Vorbereitung von Hochtemperatur-Probengittern für Kryo-EM

Zusammenfassung

Dieses Papier enthält ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung von Probengittern bei Temperaturen von bis zu 70 °C vor dem Einfrieren von Proben für Kryo-EM-Experimente.

Zusammenfassung

Die Probengitter für Kryo-Elektronenmikroskopie-Experimente (Kryo-EM) werden üblicherweise bei einer für die Lagerung biologischer Proben optimalen Temperatur präpariert, meist bei 4 °C und gelegentlich bei Raumtemperatur. Kürzlich haben wir entdeckt, dass die Proteinstruktur, die bei niedrigen Temperaturen gelöst wird, möglicherweise nicht funktionell relevant ist, insbesondere für Proteine aus thermophilen Archaeen. Es wurde ein Verfahren entwickelt, um Proteinproben bei höheren Temperaturen (bis zu 70 °C) für die Kryo-EM-Analyse vorzubereiten. Wir haben gezeigt, dass die Strukturen von Proben, die bei höheren Temperaturen präpariert wurden, funktionell relevant und temperaturabhängig sind. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Vorbereitung von Probengittern bei hohen Temperaturen am Beispiel von 55 °C. Das Experiment verwendete eine Vitrifikationsapparatur, die mit einem zusätzlichen Zentrifugenröhrchen modifiziert wurde, und die Proben wurden bei 55 °C inkubiert. Die detaillierten Verfahren wurden fein abgestimmt, um Dampfkondensation zu minimieren und eine dünne Eisschicht auf dem Gitter zu erhalten. Beispiele für erfolgreiche und erfolglose Experimente werden gegeben.

Einleitung

Die Kryo-EM-Technologie zur Lösung der Strukturen von Proteinkomplexen hat sich weiter verbessert, insbesondere in Richtung der Gewinnung hochauflösender Strukturen ^1,2. In der Zwischenzeit wurde die Anwendungslandschaft auch durch Variation der Probenbedingungen wie pH-Wert oder Liganden vor dem Vitrifikationsprozess³ erweitert, der die Vorbereitung von Probengittern mit anschließendem Tauchgefrieren beinhaltet ^4,5. Eine weitere wichtige Bedingung ist die Temperatur. Obwohl Kryo-EM-Experimente, wie die Röntgenkristallographie, bei niedrigen Temperaturen durchgeführt werden, spiegelt die durch Kryo-EM gelöste Struktur die Struktur im Lösungszustand vor der Vitrifikation wider. Bis vor kurzem verwendete die Mehrheit der Einzelpartikelanalyse (SPA) Kryo-EM-Studien Proben, die vor der Vitrifikation auf Eis gehalten wurden⁽dh bei 4 ° C), obwohl eine Reihe von Studien Proben bei etwa^{Raumtemperatur} 7,8,9,10 oder so hoch wie 42 ° C ¹¹ verwendet. In einem aktuellen Bericht haben wir temperaturabhängige Untersuchungen des Enzyms Ketolsäure-Reduktoisomerase (KARI) aus dem thermophilen Archaeon Sulfolobus solfataricus (Sso) bei sechs verschiedenen Temperaturen von 4 °C bis 70 °C durchgeführt¹². Unsere Studien legen nahe, dass es wichtig ist, Probengitter bei funktionell relevanten Temperaturen vorzubereiten und dass Kryo-EM die einzige Strukturmethode ist, die praktisch möglich ist, um die Struktur desselben Proteinkomplexes bei mehreren Temperaturen zu lösen.

Die Hauptschwierigkeit bei der Verglasung bei hohen Temperaturen besteht darin, die Dampfkondensation zu minimieren und dünnes Eis zu erreichen. Hier berichten wir über das detaillierte Protokoll, das für die Vorbereitung von Probengittern bei hohen Temperaturen in unserer früheren Studie des Sso-KARI ¹² verwendet wurde. Wir gehen davon aus, dass die Leser oder Betrachter bereits Erfahrung mit den gesamten Probenvorbereitungs- und Datenverarbeitungsverfahren für Kryo-EM-Experimente haben und betonen die für hohe Temperaturen relevanten Aspekte.

Protokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine modifizierte kommerzielle Vitrifikationsvorrichtung zu verwenden, um die Kryo-Elektronenmikroskopie-Proben (Kryo-EM) bei bestimmten Temperaturen, insbesondere über 37 °C, vorzubereiten. Der gesamte Versuchsaufbau ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Protokoll verwendet 55 °C als Beispiel. Für die spezifischen Bedingungen bei anderen Temperaturen siehe Zusatztabelle 2 in Referenz¹².

1. Vorbereitung des Vitrifikationsapparates

1. Machen Sie ein 1 cm großes Loch in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen an seinem geschlossenen Ende.
2. Setzen Sie das Röhrchen in die Kammer des Vitrifikationsgeräts am Ultraschallwasserauslass ein, wie in Abbildung 2 dargestellt.
   HINWEIS: Der Zweck besteht darin, die Wasserkondensation zu minimieren, indem Wasserdampf durch das Rohr zum Wärmetauscher geleitet wird, bevor die gesamte Kammer erreicht wird.
3. Stellen Sie die Temperatur des Verglasungsapparats auf die angegebene Temperatur ein (z. B. 55 °C, wie in Abbildung 3 dargestellt), und lassen Sie die Kammer des Verglasungsgeräts 55 °C und 100 % relative Luftfeuchtigkeit erreichen. Lassen Sie es mindestens eine halbe Stunde stehen, um die Bedingungen zu stabilisieren, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.

2. Aufwärmen der Probe und der Werkzeuge

1. Stellen Sie das Wasserbad auf eine Kochplatte und stellen Sie die Kochplatte auf die gewünschte Temperatur (hier 55 °C). Überprüfen Sie mit einem Thermometer, ob das Wasser 55 ° C erreicht.
2. Inkubieren Sie die Probe im Wasserbad und heizen Sie die Pipettenspitze am Rand der Heizplatte für 2 min oder länger vor dem Blotting-Experiment vor.
   HINWEIS: Die höchste Temperatureinstellung für die Verglasungsgerätekammer beträgt 60 °C. Um höhere Temperaturgitter für Cyro-EM-Experimente (z. B. 70 °C) vorzubereiten, wird die Probe im Wasserbad bei 80 °C inkubiert, und der Mittelwert zwischen der Probentemperatur und der Temperatur des Vitrifikationsapparats wird auf die tatsächliche Temperatur der Probe auf dem Gitter geschätzt (in diesem Fall 70 °C). Weitere Details und Einschränkungen dieser Schätzung finden Sie im Abschnitt Diskussion .

3. Vorbereitung des Blotting-Experiments

1. Glimmenentladung eines löchrigen, kohlenstoffgestützten Gitters bei 25 mA für 30 s oder alternativ zu den Werten je nach verwendetem Gerät.
2. Inkubieren Sie die Pinzette mit dem Gitter im Vitrifikationsapparat für 2 min oder länger.
3. Füllen Sie den Ethanbehälter nach Standardverfahren mit Ethan. Lassen Sie das Ethan nicht überlaufen.
   HINWEIS: Dieser Schritt dauert ca. 10 Minuten und sollte sofort mit dem Blotting-Experiment gefolgt werden, um ein Einfrieren zu vermeiden.
4. Legen Sie das Vitrifikationsfilterpapier frühestens 5 min vor dem Blotting-Versuch in die Kammer des Vitrifikationsapparates.
   HINWEIS: Wenn Sie das Filterpapier zu früh in die Kammer legen, wird es zu nass.

4. Blotting-Experiment

HINWEIS: Stellen Sie beim Halten des Gitters sicher, dass das Gitter stabil ist und eine minimale Kontaktfläche mit der Pinzette vorhanden ist (Abbildung 4). Dies geschieht, um die beste Kühleffizienz von Ethan zu erhalten und nicht glasiges Eis zu vermeiden.

1. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um 7-9 μL der Probe auf das Gitter aufzutragen. Dann warten Sie 1-2 s, tupfen Sie für 1-1,5 s und tauchen Sie die Probe schnell in flüssiges Ethan.
2. Übertragen Sie das Gitter von flüssigem Ethan in die Kryobox, die in flüssigem Stickstoff gespeichert ist.
   HINWEIS: Dieser Schritt muss sehr sorgfältig durchgeführt werden, da die Pinzette noch heiß ist, so dass der gesamte Kühltank zu diesem Zeitpunkt mit Dampf gefüllt ist.

5. Qualitätsprüfung der Netze

1. Schneiden Sie die Gitter ab und laden Sie sie auf ein Kryo-EM-Instrument hoch.
2. Verwenden Sie den Bildschirm des Kryo-EM-Instruments und die Niedrigdosisfunktion der Software, um den Eiszustand auf dem Gitter und die Verteilung der Probe auf dem Gitter zu überprüfen.
   HINWEIS: Oft sind die Gitter sehr trocken oder die Eisschicht ist zu dick. Die Erfolgsquote der bei hohen Temperaturen vorbereiteten Netze ist wesentlich geringer als bei Raumtemperatur oder 4 °C. Repräsentative Ergebnisse von guten und nicht zufriedenstellenden Gittern werden im nächsten Abschnitt gezeigt.
3. Wenn die Qualität des resultierenden Gitters nicht gut ist, wiederholen Sie den Prozess der Netzvorbereitung unter verschiedenen Bedingungen (z. B. Wartezeit, Löschzeit usw.). Wenn die Qualität des resultierenden Gitters gut ist, wiederholen Sie die gleichen Schritte, um Gitter mit einer anderen Temperatur zu erstellen.

6. Datenerhebung

1. Übertragen Sie die qualitativ hochwertigen Gitter auf ein hochauflösendes Kryo-EM-Instrument.
2. Führen Sie Datenerhebung und Datenanalysen nach festgelegten Verfahren durch.
   HINWEIS: Wie in unserer vorherigen Veröffentlichung gezeigt, wird die Auflösung der Struktur durch die hohe Temperatur¹² nicht beeinflusst.

Ergebnisse

Die Übersicht über die geringe Vergrößerung ist in Abbildung 5A,B dargestellt. Panel A ist ein Beispiel für ein erfolgreiches Raster. Es gibt einen Eisgradienten von links oben (dicker) nach rechts unten (dünner oder leer). Ein solches Raster erleichtert es, eine geeignete Dicke der Eisschicht im mittleren Bereich zu finden, die für die Datenerhebung geeignet ist, wie z. B. die blauen und grünen Boxen. Das Gitter B ist zu trocken. Die Quadrate im Raster haben einen h...

Diskussion

Stellen Sie in Schritt 1 des Protokolls sicher, dass das Zentrifugenröhrchen gut installiert wurde und nicht herunterfällt, wenn das Experiment läuft. Aufgrund der Ansammlung einer großen Anzahl von Wassertröpfchen in der Kammer, die die Adsorptionskapazität des Filterpapiers verändern könnten, wird empfohlen, dass die Gesamtzeit des Experiments 30 min nicht überschreiten sollte, nachdem die Vitrifikationsapparatekammer die Gleichgewichtstemperatur erreicht hat. Wenn die Betriebszeit 30 Minuten überschreitet, m...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Falcon tube	Falcon	352070	size: 50 mL
Filter paper	Ted Pella	47000-100	Ø55/20mm, Grade 595
HI1210	Leica		water bath
K100X	Electron Microscopy Sciences		glow discharge
Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid	Ted Pella	658-200-CU-100
Titan Krios G3	Thermo Fisher Scientific	1063996	low dose imaging
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	1086439
Vitrobot Tweezer	Ted Pella	47000-500