Preparación de rejillas de muestra de alta temperatura para crio-EM

Resumen

Este documento proporciona un protocolo detallado para preparar rejillas de muestra a temperaturas de hasta 70 ° C, antes de la congelación por inmersión para experimentos crio-EM.

Resumen

Las rejillas de muestreo para experimentos de criomicroscopía electrónica (crio-EM) se preparan generalmente a una temperatura óptima para el almacenamiento de muestras biológicas, principalmente a 4 °C y ocasionalmente a temperatura ambiente. Recientemente, descubrimos que la estructura de proteínas resuelta a baja temperatura puede no ser funcionalmente relevante, particularmente para proteínas de arqueas termófilas. Se desarrolló un procedimiento para preparar muestras de proteínas a temperaturas más altas (hasta 70 °C) para el análisis crio-EM. Demostramos que las estructuras de muestras preparadas a temperaturas más altas son funcionalmente relevantes y dependientes de la temperatura. Aquí describimos un protocolo detallado para preparar rejillas de muestra a alta temperatura, utilizando 55 ° C como ejemplo. El experimento utilizó un aparato de vitrificación modificado con un tubo centrífugo adicional, y las muestras se incubaron a 55 °C. Los procedimientos detallados se ajustaron para minimizar la condensación de vapor y obtener una fina capa de hielo en la rejilla. Se proporcionan ejemplos de experimentos exitosos y no exitosos.

Introducción

La tecnología crio-EM para resolver las estructuras de complejos proteicos ha continuado mejorando, particularmente en la dirección de la obtención de estructuras de alta resolución ^1,2. Mientras tanto, el panorama de su aplicación también se ha ampliado variando las condiciones de la muestra, como el pH o los ligandos, antes del proceso de vitrificación³, que implica la preparación de rejillas de muestra seguidas de congelación por inmersión ^4,5. Otra condición importante es la temperatura. Aunque los experimentos crio-EM, como la cristalografía de rayos X, se realizan a bajas temperaturas, la estructura resuelta por cryo-EM refleja la estructura en el estado de solución antes de la vitrificación. Hasta hace poco, la mayoría de los estudios crio-EM de análisis de partículas individuales (SPA) utilizan muestras que se mantienen en hielo (es decir, a 4 °C) antes de la vitrificación⁶, aunque varios estudios utilizan muestras a una temperatura ambiente de alrededor de 7,8,9,10 o tan alta como 42 °C ¹¹. En un informe reciente, realizamos estudios dependientes de la temperatura de la enzima cetol-ácido reductoisomerasa (KARI) de la arquea termófila Sulfolobus solfataricus (Sso) a seis temperaturas diferentes de 4 ° C a 70 ° C¹². Nuestros estudios sugieren que es importante preparar rejillas de muestra a temperaturas funcionalmente relevantes y que la crio-EM es el único método estructural que es prácticamente factible para resolver la estructura del mismo complejo proteico a múltiples temperaturas.

La principal dificultad para la vitrificación a altas temperaturas es minimizar la condensación de vapor y lograr hielo delgado. Aquí informamos el protocolo detallado utilizado para preparar rejillas de muestra a altas temperaturas en nuestro estudio previo del Sso-KARI ¹². Asumimos que los lectores o espectadores ya tienen experiencia en la preparación general de muestras y los procedimientos de procesamiento de datos para experimentos crio-EM y enfatizamos los aspectos relevantes para la alta temperatura.

Protocolo

NOTA: Este protocolo tiene como objetivo utilizar un aparato de vitrificación comercial modificado para preparar las muestras de criomicroscopía electrónica (crio-EM) a temperaturas específicas, especialmente superiores a 37 °C. La configuración experimental general se muestra en la Figura 1. El protocolo utiliza 55 °C como ejemplo. Para las condiciones específicas a otras temperaturas, véase el cuadro complementario 2 en la referencia¹².

1. Preparación del aparato de vitrificación

1. Haga un orificio de 1 cm en un tubo de centrífuga de 50 ml en su extremo cerrado.
2. Coloque el tubo en la cámara del aparato de vitrificación en la salida de agua ultrasónica, como se muestra en la Figura 2.
   NOTA: El propósito es minimizar la condensación de agua guiando el vapor de agua al intercambiador de calor a través del tubo antes de llegar a toda la cámara.
3. Ajuste la temperatura del aparato de vitrificación a la temperatura especificada (por ejemplo, 55 °C, como se muestra en la Figura 3) y permita que la cámara del aparato de vitrificación alcance los 55 °C y el 100% de humedad relativa. Déjelo reposar durante al menos media hora para estabilizar las condiciones antes de comenzar el experimento.

2. Calentamiento de la muestra y las herramientas

1. Coloque el baño de agua en una placa calefactora y ajuste la placa a la temperatura deseada (aquí 55 ° C). Verifique con un termómetro para asegurarse de que el agua alcance los 55 ° C.
2. Incubar la muestra en el baño maría y precalentar la punta de la pipeta en el borde de la placa calefactora durante 2 minutos o más antes del experimento de secado.
   NOTA: El ajuste de temperatura más alto para la cámara del aparato de vitrificación es de 60 °C. Para preparar rejillas de temperatura más altas para el experimento cyro-EM (por ejemplo, 70 °C), la muestra se incuba en el baño maría a 80 °C, y el promedio entre la temperatura de la muestra y la temperatura del aparato de vitrificación se estima como la temperatura real de la muestra en la rejilla (70 °C en este caso). Consulte la sección Discusión para obtener más detalles y limitaciones sobre esta estimación.

3. Preparación para el experimento de transferencia

1. Descarga incandescente una rejilla agujereada soportada por carbono a 25 mA durante 30 s, o alternativa a los valores dependiendo del dispositivo utilizado.
2. Incubar las pinzas con la rejilla en el aparato de vitrificación durante 2 min o más.
3. Llene el recipiente de etano con etano de acuerdo con los procedimientos estándar. No dejes que el etano se desborde.
   NOTA: Este paso dura unos 10 minutos y debe seguirse inmediatamente con el experimento de secado para evitar la congelación.
4. Coloque el papel de filtro de vitrificación en la cámara del aparato de vitrificación no antes de 5 minutos antes del experimento de secado.
   NOTA: Colocar el papel de filtro en la cámara demasiado pronto hará que se humedezca demasiado.

4. Experimento de transferencia

NOTA: Cuando sostenga la rejilla, asegúrese de que la rejilla sea estable y que haya un área de contacto mínima con las pinzas (Figura 4). Esto se hace para mantener la mejor eficiencia de enfriamiento del etano y para evitar el hielo no vítreo.

1. Utilice una punta de pipeta para aplicar 7-9 μL de la muestra a la rejilla. Luego espere 1-2 s, seque durante 1-1.5 s y sumerja rápidamente la muestra en etano líquido.
2. Transfiera la rejilla del etano líquido a la caja criogénica, que se almacena en nitrógeno líquido.
   NOTA: Este paso debe realizarse con mucho cuidado porque las pinzas todavía están calientes, por lo que todo el tanque de enfriamiento está lleno de vapor en este momento.

5. Control de calidad de las redes

1. Recorte las cuadrículas y cárguelas en un instrumento crio-EM.
2. Utilice la pantalla de visualización del instrumento crio-EM y la función de dosis baja del software para detectar la condición del hielo en la rejilla y la distribución de la muestra en la rejilla.
   NOTA: A menudo, las rejillas están muy secas o la capa de hielo es demasiado gruesa. La tasa de éxito de las rejillas preparadas a altas temperaturas es sustancialmente inferior a la de las rejillas a temperatura ambiente o a 4 °C. Los resultados representativos de las cuadrículas buenas y las cuadrículas no satisfactorias se muestran en la siguiente sección.
3. Si la calidad de la rejilla resultante no es buena, repita el proceso de preparación de la rejilla con condiciones variadas (como tiempo de espera, tiempo de borrado, etc.). Si la calidad de la rejilla resultante es buena, repita los mismos pasos para hacer rejillas a una temperatura diferente.

6. Recopilación de datos

1. Transfiera las rejillas de buena calidad a un instrumento crio-EM de alta resolución.
2. Realizar la recopilación y el análisis de datos de acuerdo con los procedimientos establecidos.
   NOTA: Como se muestra en nuestra publicación anterior, la resolución de la estructura no se ve afectada por la alta temperatura¹².

Resultados

La descripción general de bajo aumento se muestra en la Figura 5A,B. El panel A es un ejemplo de una cuadrícula exitosa. Hay un gradiente de hielo desde la parte superior izquierda (más gruesa) hasta la parte inferior derecha (más delgada o vacía). Dicha cuadrícula hace que sea más fácil encontrar un espesor apropiado de la capa de hielo en el área media adecuada para la recopilación de datos, como las cajas azul y verde. La rejilla B está demasiado seca. Los cuad...

Discusión

En el paso 1 del protocolo, asegúrese de que el tubo de centrífuga se haya instalado bien y no se caiga cuando el experimento esté en curso. Debido a la acumulación de una gran cantidad de gotas de agua en la cámara, lo que podría cambiar la capacidad de adsorción del papel de filtro, se recomienda que el tiempo total del experimento no exceda los 30 minutos después de que la cámara del aparato de vitrificación haya alcanzado la temperatura de equilibrio. Si el tiempo de operación excede los 30 minutos, el ope...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Falcon tube	Falcon	352070	size: 50 mL
Filter paper	Ted Pella	47000-100	Ø55/20mm, Grade 595
HI1210	Leica		water bath
K100X	Electron Microscopy Sciences		glow discharge
Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid	Ted Pella	658-200-CU-100
Titan Krios G3	Thermo Fisher Scientific	1063996	low dose imaging
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	1086439
Vitrobot Tweezer	Ted Pella	47000-500