Preparazione di griglie di campionamento ad alta temperatura per crio-EM

Riepilogo

Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione di griglie di campioni a temperature fino a 70 °C, prima del congelamento a immersione per esperimenti crio-EM.

Abstract

Le griglie di campioni per esperimenti di crio-microscopia elettronica (crio-EM) sono solitamente preparate ad una temperatura ottimale per la conservazione di campioni biologici, per lo più a 4 °C e occasionalmente a temperatura ambiente. Recentemente, abbiamo scoperto che la struttura proteica risolta a bassa temperatura potrebbe non essere funzionalmente rilevante, in particolare per le proteine degli archei termofili. È stata sviluppata una procedura per preparare campioni proteici a temperature più elevate (fino a 70 °C) per l'analisi crio-EM. Abbiamo dimostrato che le strutture provenienti da campioni preparati a temperature più elevate sono funzionalmente rilevanti e dipendenti dalla temperatura. Qui descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di griglie di campioni ad alta temperatura, usando 55 °C come esempio. L'esperimento si è avvalso di un apparecchio di vetrificazione modificato mediante una provetta da centrifuga supplementare e i campioni sono stati incubati a 55 °C. Le procedure dettagliate sono state messe a punto per ridurre al minimo la condensa del vapore e ottenere un sottile strato di ghiaccio sulla griglia. Vengono forniti esempi di esperimenti riusciti e falliti.

Introduzione

La tecnologia crio-EM per risolvere le strutture dei complessi proteici ha continuato a migliorare, in particolare nella direzione di ottenere strutture ad alta risoluzione ^1,2. Nel frattempo, anche il panorama della sua applicazione è stato ampliato variando le condizioni del campione come pH o leganti prima del processo di vetrificazione³, che prevede la preparazione di griglie di campionamento seguite dal congelamento a tuffo ^4,5. Un'altra condizione importante è la temperatura. Sebbene gli esperimenti crio-EM, come la cristallografia a raggi X, vengano eseguiti a basse temperature, la struttura risolta dalla crio-EM riflette la struttura allo stato di soluzione prima della vetrificazione. Fino a poco tempo fa, la maggior parte degli studi crio-EM di analisi di singole particelle (SPA) utilizza campioni che vengono conservati sul ghiaccio (cioè a 4 °C) prima della vetrificazione⁶, sebbene un certo numero di studi utilizzi campioni a temperatura ambiente di circa 7,8,9,10 o fino a 42 °C ¹¹. In un recente rapporto, abbiamo eseguito studi dipendenti dalla temperatura dell'enzima cheto-acido riduttoisomerasi (KARI) dall'archeone termofilo Sulfolobus solfataricus (Sso) a sei diverse temperature da 4 ° C a 70 ° C¹². I nostri studi suggeriscono che è importante preparare griglie di campioni a temperature funzionalmente rilevanti e che la crio-EM è l'unico metodo strutturale praticamente fattibile per risolvere la struttura dello stesso complesso proteico a più temperature.

La principale difficoltà per la vetrificazione ad alte temperature è ridurre al minimo la condensa del vapore e ottenere ghiaccio sottile. Qui riportiamo il protocollo dettagliato utilizzato per la preparazione di griglie campione ad alte temperature nel nostro precedente studio di Sso-KARI ¹². Partiamo dal presupposto che i lettori o gli spettatori abbiano già esperienza nella preparazione complessiva del campione e nelle procedure di elaborazione dei dati per gli esperimenti crio-EM e sottolineiamo gli aspetti rilevanti per l'alta temperatura.

Protocollo

NOTA: Questo protocollo mira ad utilizzare un apparato di vetrificazione commerciale modificato per preparare i campioni di microscopia crioelettronica (crio-EM) a temperature specifiche, in particolare superiori a 37 °C. La configurazione sperimentale complessiva è mostrata nella Figura 1. Il protocollo utilizza 55 °C come esempio. Per le condizioni specifiche ad altre temperature, fare riferimento alla tabella supplementare 2 nel riferimento¹².

1. Preparazione dell'apparecchio di vetrificazione

1. Fare un foro di 1 cm in un tubo di centrifuga da 50 ml sulla sua estremità chiusa.
2. Posizionare il tubo nella camera dell'apparato di vetrificazione all'uscita dell'acqua ad ultrasuoni, come mostrato nella Figura 2.
   NOTA: Lo scopo è ridurre al minimo la condensa dell'acqua guidando il vapore acqueo verso lo scambiatore di calore attraverso il tubo prima di raggiungere l'intera camera.
3. Impostare la temperatura dell'apparecchio di vetrificazione alla temperatura specificata (ad esempio, 55 °C, come mostrato nella Figura 3) e consentire alla camera dell'apparecchio di vetrificazione di raggiungere 55 °C e il 100% di umidità relativa. Lasciare riposare per almeno mezz'ora per stabilizzare le condizioni prima di iniziare l'esperimento.

2. Riscaldamento del campione e degli strumenti

1. Posizionare il bagnomaria su una piastra riscaldante e impostare la piastra alla temperatura desiderata (qui 55 °C). Controllare con un termometro che l'acqua raggiunga i 55 °C.
2. Incubare il campione a bagnomaria e preriscaldare la punta della pipetta sul bordo della piastra riscaldante per 2 minuti o più prima dell'esperimento di sterilizzazione a secco.
   NOTA: L'impostazione della temperatura massima per la camera dell'apparecchio di vetrificazione è 60 °C. Per preparare griglie a temperatura più elevata per esperimenti cyro-EM (ad esempio, 70 °C), il campione viene incubato nel bagno d'acqua a 80 °C e la media tra la temperatura del campione e la temperatura dell'apparato di vetrificazione è stimata essere la temperatura effettiva del campione sulla griglia (70 °C in questo caso). Vedere la sezione Discussione per ulteriori dettagli e limitazioni su questa stima.

3. Preparazione per l'esperimento di blotting

1. Glow scarica una griglia supportata da carbonio holey a 25 mA per 30 s, o in alternativa ai valori a seconda del dispositivo utilizzato.
2. Incubare le pinzette con la griglia nell'apparecchio di vetrificazione per 2 minuti o più.
3. Riempire il contenitore di etano con etano secondo le procedure standard. Non lasciare che l'etano trabocchi.
   NOTA: questo passaggio richiede circa 10 minuti e deve essere seguito immediatamente con l'esperimento di blotting per evitare il congelamento.
4. Posizionare la carta da filtro per vetrificazione nella camera dell'apparecchio di vetrificazione non prima di 5 minuti prima dell'esperimento di blotting.
   NOTA: Posizionare la carta da filtro nella camera troppo presto causerà un consumo eccessivo.

4. Esperimento di blotting

NOTA: Quando si tiene la griglia, assicurarsi che la griglia sia stabile e che vi sia un'area di contatto minima con le pinzette (Figura 4). Questo viene fatto per mantenere la migliore efficienza di raffreddamento dell'etano e per evitare il ghiaccio non vetroso.

1. Utilizzare una punta per pipetta per applicare 7-9 μL del campione alla griglia. Quindi attendere 1-2 s, asciugare per 1-1,5 s e immergere rapidamente il campione in etano liquido.
2. Trasferire la griglia dall'etano liquido alla scatola criogenica, che viene immagazzinata in azoto liquido.
   NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito con molta attenzione perché la pinzetta è ancora calda, quindi l'intero serbatoio di raffreddamento è pieno di vapore in questo momento.

5. Controllo qualità delle griglie

1. Ritaglia le griglie e caricale su uno strumento crio-EM.
2. Utilizzare lo schermo di visualizzazione dello strumento crio-EM e la funzione a basso dosaggio del software per schermare le condizioni del ghiaccio sulla griglia e la distribuzione del campione sulla griglia.
   NOTA: Spesso, le griglie sono molto secche o lo strato di ghiaccio è troppo spesso. Il tasso di successo delle griglie preparate ad alte temperature è sostanzialmente inferiore a quello a temperatura ambiente o 4 °C. I risultati rappresentativi di buone griglie e griglie non soddisfacenti sono mostrati nella sezione successiva.
3. Se la qualità della griglia risultante non è buona, ripetere il processo di preparazione della griglia con varie condizioni (come tempo di attesa, tempo di asciugatura, ecc.). Se la qualità della griglia risultante è buona, ripetere gli stessi passaggi per creare griglie a una temperatura diversa.

6. Raccolta dei dati

1. Trasferire le griglie di buona qualità su uno strumento crio-EM ad alta risoluzione.
2. Eseguire la raccolta e l'analisi dei dati secondo procedure stabilite.
   NOTA: Come mostrato nella nostra precedente pubblicazione, la risoluzione della struttura non è influenzata dall'alta temperatura¹².

Risultati

La panoramica del basso ingrandimento è mostrata nella Figura 5A,B. Il pannello A è un esempio di griglia di successo. C'è un gradiente di ghiaccio dall'alto a sinistra (più spesso) al basso a destra (più sottile o vuoto). Tale griglia rende più facile trovare uno spessore appropriato dello strato di ghiaccio nell'area centrale adatto alla raccolta dei dati, come le caselle blu e verdi. La griglia B è troppo asciutta. I quadrati nella griglia hanno un contrasto lumino...

Discussione

Nella fase 1 del protocollo, assicurarsi che il tubo della centrifuga sia stato installato bene e non cada quando l'esperimento è in corso. A causa dell'accumulo di un gran numero di goccioline d'acqua nella camera, che potrebbero modificare la capacità di adsorbimento della carta da filtro, si raccomanda che il tempo complessivo dell'esperimento non superi i 30 minuti dopo che la camera dell'apparato di vetrificazione ha raggiunto la temperatura di equilibrio. Se il tempo di funzionamento supera i 30 minuti, l'operato...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Falcon tube	Falcon	352070	size: 50 mL
Filter paper	Ted Pella	47000-100	Ø55/20mm, Grade 595
HI1210	Leica		water bath
K100X	Electron Microscopy Sciences		glow discharge
Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid	Ted Pella	658-200-CU-100
Titan Krios G3	Thermo Fisher Scientific	1063996	low dose imaging
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	1086439
Vitrobot Tweezer	Ted Pella	47000-500