (Sustainable Swine Resources, Johnsonville). Глаза были получены от человеческих доноров после смерти мозга или сердца с согласия на исследовательское использование через Utah Lions Eye Bank, San Diego Eye Bank или Lifesharing, которые полностью аккредитованы FDA, Ассоциацией организаций по закупке органов (AOPO) и Ассоциацией глазных банков Америки. Использование человеческих донорских глаз имело статус освобожденного в Университете штата Юта (IRB No 00106658) и ScrippsHealth IRB (IRB No 16-6781).

1. Настройка ex vivo ERG

1. Для преобразования многоэлектродной установки матрицы подключите держатель образца ex vivo ERG через головной каскад к дифференциальному усилителю, который подключается к аналоговому входу интерфейсной платы системы многоэлектродных массивов. Используйте программное обеспечение для записи многоэлектродного массива для записи и хранения входных данных из ex vivo ERG. Установите коэффициент усиления дифференциального усилителя на 100 и добавьте дополнительное 10-кратное усиление напряжения в зависимости от спецификаций дигитайзера. Установите для фильтра нижних частот значение 100 Гц.
2. Чтобы преобразовать установку патч-зажима, подключите держатель образца ex vivo ERG через головной каскад к дифференциальному усилителю, который подключен к головной ступени усилителя патч-зажима. Используйте системное программное обеспечение и дигитайзер для записи и хранения входных данных из ex vivo ERG. Установите коэффициент усиления дифференциального усилителя на 100 и примените дополнительное 10-кратное усиление напряжения через каскад зажимной головки. Установите для фильтра нижних частот значение 100 Гц.
3. Подключите светодиоды с соответствующими длинами волн (например, приблизительно 530 нм, чтобы вызвать стержневой фоторецептор и ON-биполярные клеточные реакции) с микроскопом. Управляйте светодиодами с помощью записывающего программного обеспечения, которое позволяет запускать световые стимулы. Для управления световыми раздражителями используйте светодиодный драйвер, управляемый аналоговыми выходами дигитайзера.
4. Откалибруйте световой поток светодиодов в положении сетчатки в держателе образца с помощью фотодиода. При необходимости вставьте фильтры нейтральной плотности в световой контур, чтобы приглушить интенсивность света.
5. Используйте коммерчески доступный или изготовленный на заказ держатель образца ex vivo ERG.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чертежи для обработки с ЧПУ из поликарбоната можно получить у авторов по запросу.
6. Чтобы подготовить электрод, вставьте пеллетный электрод Ag/AgCl в резьбовой соединитель luer. Заполните внутреннюю часть разъема luer горячим клеем и вставьте гнездо 2 мм в горячий клей с нерезной стороны. Припаяйте серебряную проволоку электрода EP1 к разъему 2 мм. Вкрутите готовый электрод с уплотнительным кольцом на резьбе в электродные порты держателя образца ex vivo ERG.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Электроды можно использовать в течение длительного времени. Если поверхность гранул накапливает грязь и / или темнеет (это может вызвать высокое напряжение смещения и / или электрический дрейф), ее можно «отполировать» с помощью мелкой наждачной бумаги.
7. По крайней мере, за 1 день до начала экспериментов приклейте фильтровальную бумагу на купола держателя образца ex vivo ERG с помощью эпоксидного клея, гарантируя, что клей не загораживает канал электрода (см. видео см. ³ ).

2. Подготовка животных

1. Темные животные приспосабливаются в течение не менее 6 ч или на ночь.

3. Подготовка оборудования

1. Заполните перфузионную линию ex vivo ERG средой Эймса, наполненной 5% углекислого газа и 95% кислорода. Подключите перфузионную линию к нагревательному элементу с источником постоянного тока или регулятором тепла рядом с держателем образца, чтобы нагреть среду Эймса, чтобы сетчатка поддерживалась при температуре примерно 35-38 °C.
2. Заполните обе половины держателя образца ex vivo ERG раствором электрода, запечатайте перфузионную линию пробками luer, соедините электроды и соберите держатель образца четырьмя винтами (см. видео см. ³).
3. Проверьте сопротивление и смещение напряжения между электродами в собранном образце держателя, вставив датчики мультиметра в электроды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если нет засоров, а электроды находятся в хорошем состоянии, сопротивление должно быть ниже 100 кОм и напряжение смещения ниже 5 мВ.
4. Подключите собранный держатель образца к линии перфузии и поместите на сцену микроскопа, настроенного для доставки световых вспышек. Убедитесь, что держатель образца и перфузионная линия не содержат пузырьков воздуха.

4. Подготовка тканей

1. Принесите в жертву животное с CO₂ и немедленно энуклеируйте глаза, или получите крупные глаза животного или человека-донора.
2. Очистите земной шар от оставшейся соединительной ткани и экстраокулярных мышц. Обрежьте зрительный нерв.
3. На фильтровальную бумагу аккуратно поместите небольшой разрез лезвием бритвы вдоль ora serrata, примерно в 1 мм от лимбуса в глазу мыши. Вставьте тонкие ножницы vannas в разрез и вырежьте вдоль конечности, чтобы удалить переднюю часть глаза с помощью хрусталика.
4. Переместите чашку для глаз в блюдо, содержащее среду Эймса. Обхватите склеру тонкими щипцами, следя за тем, чтобы не коснуться сетчатки. Вставьте ножницы vannas между сетчаткой и склерой и отрежьте склеру от периферической к центральной части. Следите за тем, чтобы не коснуться и не повредить сетчатку.
5. Обездвижите склеру, удерживая одну сторону разреза ножницами vannas о дно тарелки для рассечения. Захватите склеру щипцами по другую сторону разреза. Удалите склеру, не касаясь и не повреждая сетчатку, раздвигая склеру по обе стороны разреза, чтобы обеспечить изоляцию сетчатки с минимальным повреждением ткани.
6. Удалите передний сегмент хрусталиком из другого глаза и храните глазную чашку при комнатной температуре в растворе Эймса, наполненном 5% углекислым газом и 95% кислородом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Функциональные световые реакции от глаз, хранящихся таким образом, могут быть получены в течение нескольких часов.
7. В больших глазах, включая глаза донора человека, очищают глобус от оставшейся соединительной ткани и удаляют передний сегмент и хрусталик, аналогично процедуре, описанной для глаза мыши. Используйте скальпель, чтобы сделать разрез примерно в 3 мм от лимбуса. Вставьте изогнутые ножницы для рассечения в разрез и разрезайте вдоль лимбуса, чтобы удалить переднюю часть глаза с помощью хрусталика. Получить образцы сетчатки для электроретинографии ex vivo с помощью одноразового биопсийного перфоратора 3-6 мм.

5. Крепление ткани на держатель образца

1. Поместите нижнюю половину держателя образца в большую чашку Петри и наполните насыщенной кислородом средой Эймса, чтобы купол держателя образца был просто погружен.
2. Осторожно захватите край сетчатки тонкими щипцами и перенесите сетчатку на купол держателя образца ex vivo , стороной фоторецептора лицом вверх.
3. Поднимите держатель образца из раствора Эймса, заботясь о том, чтобы сетчатка оставалась на месте.
4. Полностью высушите пластину держателя образца, чтобы свести к минимуму шум, электрические перекрестные помехи и маневрирование сигнала.
5. Соберите обе половины держателя образца четырьмя винтами и соедините перфузионную линию. Высушите электрод в нижней половине держателя образца и подключите анодный кабель к внутренней стороне сетчатки, а катодный кабель со стороны фоторецептора.
6. Наполните держатель образца не менее чем 1 мл/мин насыщенной кислородом среды Эймса в течение 10-20 мин, чтобы дать время для стабилизации световых реакций.

6. Запись функции нейрональных клеток сетчатки

1. Записывайте семейства реакций, подвергая сетчатку световым вспышкам возрастающей интенсивности. Например, регистрируются семейства реакций фоторецепторов мышиных стержней с интенсивностью света в диапазоне от примерно 10 до 1000 фотонов/^мкм2 и из ОН-биполярных клеток мыши с интенсивностью света в диапазоне примерно от 0,6 до 20 фотонов / мкм².
2. Измерение световых откликов фоторецепторов (a-волна) в присутствии 100 мкМ хлорида бария, который блокирует калиевые каналы в глиальных клетках Мюллера, и 40 мкМ DL-AP4, который блокирует передачу глутаматергического сигнала в ON-биполярные клетки (рисунок 2B).
3. Чтобы выделить b-волну, которая возникает из функции ON-биполярных клеток, сначала зафиксируйте комбинированные световые реакции как от фоторецепторных, так и от ON-биполярных клеток в присутствии только хлорида бария (рисунок 2A). Затем перфьюируйте в течение 5-10 мин средой Эймса, содержащей хлорид бария, а также DL-AP4, и записывайте реакции фоторецепторов на те же световые стимулы, что и раньше (рисунок 2B). Вычтите реакции фоторецепторов из комбинированных реакций фоторецепторных и ON-биполярных клеток, таким образом вычисляя только световые реакции ON-биполярных клеток (рисунок 2C).

7. Оптимизация on-биполярной функции клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: B-волна, которая исходит от ON-биполярных клеток, очень чувствительна к температуре в держателе образца и скорости перфузии.

1. Поддерживайте скорость перфузии не менее 0,5 мл/мин для получения b-волны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокая скорость перфузии 1-2 мл/мин предпочтительна для поддержания большого и стабильного ответа от ON-биполярных клеток.
2. Убедитесь, что для данной скорости перфузии температура в держателе образца вблизи сетчатки близка к температуре тела (т.е. приблизительно 35-38 °C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отрегулировать температуру перфусата, который нагревается до того, как он достигнет держателя образца ex vivo ERG, чтобы он находился в оптимальном температурном диапазоне на сетчатке.
3. Храните глазные чашки для последующих экспериментов, защищенные от света и в насыщенной кислородом среде Эймса при комнатной температуре, чтобы поддерживать нормальные a- и b-волны в течение нескольких часов.

Результаты

Ex vivo ERG позволяет регистрировать воспроизводимые и стабильные световые реакции фоторецепторов и ON-биполярных клеток, например, от сетчатки мыши (рисунок 2A-C). Регистрация реакций фоторецепторов от донорской сетчатки человека возможна при посмерт?...

Обсуждение

Первоначально разработанный в 1865 году Холмгреном для измерения световых реакций сетчатки от амфибии^{сетчатки 10}, технические ограничения первоначально препятствовали широкому использованию ERG. Тем не менее, основополагающие исследования Рагнара Гранита и других выявили ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mm socket	WPI	2026-10	materials to prepare electrode
Ag/AgCl Electrode	World Precision Instruments	EP1	materials to prepare electrode
Ames' medium	Sigma Aldrich	A1420	perfusion media
barium chloride	Sigma Aldrich	B0750	potassium channel blocker
DL-AP4	Tocris	0101	broad spectrum glutamatergic antagonist
OcuScience Ex Vivo ERG Adapter	OcuScience	n/a	ex vivo ERG specimen holder
Threaded luer connector	McMaster-Carr	51525K222 or 51525K223	materials to prepare electrode