JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توفر هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لإعداد شبكات العينات عند درجات حرارة تصل إلى 70 درجة مئوية، قبل التجمد الغاطس لتجارب التبريد الكهرومغناطيسي.

Abstract

عادة ما يتم إعداد شبكات العينات لتجارب المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) عند درجة حرارة مثالية لتخزين العينات البيولوجية ، معظمها عند 4 درجات مئوية وأحيانا في درجة حرارة الغرفة. في الآونة الأخيرة ، اكتشفنا أن بنية البروتين التي تم حلها في درجة حرارة منخفضة قد لا تكون ذات صلة وظيفية ، خاصة بالنسبة للبروتينات من العتائق المحبة للحرارة. تم تطوير إجراء لإعداد عينات البروتين في درجات حرارة أعلى (تصل إلى 70 درجة مئوية) لتحليل cryo-EM. أظهرنا أن الهياكل من العينات المعدة في درجات حرارة أعلى ذات صلة وظيفية وتعتمد على درجة الحرارة. هنا نصف بروتوكولا مفصلا لإعداد شبكات العينات عند درجة حرارة عالية ، باستخدام 55 درجة مئوية كمثال. استخدمت التجربة جهاز تزجيج تم تعديله باستخدام أنبوب طرد مركزي إضافي ، وتم تحضين العينات عند 55 درجة مئوية. تم ضبط الإجراءات التفصيلية بدقة لتقليل تكثيف البخار والحصول على طبقة رقيقة من الجليد على الشبكة. يتم تقديم أمثلة على التجارب الناجحة وغير الناجحة.

Introduction

استمرت تقنية cryo-EM لحل هياكل مجمعات البروتين في التحسن ، خاصة في اتجاه الحصول على هياكل عالية الدقة 1,2. في غضون ذلك ، تم توسيع نطاق تطبيقه أيضا عن طريق تغيير ظروف العينة مثل الرقم الهيدروجيني أو الليكاندات قبل عملية التزجيج3 ، والتي تنطوي على إعداد شبكات العينات تليها تجميد الغطس 4,5. شرط آخر مهم هو درجة الحرارة. على الرغم من أن تجارب cryo-EM ، مثل علم البلورات بالأشعة السينية ، يتم إجراؤها في درجات حرارة منخفضة ، إلا أن البنية التي تم حلها بواسطة cryo-EM تعكس البنية في حالة الحل قبل التزجيج. حتى وقت قريب، تستخدم غالبية دراسات تحليل الجسيمات المفردة (SPA) cryo-EM عينات يتم الاحتفاظ بها على الجليد (أي عند 4 درجات مئوية) قبل التزجيج6، على الرغم من أن عددا من الدراسات تستخدم عينات عند درجة حرارة الغرفة حوالي7،8،9،10 أو تصل إلى 42 درجة مئوية 11. في تقرير حديث ، أجرينا دراسات تعتمد على درجة الحرارة لإنزيم اختزال حمض الكيتول (KARI) من الأركايون المحب للحرارة Sulfolobus solfataricus (Sso) في ست درجات حرارة مختلفة من 4 درجات مئوية إلى 70 درجة مئوية12. تشير دراساتنا إلى أنه من المهم إعداد شبكات العينات في درجات حرارة ذات صلة وظيفيا وأن cryo-EM هي الطريقة الهيكلية الوحيدة الممكنة عمليا لحل بنية نفس مركب البروتين في درجات حرارة متعددة.

تتمثل الصعوبة الرئيسية للتزجيج في درجات الحرارة العالية في تقليل تكثيف البخار وتحقيق جليد رقيق. هنا نبلغ عن البروتوكول التفصيلي المستخدم لإعداد شبكات العينات في درجات حرارة عالية في دراستنا السابقة ل Sso-KARI 12. نفترض أن القراء أو المشاهدين لديهم خبرة بالفعل في إجراءات إعداد العينات ومعالجة البيانات الشاملة لتجارب cryo-EM ونؤكد على الجوانب ذات الصلة بارتفاع درجة الحرارة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: يهدف هذا البروتوكول إلى استخدام جهاز تزجيج تجاري معدل لإعداد عينات المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) في درجات حرارة محددة، وخاصة أعلى من 37 درجة مئوية. يظهر الإعداد التجريبي العام في الشكل 1. يستخدم البروتوكول 55 درجة مئوية كمثال. للاطلاع على الظروف المحددة في درجات الحرارة الأخرى، يرجى الرجوع إلى الجدول التكميلي 2 في المرجع12.

1. إعداد جهاز التزجيج

  1. قم بعمل ثقب 1 سم في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل في نهايته المغلقة.
  2. ضع الأنبوب في غرفة جهاز التزجيج عند مخرج المياه بالموجات فوق الصوتية ، كما هو موضح في الشكل 2.
    ملاحظة: الغرض من ذلك هو تقليل تكثيف الماء عن طريق توجيه بخار الماء إلى المبادل الحراري عبر الأنبوب قبل الوصول إلى الغرفة بأكملها.
  3. قم بإعداد درجة حرارة جهاز التزجيج إلى درجة الحرارة المحددة (على سبيل المثال ، 55 درجة مئوية ، كما هو موضح في الشكل 3) ، واسمح لغرفة جهاز التزجيج بالوصول إلى 55 درجة مئوية ورطوبة نسبية 100٪. دعها تقف لمدة نصف ساعة على الأقل لتحقيق الاستقرار في الظروف قبل بدء التجربة.

2. تسخين العينة والأدوات

  1. ضع الحمام المائي على صفيحة موقد واضبط الموقد على درجة الحرارة المطلوبة (هنا 55 درجة مئوية). تحقق من ذلك باستخدام ميزان حرارة للتأكد من أن الماء يصل إلى 55 درجة مئوية.
  2. احتضن العينة في الحمام المائي وقم بتسخين طرف الماصة مسبقا على حافة السخان لمدة 2 دقيقة أو أكثر قبل تجربة النشاف.
    ملاحظة: أعلى إعداد لدرجة الحرارة لغرفة جهاز التزجيج هو 60 درجة مئوية. لإعداد شبكات درجة حرارة أعلى لتجربة cyro-EM (على سبيل المثال ، 70 درجة مئوية) ، يتم تحضين العينة في الحمام المائي عند 80 درجة مئوية ، ويقدر المتوسط بين درجة حرارة العينة ودرجة حرارة جهاز التزجيج بأنه درجة الحرارة الفعلية للعينة على الشبكة (70 درجة مئوية في هذه الحالة). انظر قسم المناقشة للحصول على مزيد من التفاصيل والقيود على هذا التقدير.

3. التحضير لتجربة النشاف

  1. قم بتفريغ شبكة مدعومة بالكربون عند 25 مللي أمبير لمدة 30 ثانية ، أو بديل للقيم اعتمادا على الجهاز المستخدم.
  2. احتضان الملقط مع الشبكة في جهاز التزجيج لمدة 2 دقيقة أو أكثر.
  3. املأ حاوية الإيثان بالإيثان وفقا للإجراءات القياسية. لا تدع الإيثان يفيض.
    ملاحظة: تستغرق هذه الخطوة حوالي 10 دقائق ويجب اتباعها على الفور مع تجربة النشاف لتجنب التجميد.
  4. ضع ورقة تصفية التزجيج في غرفة جهاز التزجيج في موعد لا يتجاوز 5 دقائق قبل تجربة النشاف.
    ملاحظة: سيؤدي وضع ورقة الترشيح في الغرفة في وقت مبكر جدا إلى أن تصبح رطبة جدا.

4. تجربة اللطخة

ملاحظة: عند الإمساك بالشبكة ، تأكد من أن الشبكة مستقرة وأن هناك الحد الأدنى من منطقة التلامس مع الملقط (الشكل 4). يتم ذلك للحفاظ على أفضل كفاءة تبريد للإيثان وتجنب الجليد غير الزجاجي.

  1. استخدم طرف ماصة لتطبيق 7-9 ميكرولتر من العينة على الشبكة. ثم انتظر 1-2 ثانية ، ولطخ لمدة 1-1.5 ثانية ، وسرعان ما تغرق العينة في الإيثان السائل.
  2. انقل الشبكة من الإيثان السائل إلى صندوق التبريد ، الذي يتم تخزينه في النيتروجين السائل.
    ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة بعناية فائقة لأن الملقط لا يزال ساخنا ، وبالتالي فإن خزان التبريد بأكمله مليء بالبخار في هذا الوقت.

5. فحص الجودة للشبكات

  1. قم بقص الشبكات وتحميلها على أداة cryo-EM.
  2. استخدم شاشة العرض الخاصة بجهاز cryo-EM ووظيفة الجرعة المنخفضة للبرنامج لفحص حالة الجليد على الشبكة وتوزيع العينة على الشبكة.
    ملاحظة: في كثير من الأحيان ، تكون الشبكات جافة جدا ، أو تكون طبقة الجليد سميكة جدا. معدل نجاح الشبكات المعدة في درجات حرارة عالية أقل بكثير من ذلك في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية. يتم عرض النتائج التمثيلية للشبكات الجيدة والشبكات غير المرضية في القسم التالي.
  3. إذا لم تكن جودة الشبكة الناتجة جيدة ، فكرر عملية إعداد الشبكة بظروف متنوعة (مثل وقت الانتظار ، وقت النشاف ، إلخ). إذا كانت جودة الشبكة الناتجة جيدة ، فكرر نفس الخطوات لإنشاء شبكات عند درجة حرارة مختلفة.

6. جمع البيانات

  1. انقل الشبكات ذات النوعية الجيدة إلى أداة cryo-EM عالية الدقة.
  2. إجراء جمع البيانات وتحليلها وفقا للإجراءات المعمول بها.
    ملاحظة: كما هو موضح في منشورنا السابق ، لا تتأثر دقة الهيكل بدرجة الحرارة المرتفعة12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يتم عرض نظرة عامة على التكبير المنخفض في الشكل 5A و B. اللوحة A هي مثال على شبكة ناجحة. هناك تدرج جليدي من أعلى اليسار (أكثر سمكا) إلى أسفل اليمين (أرق أو فارغ). تسهل هذه الشبكة العثور على سمك مناسب لطبقة الجليد في المنطقة الوسطى مناسب لجمع البيانات ، مثل المربعات الزرق?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في الخطوة 1 من البروتوكول ، تأكد من تثبيت أنبوب جهاز الطرد المركزي بشكل جيد ولا يسقط عندما تكون التجربة قيد التقدم. نظرا لتراكم عدد كبير من قطرات الماء في الغرفة ، مما قد يغير قدرة الامتزاز لورق الترشيح ، يوصى بعدم تجاوز الوقت الإجمالي للتجربة 30 دقيقة بعد وصول غرفة جهاز التزجيج إلى درجة حرا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون الدكتور هيرفي ريميجي من Thermo Fisher Scientific على المشورة المفيدة. تم إجراء تجارب cryo-EM في منشأة Academia Sinica Cryo-EM (ASCEM). يتم دعم ASCEM من قبل Academia Sinica (رقم المنحة. AS-CFII-108-110) ومشروع تايوان للبروتين (رقم المنحة. AS-KPQ-109-TPP2). كما يشكر المؤلفون السيدة هوي - جو هوانغ على المساعدة التي قدمتها في إعداد العينة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Falcon tubeFalcon352070size: 50 mL
Filter paperTed Pella47000-100Ø55/20mm, Grade 595
HI1210Leicawater bath
K100XElectron Microscopy Sciencesglow discharge
Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu gridTed Pella658-200-CU-100
Titan Krios G3Thermo Fisher Scientific1063996low dose imaging
Vitrobot Mark IVThermo Fisher Scientific1086439
Vitrobot TweezerTed Pella47000-500

References

  1. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
  2. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
  3. Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
  4. Cabra, V., Samsó, M. Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311(2015).
  5. Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
  6. Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
  7. Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
  8. Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
  9. Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
  10. Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
  11. Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
  12. Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

173

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved