אופטימיזציה של ההגדרה והתנאים עבור אלקטרורטינוגרמה של Ex Vivo כדי לחקור את תפקוד הרשתית בעיניים קטנות וגדולות

Summary

שינוי של מערך multielectrode קיים או ציוד מהדק תיקון עושה את ex vivo electroretinogram נגיש יותר. שיטות משופרות לתיעוד ושמירה על תגובות אור ex vivo מקלות על חקר תפקוד התאים הפוטורצפטורים וה-ON-דו-קוטביים ברשתית הבריאה, מודלים של בעלי חיים של מחלות עיניים ורשתיות של תורמים אנושיים.

Abstract

מדידות של תגובות אור עצביות ברשתית הן קריטיות לחקר הפיזיולוגיה של הרשתית הבריאה, לקביעת שינויים פתולוגיים במחלות רשתית ולבדיקת התערבויות טיפוליות. האלקטרורטינוגרמה ex vivo (ERG) מאפשרת כימות של תרומות מסוגי תאים בודדים ברשתית המבודדת על ידי הוספת חומרים פרמקולוגיים ספציפיים והערכה של שינויים פנימיים ברקמה ללא תלות בהשפעות מערכתיות. ניתן למדוד את תגובות אור הרשתית באמצעות מחזיק דגימת ex vivo ERG מיוחד ומערך הקלטה, ששונה מציוד קיים של מהדק טלאי או מערך מיקרואלקטרודה. במיוחד, המחקר של תאים דו-קוטביים על-קוטביים, אך גם של פוטורצפטורים, נפגע על ידי הירידה האיטית אך המתקדמת של תגובות האור ב-ex vivo ERG לאורך זמן. מהירות זלוף מוגברת והתאמת טמפרטורת ההפרשה משפרים את תפקוד הרשתית ex vivo וממקסמים את משרעת התגובה והיציבות. ה- ex vivo ERG מאפשר באופן ייחודי לחקור סוגי תאים עצביים ברשתית בודדים. בנוסף, שיפורים למקסום אמפליטודות התגובה והיציבות מאפשרים לחקור תגובות אור בדגימות רשתית מבעלי חיים גדולים, כמו גם מעיני תורמים אנושיים, מה שהופך את ה- ex vivo ERG לתוספת רבת ערך לרפרטואר הטכניקות המשמשות לחקר תפקוד הרשתית.

Introduction

אלקטרורטינוגרפיה מודדת את תפקוד הרשתית בתגובה לאור¹. הוא חלק בלתי נפרד מלימוד הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של הרשתית, ומדידת ההצלחה של טיפולים במחלות רשתית. ה- in vivo ERG נמצא בשימוש נרחב להערכת תפקוד הרשתית באורגניזמים שלמים, אך יש לו מגבלות משמעותיות ^2,3. בין אלה, הניתוח הכמותי של סוגי תאי רשתית בודדים ב- in vivo ERG נפגע, שכן הוא רושם את סכום השינויים הפוטנציאליים, ולכן תגובות כיסוי, מכל תאי הרשתית לגירויים קלים⁴. יתר על כן, הוא אינו מאפשר בקלות תוספת של תרופות לרשתית, הוא פגיע להשפעות סיסטמיות, ויש לו יחס אות לרעש נמוך יחסית. חסרונות אלה מתבטלים ב- ex vivo ERG החוקר את תפקוד הרשתית המבודדת 2,3,5,6. ה- ex vivo ERG מאפשר הקלטה של תגובות גדולות ויציבות מסוגי תאי רשתית ספציפיים על ידי הוספת מעכבים פרמקולוגיים והערכה קלה של חומרים טיפוליים, אשר ניתן להוסיף לסופרפוזט. יחד עם זאת, הוא מסיר השפעות של השפעות מערכתיות ומבטל רעש פיזיולוגי (למשל, פעימות לב או נשימה).

ב- ex vivo ERG, רשתיות או דגימות רשתית מבודדות ומותקנות בצד הפוטורצפטור למעלה על הכיפה של מחזיק הדגימה ^3,5. מחזיק הדגימה מורכב, מחובר למערכת זלוף המספקת לרשתית מדיה מחוממת ומחומצנת, ומונח על במת מיקרוסקופ, אשר שונה כדי לספק גירויי אור מבוקרי מחשב. כדי לתעד את התגובות שמעוררות האור, מחזיק הדגימה מחובר למגבר, לדיגיטייזר ולמערכת הקלטה (איור 1). טכניקה זו מאפשרת בידוד של תגובות מפוטורצפטורים של מוטות וחרוטים, תאי ON-bipolar ו-Müller glia על ידי שינוי הפרמטרים של גירויי האור והוספת חומרים פרמקולוגיים.

ניתן להמיר מהדק תיקון קיים או מערך רב-אלקטרודות (MEA) להקלטת ex vivo ERG, בשילוב עם מתאם ex vivo ERG זמין מסחרית או מחזיק דגימה מותאם אישית במכונה של מחשב פוליקרבונט (CNC), כדי למדוד את תגובות האור ברשתיות ממודלים של בעלי חיים קטנים, כגון עכברים. שינוי זה מגדיל את הנגישות של ex vivo ERG תוך מזעור הצורך בציוד מיוחד. העיצוב של מחזיק הדגימה מפשט את טכניקת ההרכבה ומשלב אלקטרודות, ומבטל את הצורך במניפולציה של מיקרואלקטרודות בהשוואה^{לשיטות ex} vivo ERG שדווחו בעבר 7. קצב הזלוף והטמפרטורה בתוך בעל הדגימה הם גורמים חשובים המשפיעים על תכונות התגובה של פוטורצפטורים ותאי ON-bipolar. על ידי התאמת תנאים אלה, ניתן להקליט את ה- ex vivo ERG באופן אמין מרשתית העכבר המבודדת לאורך פרקי זמן ממושכים. תנאי ניסוי ממוטבים מאפשרים הקלטות ex vivo ERG באגרופים ברשתית מרשתיות גדולות יותר, כולל עיניים גדולות של בעלי חיים ועיניים של תורמים אנושיים⁸.

Protocol

כל הניסויים בעכברים נערכו בהתאם למדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית למחקרים בבעלי חיים באוניברסיטת יוטה. עיני חזיר להדגמת הסרטון הזה הושגו לאחר המוות מבית המטבחיים (משאבי חזירים בני קיימא, ג'ונסוןוויל). העיניים התקבלו מתורמים אנושיים לאחר מוות מוחי או לבבי בהסכמה לשימוש מחקרי באמצעות בנק העיניים של יוטה ליונס, בנק העיניים של סן דייגו או Lifesharing, אשר הוסמכו באופן מלא על ידי ה- FDA, איגוד ארגוני רכש האיברים (AOPO) ואיגוד בנקי העיניים של אמריקה. לשימוש בעיניים של תורמים אנושיים היה מעמד פטור באוניברסיטת יוטה (IRB מס' 00106658) וב-ScrippsHealth IRB (IRB מס' 16-6781).

1. הגדרת ה- ex vivo ERG

1. כדי להמיר מערך רב-אלקטרודות, חבר את מחזיק הדגימה ex vivo ERG באמצעות שלב ראש למגבר דיפרנציאלי, המחובר לכניסה האנלוגית של לוח הממשק של מערכת מערך הרב-אלקטרודות. השתמש בתוכנת ההקלטה עבור מערך multielectrode כדי להקליט ולאחסן את נתוני הקלט מ- ex vivo ERG. הגדר את הרווח של מגבר הדיפרנציאל ל-100 והוסף הגברה נוספת של 10x מתח בהתאם למפרט הדיגיטייזר. הגדר את מסנן המעבר הנמוך ל- 100 הרץ.
2. כדי להמיר מערך מהדק טלאי, חבר את מחזיק הדגימה ex vivo ERG באמצעות שלב ראש למגבר דיפרנציאלי, המחובר לשלב הראש של מגבר מהדק התיקון. השתמש בתוכנת מערכת מהדק התיקון וב- digitizer כדי להקליט ולאחסן את נתוני הקלט מ- ex vivo ERG. הגדר את הרווח של מגבר הדיפרנציאל ל-100 והפעל הגברה נוספת של 10x מתח באמצעות שלב ראש מהדק התיקון. הגדר את מסנן המעבר הנמוך ל- 100 הרץ.
3. חבר נורות LED עם אורכי הגל המתאימים (למשל, כ-530 ננומטר כדי לעורר תגובות של תאי מוט פוטורצפטור ותאי ON-bipolar) למיקרוסקופ. שלוט בנורות ה- LED באמצעות תוכנת הקלטה המאפשרת הפעלה של גירויים קלים. כדי לשלוט בגירויים של אור, השתמש בדרייבר LED הנשלט על-ידי יציאות אנלוגיות מדיגיטייזר.
4. כייל את תפוקת האור של נוריות ה-LED במיקום הרשתית במחזיק הדגימה באמצעות פוטודיודה. במידת הצורך, הכנס מסנני צפיפות ניטרליים לנתיב האור כדי לעמעם את עוצמת האור.
5. השתמש במחזיק דגימת ex vivo ERG זמין מסחרית או מותאם אישית.
   הערה: שרטוטים לעיבוד CNC מפוליקרבונט ניתן לקבל מהמחברים על פי בקשה.
6. כדי להכין את האלקטרודה, הכנס אלקטרודת גלולת Ag/AgCl למחבר לואר מושחל. מלא את החלק הפנימי של מחבר הלואר בדבק חם והכנס שקע של 2 מ"מ לתוך הדבק החם מהצד שאינו מושחל. הלחמה חוט כסף של אלקטרודת EP1 לשקע 2 מ"מ. הברג את האלקטרודה המוגמרת, עם טבעת o על החוט, לתוך יציאות האלקטרודה של מחזיק הדגימה ex vivo ERG.
   הערה: ניתן להשתמש באלקטרודות במשך זמן רב. אם משטח הכדור צובר לכלוך ו/או מחשיך (הדבר עלול לגרום למתח היסט גבוה ו/או לסחיפה חשמלית), ניתן "ללטש" אותו באמצעות נייר זכוכית עדין.
7. לפחות יום אחד לפני הניסוי, הדבק ניירות סינון על הכיפות של מחזיק הדגימה ex vivo ERG באמצעות דבק אפוקסי, כדי להבטיח שהדבק לא יחסם את תעלת האלקטרודה (ראה ³ לווידאו).

2. הכנת בעלי חיים

1. חשוכים מסתגלים לבעלי חיים למשך 6 שעות לפחות או למשך הלילה.

3. הכנת ציוד

1. מלאו את קו ההזלפה של ה-ex vivo ERG במדיום של איימס עם 5% פחמן דו חמצני ו-95% חמצן. חבר את קו הזלוף לגוף חימום עם מקור זרם DC או בקר חום ליד מחזיק הדגימה כדי לחמם את המדיום של איימס, כך שהרשתית נשמרת בערך 35-38 מעלות צלזיוס.
2. מלא את שני החצאים של מחזיק הדגימה ex vivo ERG בתמיסת אלקטרודות, אטם את קו ההזלפה עם פקקי luer, חבר את האלקטרודות והרכיב את מחזיק הדגימה עם ארבעה ברגים (ראה ³ לווידאו).
3. בדוק את מתח ההתנגדות וההיסט בין האלקטרודות במחזיק הדגימה המורכב על ידי הכנסת הגששים של המולטימטר לאלקטרודות.
   הערה: אם אין חסימות, והאלקטרודות במצב טוב, ההתנגדות צריכה להיות מתחת ל-100 kΩ ומתח הקיזוז מתחת ל-5 mV.
4. חברו את מחזיק הדגימה המורכב לקו הזלוף והניחו על הבמה של מיקרוסקופ שהוקם כדי לספק הבזקי אור. ודא כי מחזיק הדגימה וקו הזלוף אינם מכילים בועות אוויר.

4. הכנת רקמות

1. להקריב את החיה עם CO₂ ומיד לעטוף את העיניים, או להשיג עיניים גדולות של בעל חיים או אדם תורם.
2. נקו את הגלובוס של רקמת החיבור הנותרת והשרירים החוץ-עיניים. לחתוך את עצב הראייה.
3. על נייר סינון, בזהירות למקם חתך קטן עם סכין גילוח לאורך אורה serrata, כ 1 מ"מ מן הלימבוס בעין העכבר. מכניסים מספריים עדינים של ואנה לתוך החתך וחותכים לאורך הלימבוס כדי להסיר את החלק הקדמי של העין עם העדשה.
4. העבירו את העיניים לצלחת המכילה את המדיום של איימס. תפסו את הסקלרה עם מלקחיים עדינים, תוך הקפדה שלא לגעת ברשתית. מכניסים מספריים של ואנה בין הרשתית לסקלרה וחותכים את הסקלרה מהחלק ההיקפי לכיוון החלק המרכזי. יש להיזהר שלא לגעת או לפגוע ברשתית.
5. לשתק את הסקלרה על ידי החזקת צד אחד של החתך עם מספריים vannas על החלק התחתון של צלחת דיסקציה. תפסו את הסקלרה עם מלקחיים בצד השני של החתך. הסר את הסקלרה מבלי לגעת או לפגוע ברשתית על ידי פירוק הסקלרה משני צדי החתך כדי לאפשר בידוד של הרשתית עם נזק מינימלי לרקמה.
6. הסר את המקטע הקדמי עם העדשה מהעין העמיתה ואחסן את העין בטמפרטורת החדר בתמיסה של איימס המבעבעת ב-5% פחמן דו חמצני ו-95% חמצן.
   הערה: ניתן לקבל תגובות אור פונקציונליות מעיניים המאוחסנות בדרך זו במשך מספר שעות.
7. בעיניים גדולות, כולל עיני תורם אנושיות, נקו את הגלובוס של רקמת החיבור שנותרה והסירו את המקטע הקדמי ואת העדשה, בדומה להליך המתואר לעין העכבר. השתמש באזמל כדי לבצע חתך כ 3 מ"מ מן הלימבוס. הכנס מספריים דיסקציה מעוקלים לתוך החתך לחתוך לאורך הלימבוס כדי להסיר את החלק הקדמי של העין עם העדשה. השג דגימות רשתית עבור אלקטרורטינוגרפיה ex vivo עם אגרוף ביופסיה חד פעמית 3-6 מ"מ.

5. הרכבת הרקמה על מחזיק הדגימה

1. הכניסו את החצי התחתון של מחזיק הדגימה לתוך צלחת פטרי גדולה ומלאו במדיום של איימס מחומצן, כך שהכיפה של מחזיק הדגימה פשוט שקועה.
2. תופסים בזהירות את קצה הרשתית עם מלקחיים עדינים ומעבירים את הרשתית על הכיפה של מחזיק הדגימה ex vivo , צד הפוטורצפטור פונה כלפי מעלה.
3. הרם את מחזיק הדגימה מהפתרון של איימס, ודאג שהרשתית תישאר במקומה.
4. ייבש לחלוטין את הצלחת של מחזיק הדגימה כדי למזער רעשים, crosstalk חשמלי, ו shunting אותות.
5. הרכיבו את שני חצאי מחזיק הדגימה עם ארבעה ברגים וחברו את קו הזליפה. יבשו את האלקטרודה בחצי התחתון של מחזיק הדגימה וחברו את כבל האנודה לצד הרשתית הפנימית ואת כבל הקתודה לצד הפוטורצפטור.
6. יש למזג את מחזיק הדגימה עם לפחות 1 מ"ל/דקה של מדיום איימס מחומצן למשך 10-20 דקות כדי לאפשר זמן לתגובות האור להתייצב.

6. רישום תפקוד תאי עצב ברשתית

1. תעדו משפחות תגובה על ידי חשיפת הרשתית להבזקי אור בעוצמה הולכת וגוברת. לדוגמה, לתעד משפחות תגובות של מוטות עכבר עם עוצמות אור הנעות בין כ-10 ל-1,000 פוטונים/מיקרומטר 2 ומשפחות מתאי ON-bipolar של עכברים עם עוצמות אור הנעות בין כ-0.6 ל-20 פוטונים/מיקרומטר².
2. מדוד תגובות אור פוטורצפטור (a-wave) בנוכחות בריום כלוריד של 100 μM, שחוסם תעלות אשלגן בתאי גליה של מולר, ו-40 μM DL-AP4, שחוסם העברת אותות גלוטמטרגיים לתאי ON-דו-קוטביים (איור 2B).
3. כדי לבודד את גל ה-b, שמקורו בתפקוד של תאי ON-דו-קוטביים, תחילה תיעדו תגובות אור משולבות הן מתאי פוטורצפטור והן מתאי ON-דו-קוטביים בנוכחות בריום כלוריד בלבד (איור 2A). לאחר מכן, יש לחדור במשך 5-10 דקות עם המדיום של איימס המכיל בריום כלוריד, כמו גם DL-AP4, ולהקליט תגובות פוטורצפטור לאותם גירויי אור כמו קודם (איור 2B). הפחת תגובות פוטורצפטור מתגובות משולבות של תאים פוטורצפטורים ותאי ON-דו-קוטביים, ובכך חישב את תגובות האור של תאי ON-דו-קוטביות בלבד (איור 2C).

7. אופטימיזציה של תפקוד התא הדו-קוטבי

הערה: גל b, שמקורו בתאים הדו-קוטביים ON, רגיש מאוד לטמפרטורה במחזיק הדגימה ולקצב הזליפה.

1. שמרו על קצב זלוף של לפחות 0.5 מ"ל/דקה כדי לקבל את גל ה-b.
   הערה: קצב זלוף גבוה יותר של 1-2 מ"ל/דקה עדיף כדי לשמור על תגובה גדולה ויציבה של תאים דו-קוטביים ON.
2. ודא כי עבור קצב זלוף נתון, הטמפרטורה במחזיק הדגימה ליד הרשתית קרובה לטמפרטורת הגוף (כלומר, בערך 35-38 מעלות צלזיוס).
   הערה: חשוב להתאים את הטמפרטורה של הבשתן, המחומם לפני שהוא מגיע למחזיק דגימת ex vivo ERG, כך שהוא נמצא בטווח הטמפרטורות האופטימלי ברשתית.
3. יש לאחסן את כוסות העיניים לניסויים מאוחרים יותר מוגנות מפני אור ובמדיום מחומצן של איימס בטמפרטורת החדר כדי לשמור על גלי A ו-B תקינים למשך מספר שעות.

תוצאות

אקס ויוו ERG מאפשר הקלטה של תגובות אור פוטורצפטור ותאים דו-קוטביים הניתנים לשחזור ויציבות, לדוגמה, מרשתית העכבר (איור 2A-C). הקלטה של תגובות פוטורצפטור מרשתיות של תורמים אנושיים אפשרית עם עיכוב של עד 5 שעות לאחר המוות של אנוקלציה (איור 2D) ?...

Discussion

הוא פותח במקור בשנת 1865 על ידי הולמגרן כדי למדוד את תגובות האור ברשתית מהרשתית^{הדו-חיים 10}, אך אילוצים טכניים מנעו בתחילה שימוש נרחב ב-ERG. אף על פי כן, מחקרים ראשוניים של Ragnar Granit ואחרים זיהו את המקורות התאיים של ה-ERG ומדדו תגובות של תאים פוטורצפטורים ותאי ON-bipolar ex^{vivo 11,12...}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mm socket	WPI	2026-10	materials to prepare electrode
Ag/AgCl Electrode	World Precision Instruments	EP1	materials to prepare electrode
Ames' medium	Sigma Aldrich	A1420	perfusion media
barium chloride	Sigma Aldrich	B0750	potassium channel blocker
DL-AP4	Tocris	0101	broad spectrum glutamatergic antagonist
OcuScience Ex Vivo ERG Adapter	OcuScience	n/a	ex vivo ERG specimen holder
Threaded luer connector	McMaster-Carr	51525K222 or 51525K223	materials to prepare electrode