הכנת רשתות דגימה בטמפרטורה גבוהה עבור Cryo-EM

Summary

מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט להכנת רשתות דגימה בטמפרטורות של עד 70 מעלות צלזיוס, לפני שקיפאון הצניחה לניסויי cryo-EM.

Abstract

רשתות הדגימות לניסויים במיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים (cryo-EM) מוכנות בדרך כלל בטמפרטורה אופטימלית לאחסון דגימות ביולוגיות, לרוב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולעיתים בטמפרטורת החדר. לאחרונה גילינו שמבנה החלבון שנפתר בטמפרטורה נמוכה עשוי שלא להיות רלוונטי מבחינה תפקודית, במיוחד עבור חלבונים מארכאה תרמופילית. פותח הליך להכנת דגימות חלבון בטמפרטורות גבוהות יותר (עד 70 מעלות צלזיוס) לניתוח cryo-EM. הראינו שהמבנים מדגימות שהוכנו בטמפרטורות גבוהות יותר רלוונטיים מבחינה פונקציונלית ותלויים בטמפרטורה. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט להכנת רשתות מדגם בטמפרטורה גבוהה, תוך שימוש ב- 55 מעלות צלזיוס כדוגמה. הניסוי עשה שימוש במנגנון ויטריפיקציה ששונה באמצעות צינור צנטריפוגה נוסף, ודגימות דוגרו בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס. הנהלים המפורטים היו מכווננים כדי למזער את עיבוי האדים ולקבל שכבה דקה של קרח על הרשת. דוגמאות לניסויים מוצלחים ולא מוצלחים מסופקים.

Introduction

טכנולוגיית cryo-EM לפתרון מבנים של קומפלקסים חלבונים המשיכה להשתפר, במיוחד בכיוון של קבלת מבנים ברזולוציה גבוהה ^1,2. בינתיים, הנוף של היישום שלה הורחב גם על ידי שינוי תנאי הדגימה כגון pH או ליגנדות לפני תהליך vitrification³, הכולל הכנת רשתות דגימה ואחריו הקפאת צלילה ^4,5. תנאי חשוב נוסף הוא הטמפרטורה. למרות שניסויי cryo-EM, כמו קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, מבוצעים בטמפרטורות נמוכות, המבנה שנפתר על ידי cryo-EM משקף את המבנה במצב התמיסה לפני הוויטריפיקציה. עד לאחרונה, רוב מחקרי הקריו-EM של ניתוח חלקיקים בודדים (SPA) משתמשים בדגימות שנשמרות על קרח (כלומר, ב-4 מעלות צלזיוס) לפני ויטריפיקציה⁶, אם כי מספר מחקרים משתמשים בדגימות בטמפרטורת החדר^סביב 7,8,9,10 או עד 42 מעלות צלזיוס ¹¹. בדו"ח שפורסם לאחרונה, ביצענו מחקרים תלויי טמפרטורה של האנזים קטול-חומצה רדוקטויזומראז (KARI) מהארכיאון התרמופילי סולפולובוס סולפטריקוס (Sso) בשש טמפרטורות שונות מ-4 מעלות צלזיוס עד 70 מעלות צלזיוס¹². המחקרים שלנו מצביעים על כך שחשוב להכין רשתות דגימה בטמפרטורות רלוונטיות מבחינה פונקציונלית וכי cryo-EM היא השיטה המבנית היחידה האפשרית למעשה לפתרון המבנה של אותו קומפלקס חלבונים בטמפרטורות מרובות.

הקושי העיקרי לוויטריפיקציה בטמפרטורות גבוהות הוא למזער את עיבוי האדים ולהשיג קרח דק. כאן אנו מדווחים על הפרוטוקול המפורט המשמש להכנת רשתות מדגם בטמפרטורות גבוהות במחקר הקודם שלנו על Sso-KARI ¹². אנו מניחים שהקוראים או הצופים כבר מנוסים בהליכי הכנת המדגם הכוללים ועיבוד הנתונים לניסויים cryo-EM ומדגישים את ההיבטים הרלוונטיים לטמפרטורה גבוהה.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה נועד להשתמש במנגנון ויטריפיקציה מסחרי שונה כדי להכין את דגימות מיקרוסקופיית הקריו-אלקטרונים (cryo-EM) בטמפרטורות ספציפיות, גבוהות במיוחד מ-37 מעלות צלזיוס. מערך הניסוי הכולל מוצג באיור 1. הפרוטוקול משתמש ב-55 מעלות צלזיוס כדוגמה. לגבי התנאים הספציפיים בטמפרטורות אחרות, עיין בטבלה משלימה 2 בהפניה¹².

1. הכנת מנגנון הוויטריפיקציה

1. צור חור של 1 ס"מ בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל בקצה הסגור שלו.
2. הניחו את הצינור בתא מנגנון הוויטריפיקציה בשקע המים העל-קולי, כפי שמוצג באיור 2.
   הערה: המטרה היא למזער את עיבוי המים על ידי הנחיית אדי מים למחליף החום דרך הצינור לפני שהם מגיעים לכל התא.
3. הגדירו את טמפרטורת מנגנון הוויטריפיקציה לטמפרטורה שצוינה (למשל, 55 מעלות צלזיוס, כפי שמוצג באיור 3), ואפשרו לתא מנגנון הוויטריפיקציה להגיע ל-55 מעלות צלזיוס וללחות יחסית של 100%. תן לו לעמוד לפחות חצי שעה כדי לייצב את התנאים לפני תחילת הניסוי.

2. חימום המדגם והכלים

1. מניחים את אמבט המים על פלטה חמה ומכוונים את הפלטה לטמפרטורה הרצויה (כאן 55 מעלות צלזיוס). בדוק עם מדחום כדי לוודא שהמים מגיעים ל -55 מעלות צלזיוס.
2. דגירה של הדגימה באמבט המים וחמם מראש את קצה הפיפטה בקצה הפלטה למשך 2 דקות או יותר לפני ניסוי ההכתמה.
   הערה: הגדרת הטמפרטורה הגבוהה ביותר עבור תא מנגנון הוויטריפיקציה היא 60 °C. כדי להכין רשתות טמפרטורה גבוהות יותר לניסוי cyro-EM (למשל, 70 מעלות צלזיוס), הדגימה דוגרת באמבט המים בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס, והממוצע בין טמפרטורת הדגימה לטמפרטורת מנגנון הוויטריפיקציה מוערך כטמפרטורה בפועל של הדגימה ברשת (70 מעלות צלזיוס במקרה זה). עיין בסעיף הדיון לקבלת פרטים נוספים ומגבלות על אומדן זה.

3. הכנה לניסוי הכתמים

1. Glow לפרוק רשת הנתמכת בפחמן חורי ב-25 mA למשך 30 שניות, או חלופה לערכים בהתאם למכשיר שבו נעשה שימוש.
2. לדגום את הפינצטה עם הרשת במנגנון vitrification במשך 2 דקות או יותר.
3. מלאו את מיכל האתאן באתאן על פי הנהלים הסטנדרטיים. אל תתנו לאתאן לעלות על גדותיו.
   הערה: שלב זה אורך כ-10 דקות ויש לעקוב אחריו מיד עם ניסוי הכתם כדי למנוע קפיאה.
4. הכניסו את נייר הסינון של הוויטריפיקציה לתא מנגנון הוויטריפיקציה לא לפני 5 דקות לפני ניסוי ההכתמה.
   הערה: הצבת נייר הסינון בתא מוקדם מדי תגרום לו להיות רטוב מדי.

4. ניסוי הכתמה

הערה: כשאתם מחזיקים את הרשת, ודאו שהרשת יציבה ושיש אזור מגע מינימלי עם הפינצטה (איור 4). זה נעשה כדי לשמור על יעילות הקירור הטובה ביותר של אתאן וכדי למנוע קרח שאינו זגוגי.

1. השתמש בקצה פיפטה כדי להחיל 7-9 μL של הדגימה על הרשת. לאחר מכן המתן 1-2 שניות, כתם במשך 1-1.5 שניות, וצלל במהירות את הדגימה לאתאן נוזלי.
2. מעבירים את הרשת מאתאן נוזלי לקופסת הקריו, המאוחסנת בחנקן נוזלי.
   הערה: שלב זה חייב להתבצע בזהירות רבה מכיוון שהפינצטה עדיין חמה, כך שמיכל מיכל הקירור מלא באדים בשלב זה.

5. בדיקת איכות לרשתות

1. גזור את הרשתות והעלה אותן למכשיר cryo-EM.
2. השתמש במסך התצוגה של מכשיר cryo-EM ובפונקציית המינון הנמוך של התוכנה כדי לסנן את מצב הקרח ברשת ואת התפלגות הדגימה ברשת.
   הערה: לעתים קרובות, הרשתות יבשות מאוד, או ששכבת הקרח עבה מדי. שיעור ההצלחה של הרשתות שהוכנו בטמפרטורות גבוהות נמוך משמעותית מזה שבטמפרטורת החדר או 4 מעלות צלזיוס. תוצאות מייצגות של רשתות טובות ורשתות לא משביעות רצון מוצגות בסעיף הבא.
3. אם איכות הרשת המתקבלת אינה טובה, חזור על תהליך הכנת הרשת בתנאים מגוונים (כגון זמן המתנה, זמן הכתמה וכו '). אם איכות הרשת המתקבלת טובה, חזור על אותם שלבים כדי ליצור רשתות בטמפרטורה שונה.

6. איסוף נתונים

1. העבר את הרשתות באיכות טובה למכשיר cryo-EM ברזולוציה גבוהה.
2. ביצוע איסוף נתונים וניתוח נתונים על פי נהלים שנקבעו.
   הערה: כפי שמוצג בפרסום הקודם שלנו, הרזולוציה של המבנה אינה מושפעת מהטמפרטורה הגבוהה¹².

תוצאות

סקירת ההגדלה הנמוכה מוצגת באיור 5A,B. לוח A הוא דוגמה לרשת מוצלחת. יש שיפוע קרח משמאל למעלה (עבה יותר) לימין למטה (דק יותר או ריק). רשת כזו מקלה על מציאת עובי מתאים של שכבת הקרח באזור האמצעי המתאים לאיסוף נתונים, כגון הקופסאות הכחולות והירוקות. הרשת B יבשה מדי. לריבועים ב...

Discussion

בשלב 1 של הפרוטוקול, ודא שצינור הצנטריפוגה הותקן היטב ואינו נופל כאשר הניסוי בעיצומו. בשל הצטברות של מספר רב של טיפות מים בתא, אשר יכול לשנות את יכולת ספיחה של נייר הסינון, מומלץ כי הזמן הכולל של הניסוי לא יעלה על 30 דקות לאחר שתא מנגנון הוויטריפיקציה הגיע לטמפרטורת שיווי המשקל. אם זמן הפעולה ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Falcon tube	Falcon	352070	size: 50 mL
Filter paper	Ted Pella	47000-100	Ø55/20mm, Grade 595
HI1210	Leica		water bath
K100X	Electron Microscopy Sciences		glow discharge
Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid	Ted Pella	658-200-CU-100
Titan Krios G3	Thermo Fisher Scientific	1063996	low dose imaging
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	1086439
Vitrobot Tweezer	Ted Pella	47000-500