Preparação de grades de amostras de alta temperatura para crio-EM

Resumo

Este artigo fornece um protocolo detalhado para a preparação de grades de amostras a temperaturas tão altas quanto 70 °C, antes do congelamento por imersão para experimentos de crio-EM.

Resumo

As grades de amostras para experimentos de microscopia crioeletrônica (crio-EM) são geralmente preparadas a uma temperatura ideal para o armazenamento de amostras biológicas, principalmente a 4 °C e, ocasionalmente, à temperatura ambiente. Recentemente, descobrimos que a estrutura proteica resolvida a baixa temperatura pode não ser funcionalmente relevante, particularmente para proteínas de archaea termofílicas. Um procedimento foi desenvolvido para preparar amostras de proteína em temperaturas mais altas (até 70 °C) para análise crio-EM. Mostramos que as estruturas de amostras preparadas em temperaturas mais altas são funcionalmente relevantes e dependentes da temperatura. Aqui descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de grades de amostras em alta temperatura, usando 55 °C como exemplo. O experimento utilizou um aparelho de vitrificação modificado com um tubo de centrífuga adicional, e as amostras foram incubadas a 55 °C. Os procedimentos detalhados foram ajustados para minimizar a condensação de vapor e obter uma fina camada de gelo na grade. Exemplos de experimentos bem-sucedidos e malsucedidos são fornecidos.

Introdução

A tecnologia crio-EM para a resolução das estruturas de complexos proteicos tem continuado a melhorar, particularmente no sentido da obtenção de estruturas de alta resolução ^1,2. Nesse ínterim, o cenário de sua aplicação também foi ampliado pela variação das condições da amostra, como pH ou ligantes, antes do processo de vitrificação³, que envolve a preparação de grades de amostra seguidas de congelamento por imersão ^4,5. Outra condição importante é a temperatura. Embora os experimentos de crio-EM, como a cristalografia de raios-X, sejam realizados a baixas temperaturas, a estrutura resolvida pela crio-EM reflete a estrutura no estado da solução antes da vitrificação. Até recentemente, a maioria dos estudos de crio-EM de análise de partícula única (SPA) usa amostras que são mantidas no gelo (ou seja, a 4 °C) antes da vitrificação⁶, embora vários estudos usem amostras em torno da temperatura ambiente 7,8,9,10 ou tão alto quanto 42 °C ¹¹. Em um relatório recente, realizamos estudos dependentes da temperatura da enzima reducionoisorase cetola-ácida (KARI) do arqueão termofílico Sulfolobus solfataricus (Sso) em seis temperaturas diferentes de 4 °C a 70 °C¹². Nossos estudos sugerem que é importante preparar grades de amostras a temperaturas funcionalmente relevantes e que o crio-EM é o único método estrutural praticamente viável para resolver a estrutura do mesmo complexo proteico em múltiplas temperaturas.

A maior dificuldade para a vitrificação em altas temperaturas é minimizar a condensação de vapor e alcançar gelo fino. Aqui relatamos o protocolo detalhado usado para preparar grades de amostras em altas temperaturas em nosso estudo anterior do Sso-KARI ¹². Assumimos que os leitores ou espectadores já são experientes nos procedimentos gerais de preparação de amostras e processamento de dados para experimentos de crio-EM e enfatizamos os aspectos relevantes para a alta temperatura.

Protocolo

NOTA: Este protocolo tem como objetivo utilizar um aparelho de vitrificação comercial modificado para preparar as amostras de microscopia crio-eletrônica (crio-EM) em temperaturas específicas, especialmente superiores a 37 °C. A configuração experimental geral é mostrada na Figura 1. O protocolo usa 55 °C como exemplo. Para as condições específicas a outras temperaturas, consultar o quadro suplementar 2 na referência¹².

1. Preparação do aparelho de vitrificação

1. Faça um furo de 1 cm em um tubo de centrífuga de 50 mL em sua extremidade fechada.
2. Colocar o tubo na câmara do aparelho de vitrificação na saída de água ultra-sônica, como mostra a Figura 2.
   NOTA: O objetivo é minimizar a condensação de água, guiando o vapor de água para o trocador de calor através do tubo antes de atingir toda a câmara.
3. Ajustar a temperatura do aparelho de vitrificação à temperatura especificada (por exemplo, 55 °C, como indicado na figura 3) e permitir que a câmara do aparelho de vitrificação atinja 55 °C e 100% de humidade relativa. Deixe repousar por pelo menos meia hora para estabilizar as condições antes de iniciar o experimento.

2. Aquecendo a amostra e as ferramentas

1. Coloque o banho de água numa placa de aquecimento e ajuste a placa de aquecimento para a temperatura desejada (aqui 55 °C). Verifique com um termômetro para garantir que a água atinja 55 °C.
2. Incubar a amostra em banho-maria e pré-aquecer a ponta da pipeta na borda da placa de aquecimento por 2 minutos ou mais antes do experimento de blotting.
   NOTA: A temperatura mais elevada para a câmara do aparelho de vitrificação é de 60 °C. Para preparar grelhas de temperatura mais elevadas para a experiência cyro-EM (por exemplo, 70 °C), a amostra é incubada em banho-maria a 80 °C, e a média entre a temperatura da amostra e a temperatura do aparelho de vitrificação é estimada como sendo a temperatura real da amostra na grelha (70 °C neste caso). Consulte a seção Discussão para obter mais detalhes e limitações sobre essa estimativa.

3. Preparação para o experimento de blotting

1. Descarga de brilho de uma grade suportada por carbono holey a 25 mA por 30 s, ou alternativa aos valores, dependendo do dispositivo usado.
2. Incubar a pinça com a grelha no aparelho de vitrificação durante 2 min ou mais.
3. Encha o recipiente de etano com etano de acordo com os procedimentos padrão. Não deixe o etano transbordar.
   NOTA: Esta etapa leva cerca de 10 minutos e deve ser seguida imediatamente com o experimento de blotting para evitar o congelamento.
4. Coloque o papel de filtro de vitrificação na câmara do aparelho de vitrificação não antes de 5 minutos antes da experiência de blotting.
   NOTA: Colocar o papel de filtro na câmara muito cedo fará com que ele fique muito molhado.

4. Experiência de blotting

NOTA: Ao segurar a grade, verifique se a grade está estável e se há uma área de contato mínima com a pinça (Figura 4). Isso é feito para manter a melhor eficiência de resfriamento do etano e evitar o gelo não vítreo.

1. Use uma ponta de pipeta para aplicar 7-9 μL da amostra à grade. Em seguida, aguarde 1-2 s, limpe por 1-1,5 s e mergulhe rapidamente a amostra em etano líquido.
2. Transfira a grade do etano líquido para a caixa criogênica, que é armazenada em nitrogênio líquido.
   NOTA: Esta etapa deve ser executada com muito cuidado, porque a pinça ainda está quente, então todo o tanque de resfriamento está cheio de vapor neste momento.

5. Verificação de qualidade para as grades

1. Recorte as grades e carregue-as para um instrumento crio-EM.
2. Use a tela de exibição do instrumento crio-EM e a função de baixa dose do software para rastrear a condição de gelo na grade e a distribuição da amostra na grade.
   NOTA: Muitas vezes, as grades são muito secas, ou a camada de gelo é muito espessa. A taxa de sucesso das grelhas preparadas a altas temperaturas é substancialmente inferior à temperatura ambiente ou a 4 °C. Resultados representativos de grades boas e grades insatisfatórias são mostrados na próxima seção.
3. Se a qualidade da grade resultante não for boa, repita o processo de preparação da grade com condições variadas (como tempo de espera, tempo de blotting, etc.). Se a qualidade da grade resultante for boa, repita as mesmas etapas para criar grades a uma temperatura diferente.

6. Coleta de dados

1. Transfira as grades de boa qualidade para um instrumento crio-EM de alta resolução.
2. Realizar coleta e análise de dados de acordo com os procedimentos estabelecidos.
   NOTA: Como mostrado em nossa publicação anterior, a resolução da estrutura não é afetada pela alta temperatura¹².

Resultados

A visão geral de baixa ampliação é mostrada na Figura 5A,B. O Painel A é um exemplo de uma grade bem-sucedida. Há um gradiente de gelo do canto superior esquerdo (mais espesso) para o canto inferior direito (mais fino ou vazio). Essa grade facilita a localização de uma espessura apropriada da camada de gelo na área do meio adequada para a coleta de dados, como as caixas azul e verde. A grade B está muito seca. Os quadrados na grade têm contraste brilhante, o que s...

Discussão

Na etapa 1 do protocolo, certifique-se de que o tubo de centrífuga foi bem instalado e não cai quando o experimento está em andamento. Devido ao acúmulo de um grande número de gotículas de água na câmara, o que poderia alterar a capacidade de adsorção do papel de filtro, recomenda-se que o tempo total do experimento não exceda 30 min após a câmara do aparelho de vitrificação atingir a temperatura de equilíbrio. Se o tempo de operação exceder 30 min, o operador precisa substituir o papel de filtro e espe...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Falcon tube	Falcon	352070	size: 50 mL
Filter paper	Ted Pella	47000-100	Ø55/20mm, Grade 595
HI1210	Leica		water bath
K100X	Electron Microscopy Sciences		glow discharge
Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid	Ted Pella	658-200-CU-100
Titan Krios G3	Thermo Fisher Scientific	1063996	low dose imaging
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	1086439
Vitrobot Tweezer	Ted Pella	47000-500