JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوضح هذا البروتوكول تصوير ديكستران في الخلايا الحية باستخدام الامتصاص المستمر والصور العكسية لتحسين تصور الكشكشة ونضج الماكروبينوسوم وتحليل ديكستران وملصقات الخلايا الأخرى.

Abstract

كثرة الخلايا العصبية هي عملية محفوظة للغاية ولكنها لا تزال غير مفهومة تماما وهي ضرورية لامتصاص وابتلاع السوائل والمغذيات في الطور السائل والمواد الأخرى في الخلايا. يعد الامتداد الدراماتيكي للكشكشة على سطح الخلية ، وإغلاقها لتشكيل الماكروبينوسومات ، ونضج الماكروبينوسومات الداخلية أحداثا رئيسية في هذا المسار قد يكون من الصعب التقاطها باستخدام التصوير متحد البؤر التقليدي القائم على تتبع بلعة من البضائع الفلورية. تستخدم دكسترونات الفلورسنت بشكل شائع تجريبيا كعلامات طور السوائل للماسروبينوسومات وللمسارات الداخلية الأخرى. تتضمن الطريقة التي اعتمدها المختبر لتحسين تصوير امتصاص ديكستران استخدام التصوير الحي للخلايا المغمورة بتركيزات عالية من ديكستران الفلورسنت في الوسط ، مع ظهور الخلايا غير المسماة بارزة (باللون الأسود). يتم تمييز كشكشة الخلية لتصور إغلاق الكشكشة ، وتظهر الماكروبينوسومات الداخلية على شكل فجوات فلورية في داخل الخلية. هذه الطريقة هي الأمثل لتصور ميزات الماكروبينوسوم وتسمح بسهولة التجزئة والقياس الكمي. تصف هذه الورقة الملصقات المزدوجة للمسارات ذات الديكستران ذات الأحجام المختلفة والتعبير المشترك عن مجسات الدهون وبروتينات الغشاء الفلوري لتمييز الماكروبينوسومات والجسيمات الداخلية الأخرى. كما تم توضيح اكتشاف ديكستران الداخلي على مستوى البنية التحتية باستخدام الضوء المترابط والفحص المجهري الإلكتروني (CLEM). يمكن تصوير هذه العمليات الخلوية باستخدام طرق تصوير حية متعددة ، بما في ذلك ثلاثية الأبعاد. مجتمعة ، تعمل هذه الأساليب على تحسين تصوير الماكروبينوسوم للعديد من الإعدادات والأنظمة التجريبية المختلفة.

Introduction

تشترك معظم أنواع الخلايا الفقارية في القدرة الفطرية على الامتصاص غير الانتقائي للسوائل مع أسلافها طوال التطور ، والتي يعود تاريخها إلى الأميبا أحادية الخلية1. تستخدم الأميبا هذه العملية المحفوظة للغاية لامتصاص طور السوائل عن طريق كثرة الخلايا الكبيرة (الشرب الكبير) في المقام الأول لاكتساب المغذيات1 ، بينما في الخلايا الفقارية ، يمكن أن تكون بالمثل طريقا للإمداد للحصول على العناصر الغذائية تحت الضغط ، وتستخدمها الخلايا المناعية لأخذ العينات ومراقبة بيئات الأنسجة2. يتميز كثرة الخلايا العصبية بميزات تميزه عن الأشكال الأخرى للالتقام الخلوي ، بما في ذلك الماكروبينوسومات المميزة الكبيرة (التي يبلغ قطرها >0.2 مم) الشبيهة بالفراغ ، والطبيعة غير الانتقائية لامتصاص السوائل والمذاب والمساحات المصاحبة لغشاء البلازما التي يتم استيعابها بشكل انتهازي في الماكروبينوسومات3. تعني الطبيعة غير الانتقائية لهذا الامتصاص أن الفرز وإعادة التدوير يجب أن يحدث بسرعة لإنقاذ البروتينات الأساسية القابلة للذوبان وغشاء البلازما عن طريق إعادة تدويرها مرة أخرى إلى سطح الخلية. الكثير من المواد التي يتم أخذها في الماكروبينوسومات مخصصة للتحلل في الجسيمات الحالة ، ويتم توجيهها إلى مسارات داخلية / ليزوزومية من خلال نضوج الماكروبينوسوم والاندماج مع الجسيمات الداخلية الأخرى. يمكن أيضا إعادة تدوير بروتينات غشاء البلازما مرة أخرى إلى سطح الخلية من الماكروبينوسومات. هناك اهتمام كبير في مجال السرطان لفهم عملية كثرة الخلايا الكبيرة ، والتي يتم تنشيطها في الخلايا السرطانية وتساعد على الحفاظ على تغذيتها وتكاثرها2،4،5،6. يحدث كثرة الغشاء بشكل أساسي ويمكن أن يحدث بشكل أكبر عند التحفيز بوساطة المستقبلات في الخلايا المناعية ، حيث تستضيف الماكروبينوسومات إشارات المستقبلات ، وتساهم في المعالجة الداخلية / الليزوزومية لعرض المستضد وتوفر بوابة دخول لمجموعة متنوعة من الفيروسات والبكتيريا ومسببات الأمراض الأخرى3،7.

تحتوي الماكروبينوسومات على عدد قليل من العلامات المميزة أو الفريدة. يمكن التعرف عليها بسهولة أكبر أثناء تكوينها عند قاعدة الكشكشة السطحية للخلية الدراماتيكية الغنية بالأكتين ، والتي تقترب من سائلالابتلاع 8. مباشرة بعد الإغلاق ، يتم إزالة بلمرة F-actin حول الماكروبينوسومات ، وتخضع الماكروبينوسومات نفسها لتغيرات ديناميكية مرتبطة بالاندماج المتجانس وغير المتجانس ، والأنابيب ، والانكماش9. يصعب أيضا تحديد Macropinosomes على مستوى البنية التحتية نظرا لعدم وجود طبقات مميزة أو ميزات أخرى وتظهر ببساطة على شكل فجوات بأحجام مختلفة. بدون علامات غشائية نهائية ، يتم تعريف الماكروبينوسومات بسهولة وتقليدية من خلال حمولتها السائلة ، والتي تتم تجريبيا من خلال استخدام ديكستران الفلورسنت. ديكستران عبارة عن عديد السكاريد المعقد المشتق من الجلوكوز والذي يمكن إقرانه بمجموعة كبيرة من العلامات الفلورية أو كثيفة الإلكترون وإضافته إلى الوسط لامتصاصه بواسطة الخلايا أو تقويه لامتصاصه في الأنسجة. علاوة على ذلك ، يعتبر ديكستران الوزن الجزيئي الكبير (MW) (70 كيلو دالتون) الآن شحنة انتقائية للحجم للماسكروبينوسومات لأنه لا يدخل حويصلات داخلية أخرى أصغر حجما ، وقد أصبح التسمية الأكثر شيوعا لكثرة الخلاياالكبيرة 10،11. عادة ما يتضمن عرض كثرة الخلايا الكبيرة احتضان الخلايا بنبض من ديكستران الفلورسنت واستخدام الخلايا الثابتة أو الحية للتصوير الفلوري لعرض بلعة ملصقات ديكستران داخل الخلايا في الماكروبينوسومات. نظرا لحجمها الكبير ، يمكن أيضا عرض الماكروبينوسومات غير المسماة في بعض أنواع الخلايا باستخدام تباين الطور أو الفحص المجهري للمجال الساطع ، حيث تظهر الماكروبينوسومات على شكل فجوات بيضاء فارغة كبيرة. يتم الحصول على بعض المعلومات السياقية من صور تباين الطور للخلايا ، ويمكن بعد ذلك تراكب هذه الصور بصور مضان لتصوير امتصاص ديكستران الفلورسنت12،13. يمكن استخدام Dextrans بأحجام مختلفة وذات ملصقات مميزة لمراقبة امتصاص السوائل في مسارات خلوية وخلوية متعددة10،14،15 ويمكن تطبيق dextran على مزارع الخلايا أو نقرها في الفئران للتصوير داخل الحيوية16 أو حتى حقنها في أجنة الذباب17 للتصوير الحي.

تشمل بعض الصعوبات التي يتم تكبدها في استخدام ديكستران لتتبع الماكروبينوسومات تسربه من الماكروبينوسومات بعد تثبيت الخلايا أو نفاذيتها ، ومستويات مخففة أو يصعب اكتشافها في الخلايا التي لا تؤدي كثرة الخلايا الكبيرة العدوانية ، ونشرها الديناميكي وتشتتها داخل الخلايا أثناء نضوجالماكروبينوسوم 3. تتفاقم هذه المشكلات في معظم التجارب المصممة لتتبع امتصاص نبضة واحدة من ديكستران تضاف إلى الخلايا ثم يتم غسلها.

بدلا من ذلك ، تصف هذه الورقة مزايا تطبيق ديكستران الفلورسنت على الخلايا وتركه في الوسط أثناء التصوير الحي لتسجيل الامتصاص المستمر في الخلايا. يؤدي هذا إلى تضخيم إشارة ديكستران في الماكروبينوسومات والجسيمات الداخلية اللاحقة التي تظهر مسار النضج بالكامل. إن عرض الماكروبينوسومات المسمى مقابل الجزء الداخلي (الأسود) غير المسمى للخلايا ، كإعداد عكسي عالي التباين ، يكشف عن جميع ميزات الماكروبينوسومات ، وعلى العكس من ذلك ، خارج الخلايا ، يسلط الوسط الفلوري العالي الضوء على الكشكشة الديناميكية لسطح الخلية. تصف هذه الطريقة التصوير الحي للديكستران للتصوير المجهري الضوئي ومتحد البؤر واكتشافه بعد تثبيت الخلية بواسطة الضوء المترابط والفحص المجهري الإلكتروني (CLEM). تم إجراء التصوير المتضمن هنا على أنواع مختلفة من الخلايا لإثبات قابلية التطبيق الواسع لهذه الأساليب ، بما في ذلك البلاعم المنشطة والخلايا الدبقية الدقيقة ، حيث يكون كثرة الخلايا الدبقية نشطا وسريعا للغاية ، وفي الخلايا السرطانية حيث يكون كثرة الخلايا الصغيرة أقل وفرة نسبيا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تحضير الخلايا على أطباق ذات قاع زجاجي 35 مم (اليوم 0)

  1. الحفاظ على خطوط الخلايا وتمريرها في وسط كامل مكمل بنسبة 10٪ معطل حراريا (ل RAW264.7) أو مصل ربلة الساق الجنينية العادي و 1٪ L-glutamine ، عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب 5٪ CO2 .
  2. قم بلوحة العدد المناسب من الخلايا لتحقيق التقاء بنسبة 60٪ في 24 ساعة ، على أطباق ذات قاع زجاجي 35 مم.
    ملاحظة: تتراوح كثافة الخلايا الموصى بها بين 2 مل من 0.15 × 106 خلايا / مل إلى 0.25 × 106 خلايا / مل لخلايا سرطان الثدي RAW264.7 و BV2 microglial و MDA-MB 231 خلايا سرطان الثدي الموضحة هنا.

2. تعداء بلازميد الحمض النووي الفلوري (اليوم 1) - اختياري

ملاحظة: يمكن التعبير عن البروتينات والمجسات المختلفة ذات العلامات الفلورية بشكل عابر أو ثابت في خطوط الخلايا المستنسخة لتسمية كشكشة الأكتين والمقصورات في المسار الداخلي على وجه التحديد مثل الجسيمات الداخلية المبكرة أو الجسيمات الداخلية المتأخرة أو الجسيمات الحالة

  1. قم بنقل الخلايا باستخدام مجموعة تعداء قائمة على الدهون وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، بعد يوم واحد من الطلاء في غطاء زراعة الأنسجة.
  2. تمييع 2 ميكروغرام من بلازميد الحمض النووي المنقى الخالي من السموم الداخلية في 125 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسائط الأساسية (مصل مخفض). تخلط برفق وتترك لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. تخفيف 5 ميكرولتر من عامل التعدي في 125 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسائط الأساسية (مصل مخفض). تخلط برفق وتترك لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. اجمع بين بلازميد الحمض النووي المخفف وكاشف التعداء المخفف واحتضانه لمدة 10 دقائق أخرى قبل إضافته بالتنقيط إلى الخلايا.
  5. احتضان الخلايا بمركب التعداء عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 مرطبة بنسبة 5٪ لمدة 3-4 ساعات ، قبل استبدالها بوسط ثقافة كامل طازج.
  6. استخدم الخلايا المنقولة في اليوم التالي لإجراء التجارب أو تخضع لاستنساخ التخفيف المحدود للحصول على خطوط الخلايا المعبرة بثبات.

3. تصور الحويصلات الداخلية والماكروبينوسومات (اليوم 2)

ملاحظة: يتم استخدام ديكستران الفلورسنت (ديكستران أليكسا فلور 488/647 عند 10 كيلو دالتون ميجاوات ، و Dextern Oregon Green 488 / Tetramethylrhodamine عند 70 كيلو دالتون ميجاوات ، أنيوني ، ليسين قابل للإصلاح) من الأوزان الجزيئية المختلفة لمراقبة امتصاص طور السوائل في مجموعة من المسارات الداخلية14. 70 كيلو دالتون ديكستران للماكروبينوزومات و 10 كيلو دالتون لجميع المسارات.

  1. قم بإعداد ديكستران (ديكستران) كمعلق مركز 2x عند 200-500 نانوغرام / مل في وسط مزرعة مسخن مسبقا لإضافته إلى الخلايا.
  2. اختياري: قد تتطلب التجارب إضافة مقبلة أو متزامنة للمكملات الغذائية أو الأدوية للتأثير على نشاط الخلايا الداخلية. على سبيل المثال ، المعالجة المسبقة للبلاعم والخلايا الدبقية الدقيقة بعوامل النمو (على سبيل المثال ، 200 نانوغرام / مل CSF-1) أو تنشيط الروابط (على سبيل المثال ، LPS 100 نانوغرام / مل أو 300 نانوغرام / مل CpG) لتعزيز الكشكشة وكثرة الكثرة. استزراع الخلايا السرطانية في وسط مناسب خال من المصل لمدة 12-16 ساعة قبل امتصاص الديكستران في الوسط الكامل. راجع الخطوة 1.2 لمعرفة كثافة الخلايا الموصى بها.
  3. للتحضير للتصوير الحي ، ضع الخلايا المزروعة في أطباق ذات قاع زجاجي على مسرح مجهر متحد البؤر المقلوب المزود بوسادة تسخين 37 درجة مئوية وحاضنة مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 .
  4. استنشق الوسط الزائد ، تاركا 500 ميكرولتر من الوسط الكامل في الطبق السفلي الزجاجي.
  5. ابحث عن منطقة مناسبة من الخلايا واضبط التركيز. للتصوير بفاصل زمني ، حدد مسبقا ليزر التألق المناسب والمرشحات والإعدادات قبل الاستحواذ. استخدم الإعدادات التالية لحل الخلايا الفردية والماكروبينوسومات.
    1. قم بتصوير منطقة الاهتمام على مجهر متحد البؤر المقلوب بهدف خطة الغمر بالزيت 63 × 1.4 NA.
    2. حدد 512 × 512 لحجم الصورة ، والمسح الضوئي ثنائي الاتجاه للتصوير السريع.
    3. ركز على المستوى البؤري الفردي للخلايا. اضبط على الالتقاط كشريحة واحدة أو قم بتعيين سمك شريحة بصري (Nyquist) يبلغ حوالي 0.3 ميكرومتر ليتم دمجها كمجموعات Z.
    4. حدد اللقطات المتتابعة بفاصل زمني 5 ثوان ، لمدة تتراوح بين 20-45 دقيقة اعتمادا على أنواع خلايا معينة.
    5. حدد التركيز البؤري التلقائي للأجهزة / تتبع التركيز البؤري للمساعدة في تثبيت الصورة أثناء الالتقاط لمدة مناسبة وفقا لأنواع الخلايا المحددة.
    6. أضف حجما متساويا من 2x dextaren spiked medium وابدأ التقاط الصور الحية على الفور للبلاعم. انتظر 20 دقيقة قبل تصوير الامتصاص البطيء في خلايا MDA-MB 231.
      ملاحظة: باستخدام هذه الطريقة ، تم تصوير خلايا BV2 مع قناتين فلوروفوريتين بنجاح على مستوى واحد مع تتبع أقصى سرعة ، بشكل مستمر لمدة 45 دقيقة عند إضافة خليط ديكستران. للكشف عن الماكروبينوسومات المبكرة في خلايا RAW 264.7 ، حيث يحدث كثرة الكثرة بسرعة كبيرة ، احصل على شريحة واحدة (للتصوير السريع) أو كومة Z من 4-6 شرائح (للالتقاط ثلاثي الأبعاد) والفاصل الزمني بفاصل زمني 5 ثوان لمدة 20 دقيقة عند إضافة ديكستران. بالنسبة لخلايا MDA-MB 231 ، احصل على مكدسات Z المثلى بين 10-15 شريحة ، بفواصل زمنية 5 ثوان لمدة 40 دقيقة.

4. الضوء المترابط والفحص المجهري الإلكتروني (CLEM) (اليوم 3) - اختياري

  1. قم بإعداد الخلايا وفقا للخطوات 1 و 2 و 3 من البروتوكول مع التعديلات. باختصار ، قم بزراعة 0.2 × 106 خلايا / مل RAW264.7 خلية على أطباق ذات قاع زجاجي شبكي (طبق 35 مم ، رقم 1.5 غطاء شبكي ، قطر زجاجي 14 مم ، غير مطلية) ، شفاف ببلازميد فلورسنت (على سبيل المثال ، mCherry-2xFYVE) واتركه طوال الليل قبل إضافة ديكستران -488 (70 كيلو دالتون) لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ حاضنة مرطب من ثاني أكسيد الكربون2 .
  2. اغسل الخلايا بسرعة باستخدام 1 مل من PBS المثلج وثبته باستخدام 0.1٪ جلوتارالديهايد.
  3. احصل على صور الخلايا الثابتة ل dextran-488 و mCherry-2xFYVE على مجهر متحد البؤر.
  4. التقط صورا للمجال الساطع لتحديد مواضع الشبكة قبل معالجة الأطباق للفحص المجهري الإلكتروني للإرسال (EM) كما هو موضح سابقا18. باختصار ، علاوة على ذلك ، قم بإصلاح الخلايا في 2.5٪ جلوتارالديهايد ، ولاحق في 1٪ من رابع أكسيد الأوزميوم المخفض ، وصمة عار en-bloc مع 2٪ أسيتات اليورانيل ، ثم تجفيفها من خلال سلسلة من الإيثانول قبل تضمينها في راتنج LX112. استئصال المواقع الشبكية من الكتلة واجمع الأقسام الرقيقة جدا باستخدام ميكروتوم فائق. التقط الصور على مجهر إلكتروني عند 80 كيلو فولت باستخدام برنامج نظام التصوير المناسب.

5. معالجة البيانات وتصورها (اليوم 4)

ملاحظة: تستخدم فيجي - حزمة تحليل الصور مفتوحة المصدر - للتصور والتحليل33.

  1. قم بتكرار البيانات الأولية لمعالجتها لتتوافق مع مبادئ بيانات F.A.I.R. ، أي أن بيانات البحث يمكن العثور عليها ويمكن الوصول إليها وقابلة للتشغيل البيني وقابلة لإعادة الاستخدام.
  2. اضبط السطوع والتباين لمجموعات الصور بالتساوي باستخدام بيانات الرسم البياني.
  3. اعرض الصور كإسقاطات قصوى للكثافة من صور Z-stack التي تم الحصول عليها.
  4. إدراج شريط مقياس لمجموعات الصور.
  5. اقتصاص / تدوير بيانات مجال الرؤية (اختياري). إنشاء لوحات تمثيلية لبيانات السلاسل الزمنية.
  6. لمزيد من التحليل والقياس الكمي ، حدد كثافة مضان ديكستران المأخوذ في الخلايا كمقياس لنشاط كثرة الكريات الكبيرة. لقصر التحليل على الخلايا الفردية ، استخدم طريقة التصوير الموضحة هنا.
    1. اقلب جدول البحث لقلب اللون لمناطق الخلايا الخالية من التألق لأداء العتبة.
    2. قم بتقسيم الكائن الأمامي وإنشاء قناع خلية لتحديد الخلايا الفردية.
    3. استخدم قناع الخلية جنبا إلى جنب مع الطريقة19 المنشورة سابقا التي تحدد وتقيس الماكروبينوسومات الفردية. استخدم هذه المقاييس لتحديد كثرة النواة الكبيرة ، بما في ذلك الحجم والعدد والامتصاص الكلي لكل خلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

إن نهج تصوير الخلايا الحية غير المسماة المغمورة في تركيز عال من ديكستران الفلورسنت له العديد من المزايا مقارنة بتقنيات التصوير التقليدية لتتبع كثرة الخلايا الكبيرة. من خلال تقديم الصور بشكل مريح ، تظهر أجسام الخلايا باللون الأسود وتسمح بتصور محسن لسطح الخلية الدراماتي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تصف هذه الورقة الاختلافات في الطرق الأكثر تقليدية لاستخدام ملصقات ديكستران لتتبع كثرة الخلايا الكبيرة ، بناء على التصوير الحي للخلايا المغمورة باستمرار في ديكستران (ديكستران) الفلورسنت وتصور الامتصاص على الخلفية السوداء للخلايا غير المصنفة. يوفر البروتوكول المحسن وس?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

يشكر المؤلفان تاتيانا خروميخ على مساعدتها الفنية المتخصصة. تم إجراء التصوير الفلوري في الفحص المجهري IMB الذي يتضمن مرفق البنية التحتية والوظيفة للسرطان الممول من المؤسسة الأسترالية لأبحاث السرطان. تم إجراء الفحص المجهري الإلكتروني في مركز الفحص المجهري والتحليل المجهري بجامعة كوينز. تم تلقي التمويل من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا (JLS APP1176209) ومجلس البحوث الأسترالي (DP180101910). يتم دعم NDC كعالم تصوير CZI من خلال المنحة رقم 2020-225648 من مبادرة Chan Zuckerberg DAF ، وهو صندوق استشاري لمؤسسة مجتمع وادي السيليكون. تم دعم YH من خلال منحة دكتوراه من الحكومة الأسترالية وبتمويل من برنامج أبحاث Yulgilbar Alzheimer. تم دعم Z-JX من قبل منحة الأكاديمية الصينية للعلوم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2% Osmium TetroxideProSciTechEMS19192
647-TransferrinMolecular Probes, Invitrogen  T23366
BV2 cellsGift kindly given to us by Dr Liviu Bodea (Queensland Brain Institute)-
CpG (Class B) BIntegrated DNA TechnologiesCustom Order
Dextran Alexa Fluor 488  at 10 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD22910
Dextran Alexa Fluor 647  at 10 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD22914
Dextran Oregon Green 488 at 70 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD1818
Dextran Tetramethylrhodamine at 70 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD7173
DMEM medium with sodium pyruvate and L-glutamineGibco Invitrogen#11995
Fetal Calf serumInterpath Services Pty LtdSFBS-F
Glutaraldehyde aqueous solution, EM Grade 25%ProSciTechC002
Jeol 1011 electron microscopeJEOL-
L-GlutamineGibco Invitrogen25030081
Lipofectamine 2000Gibco Invitrogen11668019
MatTek  Glass Bottom Dish 35 mm, uncoated gridMatTek CorporationP35G-2-14-CGRD
MatTek glass bottom dishes 35 mm uncoatedMatTek CorporationP35G-1.5-14C
MDA-MB 231 cellsATCCHTB-26
Opti-MEM reduced serum mediumThermo Fisher Scientific31985088
Plasmid mCherry-2XFYVEGift kindly given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)-
Plasmid mCherry-PLCδ-PHGift kindly given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)-
Raw264.7 cellsATCCTIB-71
RPMI medium 1640,without L-glutamineGibco Invitrogen#21870
Ultrapure LPSJomar Life Research Pte LtdTLR-3PELPS
Uranyl AcetateProSciTechC079
Zeiss inverted LSM880 confocal microscopeZeiss-

References

  1. King, J. S., Kay, R. R. The origins and evolution of macropinocytosis. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1765), 20180158(2019).
  2. Stow, J. L., Hung, Y., Wall, A. A. Macropinocytosis: Insights from immunology and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 65, 131-140 (2020).
  3. Kerr, M. C., Teasdale, R. D. Defining macropinocytosis. Traffic. 10 (4), 364-371 (2009).
  4. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
  5. Kim, S. M., et al. PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells. Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).
  6. Recouvreux, M. V., Commisso, C. Macropinocytosis: A metabolic adaptation to nutrient stress in cancer. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 8, 261(2017).
  7. Stow, J. L., Condon, N. D. The cell surface environment for pathogen recognition and entry. Clinical & Translational Immunology. 5 (4), 71(2016).
  8. Swanson, J. A., Watts, C. Macropinocytosis. Trends in Cell Biology. 5 (11), 424-428 (1995).
  9. Buckley, C. M., King, J. S. Drinking problems: mechanisms of macropinosome formation and maturation. FEBS Journal. 284 (22), 3778-3790 (2017).
  10. Berthiaume, E. P., Medina, C., Swanson, J. A. Molecular size-fractionation during endocytosis in macrophages. Journal of Cell Biology. 129 (4), 989-998 (1995).
  11. Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. Macropinocytosis in different cell types: Similarities and differences. Membranes (Basel). 10 (8), 177(2020).
  12. Pacitto, R., Gaeta, I., Swanson, J. A., Yoshida, S. CXCL12-induced macropinocytosis modulates two distinct pathways to activate mTORC1 in macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 101 (3), 683-692 (2017).
  13. Yoshida, S., Pacitto, R., Yao, Y., Inoki, K., Swanson, J. A. Growth factor signaling to mTORC1 by amino acid-laden macropinosomes. Journal of Cell Biology. 211 (1), 159-172 (2015).
  14. Chvanov, M., et al. Intracellular rupture, exocytosis and actin interaction of endocytic vacuoles in pancreatic acinar cells: initiating events in acute pancreatitis. Journal of Physiology. 596 (13), 2547-2564 (2018).
  15. Ballesteros, A., Swartz, K. J. Dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), e60769(2020).
  16. Weigert, R. Imaging the dynamics of endocytosis in live mammalian tissues. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (4), 017012(2014).
  17. Chen, L., et al. A novel method to image macropinocytosis in vivo. Frontiers in Neuroscience. 12, 324(2018).
  18. King, N. P., et al. Soluble NSF attachment protein receptor molecular mimicry by a Legionella pneumophila Dot/Icm effector. Cellular Microbiology. 17 (6), 767-784 (2015).
  19. Condon, N. D., et al. Macropinosome formation by tent pole ruffling in macrophages. Journal of Cell Biology. 217 (11), 3873-3885 (2018).
  20. Lemmon, M. A. Pleckstrin homology (PH) domains and phosphoinositides. Biochemical Society Symposium. 74, 81-93 (2007).
  21. Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO Journal. 19 (17), 4577-4588 (2000).
  22. Mayle, K. M., Le, A. M., Kamei, D. T. The intracellular trafficking pathway of transferrin. Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (3), 264-281 (2012).
  23. Hacker, U., Albrecht, R., Maniak, M. Fluid-phase uptake by macropinocytosis in Dictyostelium. Journal of Cell Science. 110, Pt 2 105-112 (1997).
  24. Wall, A. A., et al. Small GTPase Rab8a-recruited Phosphatidylinositol 3-Kinase gamma regulates signaling and cytokine outputs from endosomal toll-like receptors. Journal of Biological Chemistry. 292 (11), 4411-4422 (2017).
  25. Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
  26. Swanson, J. A., Yoshida, S. Macropinosomes as units of signal transduction. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1765), 20180157(2019).
  27. Schnatwinkel, C., et al. The Rab5 effector Rabankyrin-5 regulates and coordinates different endocytic mechanisms. PLoS Biology. 2 (9), 261(2004).
  28. Yeo, J. C., Wall, A. A., Luo, L., Stow, J. L. Sequential recruitment of Rab GTPases during early stages of phagocytosis. Cellular Logistics. 6 (1), 1140615(2016).
  29. Racoosin, E. L., Swanson, J. A. Macropinosome maturation and fusion with tubular lysosomes in macrophages. Journal of Cell Biology. 121 (5), 1011-1020 (1993).
  30. Dolat, L., Spiliotis, E. T. Septins promote macropinosome maturation and traffic to the lysosome by facilitating membrane fusion. Journal of Cell Biology. 214 (5), 517-527 (2016).
  31. Kuhn, S., Lopez-Montero, N., Chang, Y. Y., Sartori-Rupp, A., Enninga, J. Imaging macropinosomes during Shigella infections. Methods. , 12-22 (2017).
  32. Kommnick, C., Lepper, A., Hensel, M. Correlative light and scanning electron microscopy (CLSEM) for analysis of bacterial infection of polarized epithelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 17079(2019).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CLEM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved