冷冻电镜高温样品网格的制备

摘要

本文提供了在冷冻电镜实验进行冷冻之前在高达 70 °C 的温度下制备样品网格的详细方案。

摘要

用于冷冻电子显微镜（cryo-EM）实验的样品网格通常在最适合生物样品储存的温度下制备，主要是在4°C下，偶尔在室温下制备。最近，我们发现在低温下解决的蛋白质结构可能与功能无关，特别是对于嗜热古细菌的蛋白质。开发了一种在较高温度（高达70°C）下制备蛋白质样品以进行冷冻电镜分析的程序。我们发现，在较高温度下制备的样品的结构具有功能相关性且与温度相关。在这里，我们以55°C为例描述了在高温下制备样品网格的详细方案。该实验使用使用额外的离心管修饰的玻璃化装置，并将样品在55°C下孵育。 对详细程序进行了微调，以最大程度地减少蒸汽冷凝并在网格上获得一层薄薄的冰。提供了成功和不成功的实验示例。

引言

用于求解蛋白质复合物结构的冷冻电镜技术不断改进，特别是在获得高分辨率结构的方向上^1，2.同时，在玻璃化过程³之前，通过改变样品条件（例如pH或配体）也扩大了其应用范围，该过程涉及制备样品网格，然后进行冷冻^4，5。另一个重要条件是温度。尽管冷冻电镜实验（如X射线晶体学）是在低温下进行的，但冷冻电镜求解的结构反映了玻璃化前溶液状态下的结构。直到最近，大多数单颗粒分析 （SPA） 冷冻电镜研究使用在玻璃化之前保存在冰上的样品⁶，尽管许多研究使用室温^{约为 7}，⁸，^9，10 或高达 42 °C^{的样品 11}。在最近的一份报告中，我们对嗜热古菌Sulfolobus solfataricus（Sso）的酮酸还原异构酶（KARI）在4°C至70°C的六种不同温度下进行了温度依赖性研究¹²。我们的研究表明，在功能相关的温度下制备样品网格非常重要，冷冻电镜是唯一在多个温度下求解相同蛋白质复合物结构的实际可行的结构方法。

高温玻璃化的主要难点是尽量减少蒸汽冷凝并实现薄冰。在这里，我们报告了我们之前对 Sso-KARI ¹²的研究中用于在高温下制备样品网格的详细方案。我们假设读者或观众已经对冷冻电镜实验的整体样品制备和数据处理程序有经验，并强调与高温相关的方面。

研究方案

注意:本协议旨在使用改进的商业玻璃化设备在特定温度下（特别是高于37°C）制备冷冻电子显微镜（cryo-EM）样品。 整体实验设置如图 1所示。该方案以55°C为例。其他温度下的具体条件请参考参考^文献12中的补充表2。

1.玻璃化装置的制备

1. 在封闭端的 50 mL 离心管中打一个 1 cm 的孔。
2. 将管子放入超声波出水口的玻璃化装置室中，如图 2所示。
   注意: 目的是通过在到达整个腔室之前将水蒸气通过管子引导到热交换器来最大限度地减少水冷凝。
3. 将玻璃化装置的温度设置为指定的温度（例如，55°C，如图 3所示），并允许玻璃化装置室达到55°C和100%相对湿度。在开始实验之前，让它静置至少半小时以稳定条件。

2. 预热样品和工具

1. 将水浴放在加热板上，并将加热板设置为所需的温度（此处为55°C）。用温度计检查以确保水达到55°C。
2. 在水浴中孵育样品，并在印迹实验之前将移液器尖端在加热板边缘预热2分钟或更长时间。
   注意:玻璃化装置室的最高温度设置为60°C。 为了制备用于cyro-EM实验的更高温度的网格（例如，70°C），将样品在80°C的水浴中孵育，并且样品温度与玻璃化装置温度之间的平均值估计为网格上样品的实际温度（在这种情况下为70°C）。有关此估算的更多详细信息和限制，请参阅 "讨论 "部分。

3. 印迹实验的准备

1. 辉光以 25 mA 对多孔碳支撑网格放电 30 秒，或根据所用设备替代值。
2. 将镊子与玻璃化装置中的网格孵育2分钟或更长时间。
3. 按照标准程序在乙烷容器中填充乙烷。不要让乙烷溢出。
   注意:此步骤大约需要10分钟，应立即进行印迹实验以避免冻结。
4. 在印迹实验前不早于5分钟将玻璃化滤纸放入玻璃化装置室中。
   注意:过早地将滤纸放入腔室会导致其变得太湿。

4. 印迹实验

注:握住网格时，请确保网格稳定，并且与镊子的接触面积最小（图4）。这样做是为了保持乙烷的最佳冷却效率并避免非玻璃体冰。

1. 使用移液器吸头将 7-9 μL 样品涂覆到网格上。然后等待1-2秒，印迹1-1.5秒，并迅速将样品浸入液态乙烷中。
2. 将网格从液态乙烷转移到储存在液氮中的冷冻盒中。
   注意:此步骤必须非常小心地执行，因为镊子仍然很热，因此此时整个冷却罐都充满了蒸汽。

5. 电网质量检查

1. 夹住网格并将其上传到冷冻电镜仪器。
2. 使用冷冻电镜仪器的显示屏和软件的低剂量功能，在网格上筛选冰况和网格上样品的分布。
   注意:通常，网格非常干燥，或者冰层太厚。在高温下制备的网格的成功率大大低于室温或4 °C。 下一节显示了良好网格和不满意网格的代表性结果。
3. 如果所得网格的质量不好，请在各种条件（如等待时间、印迹时间等）下重复网格制备过程。如果生成的网格质量良好，请重复相同的步骤以在不同的温度下制作网格。

6. 数据收集

1. 将高质量的网格转移到高分辨率冷冻电镜仪器上。
2. 根据既定程序执行数据收集和数据分析。
   注意:如我们之前的出版物所示，结构的分辨率不受高温¹²的影响。

结果

低放大倍率概览如图 5A，B所示。面板 A 是成功网格的一个示例。从左上角（较厚）到右下角（较薄或空）有一个冰梯度。这样的网格可以更容易地在适合数据收集的中间区域找到合适厚度的冰层，例如蓝色和绿色框。网格 B 太干。网格中的方块具有明亮的对比度，这意味着冰层太薄或根本没有冰层。只有红色箭头指示的两个方块适合数据收集。

讨论

在协议的步骤1中，确保离心管安装良好，并且在实验进行时不会掉落。由于腔室内积聚了大量的水滴，会改变滤纸的吸附能力，建议玻璃化装置腔达到平衡温度后，实验的总时间不应超过30分钟。如果操作时间超过30分钟，操作人员需要更换滤纸，等待机舱再次平衡温度和湿度。在协议的第8步，建议的7-9μL样品体积比平时大，因为否则，样品在高温下会迅速蒸发，导致网格上出现空方块。另一方?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Falcon tube	Falcon	352070	size: 50 mL
Filter paper	Ted Pella	47000-100	Ø55/20mm, Grade 595
HI1210	Leica		water bath
K100X	Electron Microscopy Sciences		glow discharge
Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid	Ted Pella	658-200-CU-100
Titan Krios G3	Thermo Fisher Scientific	1063996	low dose imaging
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	1086439
Vitrobot Tweezer	Ted Pella	47000-500