Подготовка высокотемпературных сеток для отбора проб для крио-ЭМ

Резюме

В этой статье представлен подробный протокол подготовки сеток для образцов при температурах до 70 °C перед погружением замораживания для крио-ЭМ-экспериментов.

Аннотация

Сетки образцов для экспериментов криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) обычно готовят при температуре, оптимальной для хранения биологических образцов, в основном при 4 °C и иногда при комнатной температуре. Недавно мы обнаружили, что структура белка, решенная при низкой температуре, может быть функционально неактуальной, особенно для белков из термофильных архей. Была разработана процедура подготовки образцов белка при более высоких температурах (до 70 °C) для крио-ЭМ-анализа. Мы показали, что структуры из образцов, полученных при более высоких температурах, функционально значимы и зависят от температуры. Здесь мы опишем подробный протокол подготовки пробных сеток при высокой температуре, используя в качестве примера 55 °C. В эксперименте использовали витрификационный аппарат, модифицированный с использованием дополнительной центрифужной трубки, и образцы инкубировали при 55 °C. Подробные процедуры были точно настроены, чтобы свести к минимуму конденсацию пара и получить тонкий слой льда на сетке. Приведены примеры успешных и неудачных экспериментов.

Введение

Крио-ЭМ-технология решения структур белковых комплексов продолжала совершенствоваться, особенно в направлении получения структур высокого разрешения ^1,2. В то же время ландшафт его применения также был расширен за счет изменения условий отбора проб, таких как рН или лиганды, до процесса витрификации³, который включает в себя подготовку сеток образцов с последующим погружным замораживанием ^4,5. Еще одним важным условием является температура. Хотя крио-ЭМ-эксперименты, такие как рентгеновская кристаллография, выполняются при низких температурах, структура, решаемая крио-ЭМ, отражает структуру в состоянии раствора до витрификации. До недавнего времени в большинстве крио-ЭМ-исследований анализа одиночных частиц (SPA) использовались образцы, которые хранятся на льду (т.е. при 4 °C) до витрификации⁶, хотя в ряде исследований используются образцы при комнатной температуре около 7,8,9,10 или до 42 °C ¹¹. В недавнем отчете мы провели температурно-зависимые исследования фермента кетол-кислотной редуктоизомеразы (KARI) из термофильного археона Sulfolobus solfataricus (Sso) при шести различных температурах от 4 ° C до 70 ° C¹². Наши исследования показывают, что важно готовить сетки образцов при функционально значимых температурах и что крио-ЭМ является единственным структурным методом, который практически осуществим для решения структуры одного и того же белкового комплекса при нескольких температурах.

Основная трудность для витрификации при высоких температурах заключается в минимизации конденсации пара и достижении тонкого льда. Здесь мы сообщаем о подробном протоколе, используемом для подготовки сеток образцов при высоких температурах в нашем предыдущем исследовании Sso-KARI ¹². Мы предполагаем, что читатели или зрители уже имеют опыт в общих процедурах подготовки образцов и обработки данных для крио-ЭМ-экспериментов, и подчеркиваем аспекты, относящиеся к высокой температуре.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол направлен на использование модифицированного коммерческого витрификационного аппарата для подготовки образцов криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) при определенных температурах, особенно выше 37 °C. Общая экспериментальная установка показана на рисунке 1. В качестве примера протокол использует 55 °C. Конкретные условия при других температурах см. в Дополнительной таблице 2 в ссылке¹².

1. Подготовка витрификационного аппарата

1. Сделайте отверстие размером 1 см в трубке центрифуги объемом 50 мл на ее закрытом конце.
2. Поместите трубку в камеру витрификационного аппарата на выходе ультразвуковой воды, как показано на рисунке 2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы свести к минимуму конденсацию воды, направляя водяной пар в теплообменник через трубку, прежде чем достичь всей камеры.
3. Установите температуру витрификационного аппарата на указанную температуру (например, 55 °C, как показано на фиг.3) и позвольте камере устройства витрификации достичь 55 °C и 100% относительной влажности. Дайте ему постоять не менее получаса, чтобы стабилизировать условия перед началом эксперимента.

2. Разогрев образца и инструментов

1. Поставьте водяную баню на конфорку и установите конфорку на нужную температуру (здесь 55 °C). Проверьте с помощью термометра, чтобы убедиться, что вода достигает 55 °C.
2. Высиживайте образец на водяной бане и разогрейте наконечник пипетки на краю конфорки в течение 2 мин или дольше перед экспериментом по промоканию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Самая высокая температура для камеры витрификационного аппарата составляет 60 °C. Для подготовки высокотемпературных решеток для эксперимента с циро-ЭМ (например, 70°С) образец инкубируют на водяной бане при 80°С, и среднее значение между температурой образца и температурой витрификационного аппарата оценивается как фактическая температура образца на сетке (в данном случае 70°С). Смотрите раздел Обсуждение для получения более подробной информации и ограничений на эту оценку.

3. Подготовка к эксперименту по блоттингу

1. Тлеющий разряд представляет собой дырявую углеродную сетку при 25 мА в течение 30 с, или альтернативную значениям в зависимости от используемого устройства.
2. Инкубировать пинцет сеткой в витрификационном аппарате в течение 2 мин или дольше.
3. Наполните контейнер с этаном этаном в соответствии со стандартными процедурами. Не допускайте переполнения этана.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает около 10 минут и должен немедленно сопровождаться экспериментом по промоканию, чтобы избежать замерзания.
4. Поместите фильтровальную бумагу для витрификации в камеру витрификационного аппарата не ранее, чем за 5 минут до эксперимента по промоканию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Помещение фильтровальной бумаги в камеру слишком рано приведет к тому, что она станет слишком влажной.

4. Эксперимент с блоттингом

ПРИМЕЧАНИЕ: При удержании сетки убедитесь, что сетка стабильна и имеет минимальную площадь контакта с пинцетом (рисунок 4). Это делается для поддержания наилучшей эффективности охлаждения этана и избегания нестекретного льда.

1. Используйте наконечник пипетки, чтобы нанести 7-9 мкл образца на сетку. Затем подождите 1-2 с, промокните 1-1,5 с и быстро окуните образец в жидкий этан.
2. Перенесите сетку из жидкого этана в криокроб, который хранится в жидком азоте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен очень осторожно, потому что пинцет все еще горячий, поэтому весь охлаждающий бак в это время полон пара.

5. Проверка качества сеток

1. Обрежьте сетки и загрузите их на крио-ЭМ-инструмент.
2. Используйте экран дисплея крио-ЭМ-прибора и функцию низкой дозы программного обеспечения для скрининга состояния льда на сетке и распределения образца по сетке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Часто сетки очень сухие, или слой льда слишком толстый. Успешность сеток, приготовленных при высоких температурах, значительно ниже, чем при комнатной температуре или 4 °C. Репрезентативные результаты хороших и неудовлетворительных сеток показаны в следующем разделе.
3. Если качество полученной сетки не очень хорошее, повторите процесс подготовки сетки с различными условиями (такими как время ожидания, время промокания и т. Д.). Если качество полученной сетки хорошее, повторите те же шаги, чтобы сделать сетки при другой температуре.

6. Сбор данных

1. Перенесите сетки хорошего качества на крио-ЭМ-прибор высокого разрешения.
2. Осуществлять сбор и анализ данных в соответствии с установленными процедурами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как показано в нашей предыдущей публикации, разрешение конструкции не зависит от высокой температуры¹².

Результаты

Обзор низкого увеличения показан на рисунке 5A,B. Панель A является примером успешной сетки. Есть градиент льда сверху слева (толще) до нижнего правого (тоньше или пустее). Такая сетка облегчает поиск подходящей толщины ледяного слоя в средней области, подходящей ?...

Обсуждение

На шаге 1 протокола убедитесь, что трубка центрифуги установлена хорошо и не падает во время эксперимента. В связи с накоплением в камере большого количества капель воды, которые могли изменить адсорбционную способность фильтровальной бумаги, рекомендуется, чтобы общее время эксперим?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Falcon tube	Falcon	352070	size: 50 mL
Filter paper	Ted Pella	47000-100	Ø55/20mm, Grade 595
HI1210	Leica		water bath
K100X	Electron Microscopy Sciences		glow discharge
Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid	Ted Pella	658-200-CU-100
Titan Krios G3	Thermo Fisher Scientific	1063996	low dose imaging
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	1086439
Vitrobot Tweezer	Ted Pella	47000-500