Fluorescência ao vivo, imagem inversa de frisação celular e macropinocitose

Resumo

Este protocolo demonstra imagens de dextrana em células vivas usando captação contínua e imagens inversas para otimizar a visualização de babados, maturação de macropinossomas e análise de dextrana e outras marcações celulares.

Resumo

A macropinocitose é um processo altamente conservado, mas ainda incompletamente compreendido, essencial para a absorção e ingestão de fluidos, nutrientes em fase fluida e outros materiais nas células. A extensão dramática dos babados da superfície celular, seu fechamento para formar macropinossomos e a maturação dos macropinossomos internalizados são eventos-chave nessa via que podem ser difíceis de capturar usando imagens confocais convencionais baseadas no rastreamento de um bolo de carga fluorescente. As dextranas fluorescentes são comumente usadas experimentalmente como marcadores de fase fluida para macropinossomos e para outras vias endocíticas. Um método que o laboratório adotou para otimizar a imagem da captação de dextrana envolve o uso de imagens ao vivo de células banhadas em altas concentrações de dextrano fluorescente no meio, com as células não marcadas aparecendo em relevo (como preto). Os babados celulares são destacados para visualizar o fechamento do babado, e os macropinossomos internalizados aparecem como vacúolos fluorescentes no interior da célula. Este método é ideal para visualizar características do macropinossomo e permite fácil segmentação e quantificação. Este artigo descreve a marcação dupla de vias com dextrans de tamanhos diferentes e a co-expressão de sondas lipídicas e proteínas de membrana fluorescentes para demarcar macropinossomos e outros endossomos. A detecção de dextrano internalizado em um nível ultraestrutural usando microscopia eletrônica e de luz correlativa (CLEM) também é demonstrada. Esses processos celulares podem ser visualizados usando várias modalidades de imagem ao vivo, inclusive em 3D. Juntas, essas abordagens otimizam a imagem de macropinossomos para muitos ambientes e sistemas experimentais diferentes.

Introdução

A maioria dos tipos de células de vertebrados compartilha a capacidade inata de absorção não seletiva de fluido com predecessores ao longo da evolução, remontando à ameba unicelular¹. Este processo altamente conservado de absorção em fase fluida pela macropinocitose (beber muito) é usado pela ameba principalmente para aquisição de nutrientes¹, enquanto em células de vertebrados, pode ser uma rota de fornecimento para a obtenção de nutrientes sob estresse, e é usado por células imunes para a amostragem e vigilância de ambientes de tecidos². A macropinocitose tem características que a distinguem de outras formas de endocitose, incluindo os macropinossomos vacuolares grandes e distintos (>0,2 mm de diâmetro), a natureza não seletiva da captação de fluidos e solutos e as extensões de membrana plasmática que são oportunisticamente internalizadas em macropinossomos³. A natureza não seletiva dessa absorção significa que a classificação e a reciclagem devem ocorrer rapidamente para resgatar proteínas essenciais solúveis e da membrana plasmática, reciclando-as de volta à superfície celular. Grande parte do material levado para os macropinossomos é destinado à degradação nos lisossomos e é canalizado para as vias endo/lisossômicas por meio da maturação dos macropinossomos e da fusão com outros endossomos. As proteínas da membrana plasmática também podem ser recicladas de volta à superfície celular a partir de macropinossomos. Há um intenso interesse no campo do câncer para entender o processo de macropinocitose, que é ativado nas células cancerígenas e ajuda a sustentar sua nutrição e proliferação 2,4,5,6. A macropinocitose ocorre constitutivamente e pode ser induzida pela estimulação mediada por receptores em células imunes, onde os macropinossomos hospedam a sinalização do receptor, contribuem para o processamento endo/lisossômico para apresentação de antígenos e fornecem um portal de entrada para uma variedade de vírus, bactérias e outros patógenos ^3,7.

Os macropinossomos têm poucos marcadores distintos ou únicos. Eles são mais facilmente identificados durante sua formação na base de babados dramáticos da superfície celular ricos em actina, que quase engolfam o fluido⁸. Imediatamente após o fechamento, a F-actina ao redor dos macropinossomos é despolimerizada e os próprios macropinossomos sofrem mudanças dinâmicas associadas à fusão, tubulação e encolhimento homo e heterotípicos⁹. Os macropinossomos também são difíceis de identificar em um nível ultraestrutural, uma vez que não têm revestimentos característicos ou outras características e aparecem simplesmente como vacúolos de tamanhos variados. Sem marcadores definitivos de membrana, os macropinossomos são mais rápida e tradicionalmente definidos por sua carga fluida, que experimentalmente é através do uso de dextrana fluorescente. O dextrano é um polissacarídeo complexo derivado da glicose que pode ser acoplado a uma grande variedade de marcadores fluorescentes ou elétron-densos e adicionado ao meio para absorção pelas células ou perfundido para captação nos tecidos. Além disso, o dextrano de grande peso molecular (MW) (70 kDa) é agora considerado uma carga seletiva de tamanho para macropinossomos, uma vez que não entra em outras vesículas endocíticas menores, e tornou-se o marcador mais comum para macropinocitose^10,11. A visualização da macropinocitose normalmente envolve a incubação de células com um pulso de dextrano fluorescente e o uso de células fixas ou vivas para imagens de fluorescência para visualizar o bolo de marcação de dextrana dentro das células em macropinossomos. Devido ao seu grande tamanho, os macropinossomos não marcados também podem ser visualizados em alguns tipos de células usando contraste de fase ou microscopia de campo claro, em que os macropinossomos aparecem como grandes vacúolos vazios brancos. Algumas informações contextuais são obtidas a partir das imagens de contraste de fase das células, e essas imagens podem ser sobrepostas adicionalmente com imagens de fluorescência para representar a captação de dextrana fluorescente ^12,13. Dextranas de diferentes tamanhos e com rótulos distintos podem ser usadas para monitorar a absorção de fluidos em múltiplas vias celulares e endocíticas ^10,14,15 e a dextrana pode ser aplicada a culturas de células ou perfundida em camundongos para imagens intravitais¹⁶ ou mesmo injetada em embriões de moscas¹⁷ para imagens vivas.

Algumas das dificuldades incorridas no uso do dextrano para rastrear macropinossomos incluem seu vazamento para fora dos macropinossomos após a fixação ou permeabilização das células, seus níveis diluídos ou difíceis de detectar em células que não realizam macropinocitose agressiva e sua implantação dinâmica e dispersão dentro das células durante a maturação do macropinossomo³. Esses problemas são agravados na maioria dos experimentos que são projetados para rastrear a absorção de um único pulso de dextrano adicionado às células e depois lavado.

Em vez disso, este artigo descreve as vantagens de aplicar dextrano fluorescente nas células e deixá-lo no meio durante a imagem ao vivo para registrar a captação contínua nas células. Isso amplifica o sinal de dextrano em macropinossomos e endossomos subsequentes, mostrando todo o caminho de maturação. A visualização de macropinossomos marcados contra o interior não rotulado (preto) das células, como uma configuração inversa de alto contraste, revela todas as características dos macropinossomos e, inversamente, fora das células, o meio altamente fluorescente destaca a agitação dinâmica da superfície celular. Este método descreve a imagem ao vivo do dextrano para imagens microscópicas de luz, confocais e para sua detecção após a fixação celular por microscopia de luz e eletrônica correlativa (CLEM). A imagem incluída aqui foi realizada em diferentes tipos de células para demonstrar a ampla aplicabilidade dessas abordagens, incluindo macrófagos ativados e células microgliais, onde a macropinocitose é muito ativa e rápida, e em células cancerígenas onde a macropinocitose é relativamente menos abundante.

Protocolo

1. Preparação de células em pratos com fundo de vidro de 35 mm (Dia 0)

1. Manter e passar linhagens celulares em meio completo suplementado com 10% de soro fetal inativado por calor (para RAW264.7) ou regular e 1% de L-glutamina, a 37 ° C em incubadora umidificada de 5% de CO₂ .
2. Colocar o número adequado de células em placas para atingir 60% de confluência em 24 h, em placas com fundo de vidro de 35 mm.
   NOTA: A densidade celular recomendada está entre 2 mL de 0.15 x 10⁶ células/mL a 0.25 x 10⁶ células/mL para as células de câncer de mama RAW264.7, BV2 e MDA-MB 231 descritas aqui.

2. Transfecção de plasmídeo de DNA de fluorescência (Dia 1) - Opcional

NOTA: Diferentes proteínas e sondas marcadas com fluorescência podem ser expressas de forma transitória ou estável em linhagens celulares clonadas para rotular especificamente babados de actina e compartimentos na via endocítica, como endossomos iniciais, endossomos tardios ou lisossomos.

1. Transfecte as células usando um kit de transfecção à base de lipídios de acordo com as instruções do fabricante, 1 dia após o plaqueamento em uma capa de cultura de tecidos.
2. Diluir 2 μg de plasmídeo de ADN purificado sem endotoxinas em 125 μL de meio essencial mínimo (soro reduzido). Misture delicadamente e deixe repousar por 5 min em temperatura ambiente.
3. Diluir 5 μL de agente de transfecção em 125 μL de meio essencial mínimo (soro reduzido). Misture delicadamente e deixe repousar por 5 min em temperatura ambiente.
4. Combine o plasmídeo de DNA diluído e o reagente de transfecção diluído e incube por mais 10 minutos antes de adicionar gota a gota às células.
5. Incubar as células com complexo de transfecção a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de CO2 por 3-4 h, antes de substituí-las por meio de cultura completo fresco.
6. Use as células transfectadas no dia seguinte para experimentos ou sujeitas a clonagem de diluição limitada para obter linhas celulares que expressam de forma estável.

3. Visualização de vesículas endocíticas e macropinossomos (Dia 2)

NOTA: Dextran Alexa Fluor 488/647 a 10 kDa MW e Dextran Oregon Green 488 / Tetrametilrodamina a 70 kDa MW, aniônico, lisina fixável) de diferentes pesos moleculares são usados para monitorar a captação em fase fluida em uma variedade de vias endocíticas¹⁴. 70 kDa dextrano para macropinossomos e 10 kDa para todas as vias.

1. Prepare dextrana (s) como uma suspensão concentrada 2x a 200-500 ng / mL em meio de cultura pré-aquecido para adição às células.
2. OPCIONAL: Os experimentos podem exigir a adição prévia ou simultânea de suplementos ou medicamentos para influenciar a atividade endocítica. Por exemplo, pré-trate macrófagos e células microgliais com fatores de crescimento (por exemplo, 200 ng/mL CSF-1) ou ligantes ativadores (por exemplo, LPS 100 ng/mL ou 300 ng/mL CpG) para aumentar o babado e a macropinocitose. Cultivar as células cancerígenas num meio adequado sem soro durante 12-16 h antes da absorção de dextrano no meio completo. Consulte a etapa 1.2 para obter a densidade celular recomendada.
3. Para se preparar para imagens ao vivo, posicione as células cultivadas em placas com fundo de vidro no palco de um microscópio confocal invertido equipado com almofada de aquecimento a 37 ° C e uma incubadora umidificada de CO_{5% 2} .
4. Aspirar o excesso de meio deixando 500 μL do meio completo no prato de fundo de vidro.
5. Encontre uma região adequada de células e defina o foco. Para imagens de lapso de tempo, pré-selecione os lasers, filtros e configurações de fluorescência apropriados antes da aquisição. Use as configurações a seguir para resolver células individuais e macropinossomos.
   1. Visualize a região de interesse em um microscópio confocal invertido com uma objetiva Plan Apochromat de imersão em óleo de 63x 1,4 NA.
   2. Selecione 512 x 512 para tamanho de imagem, digitalização bidirecional para imagens rápidas.
   3. Concentre-se em um plano focal individual das células. Defina para capturar como uma única fatia ou defina uma espessura de fatia óptica (Nyquist) de aproximadamente 0,3 μm para combinar como pilhas Z.
   4. Selecione o lapso de tempo com intervalo de 5 s, por uma duração entre 20-45 min, dependendo dos tipos de células específicas.
   5. Selecione o foco automático/rastreamento de foco de hardware para auxiliar na estabilização da imagem durante a captura por um período apropriado de acordo com os tipos de célula específicos.
   6. Adicione um volume igual de 2x meio enriquecido com dextrano e inicie a captura de imagem ao vivo imediatamente para macrófagos. Aguarde 20 minutos antes de obter imagens da captação mais lenta em células MDA-MB 231.
      NOTA: Com este método, as células BV2 com dois canais de fluoróforo foram fotografadas com sucesso em um único plano com rastreamento de velocidade máxima, continuamente por 45 min após a adição da mistura de dextrana. Para detectar macropinossomos precoces em células RAW 264.7, onde a macropinocitose ocorre muito rapidamente, adquira uma única fatia (para imagens rápidas) ou pilha Z de 4-6 fatias (para captura 3D) e lapso de tempo com intervalo de 5 s por 20 min após a adição de dextrana. Para células MDA-MB 231, adquira pilhas Z ideais entre 10-15 fatias, com intervalos de 5 s por 40 minutos.

4. Microscopia de luz e eletrônica correlativa (CLEM) (Dia 3) - Opcional

1. Prepare as células de acordo com as etapas 1, 2 e 3 do protocolo com adaptações. Em resumo, cultive 0,2 x 10⁶ células/mL de células RAW264,7 em placas de fundo de vidro grelhadas (placa de 35 mm, lamínula de cobertura quadriculada nº 1,5, diâmetro de vidro de 14 mm, não revestida), transfecte com um plasmídeo fluorescente (por exemplo, mCherry-2xFYVE) e deixe durante a noite antes da adição de dextrana-488 (70 kDa) por 20 minutos a 37 °C, incubadora umidificada de CO_{5% 2} .
2. Lave as células rapidamente com 1 mL de PBS gelado e fixe com glutaraldeído a 0,1%.
3. Adquira as imagens de células fixas do dextran-488 e mCherry-2xFYVE em um microscópio confocal.
4. Capture imagens de campo claro para identificar as posições da grade antes que os pratos sejam processados para microscopia eletrônica de transmissão (EM) conforme descrito anteriormente¹⁸. Em resumo, além disso, fixe as células em glutaraldeído a 2,5%, pós-fixe em tetróxido de ósmio reduzido a 1%, core em bloco com acetato de uranila a 2% e, em seguida, desidrate através de uma série de etanol antes de incorporar na resina LX112. Extirpe os locais gradeados do bloco e colete seções ultrafinas usando um micrótomo. Capture imagens em um microscópio eletrônico a 80 kV usando o software de sistema de imagem apropriado.

5. Processamento e visualização de dados (Dia 4)

NOTA: FIJI - um pacote de análise de imagem de código aberto - é usado para visualização e análise³³.

1. Duplique os dados brutos para processamento para cumprir os princípios de dados da F.A.I.R., ou seja, que os dados de pesquisa sejam localizáveis, acessíveis, interoperáveis e reutilizáveis.
2. Ajuste o brilho e o contraste para conjuntos de imagens igualmente usando os dados do histograma.
3. Exiba as imagens como projeções de intensidade máxima de imagens de pilha Z adquiridas.
4. Insira a barra de escala para conjuntos de imagens.
5. Cortar/girar dados de FOV (opcional). Crie painéis representativos para os dados da série temporal.
6. Para análise e quantificação posteriores, quantifique a intensidade de fluorescência do dextrano absorvido pelas células como uma medida da atividade da macropinocitose. Para limitar a análise a células individuais, use o método de imagem descrito aqui.
   1. Inverta a LUT para inverter a cor das áreas celulares desprovidas de fluorescência para executar o limite.
   2. Segmente o objeto em primeiro plano e crie uma máscara de célula para identificar células individuais.
   3. Use a máscara celular em conjunto com um método¹⁹ publicado anteriormente que identifica e mede macropinossomos individuais. Use essas métricas para quantificar a macropinocitose, incluindo tamanho, número e absorção total por célula.

Resultados

A abordagem de imagem de células vivas não marcadas imersas em alta concentração de dextrano fluorescente tem várias vantagens sobre as técnicas convencionais de imagem para rastrear macropinocitose. Ao apresentar as imagens em relevo, os corpos celulares aparecem em preto e permitem uma melhor visualização da dramática superfície celular contra um fundo fluorescente brilhante, seguido pela internalização em fase fluida de macropinossomos preenchidos com dextrana TMR (70 kDa)...

Discussão

Este artigo descreve variações nas formas mais tradicionais de usar a marcação com dextrana para rastrear macropinocitose, com base em imagens ao vivo de células banhadas continuamente em dextrana fluorescente (s) e visualizando a absorção no fundo preto de células não marcadas. O protocolo otimizado fornece os meios para distinguir entre diferentes vesículas intracelulares e permite um rastreamento espaço-temporal de múltiplas cargas e proteínas macropinocitóticas e endoc?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% Osmium Tetroxide	ProSciTech	EMS19192
647-Transferrin	Molecular Probes, Invitrogen	T23366
BV2 cells	Gift kindly given to us by Dr Liviu Bodea (Queensland Brain Institute)	-
CpG (Class B) B	Integrated DNA Technologies	Custom Order
Dextran Alexa Fluor 488  at 10 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D22910
Dextran Alexa Fluor 647  at 10 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D22914
Dextran Oregon Green 488 at 70 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D1818
Dextran Tetramethylrhodamine at 70 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D7173
DMEM medium with sodium pyruvate and L-glutamine	Gibco Invitrogen	#11995
Fetal Calf serum	Interpath Services Pty Ltd	SFBS-F
Glutaraldehyde aqueous solution, EM Grade 25%	ProSciTech	C002
Jeol 1011 electron microscope	JEOL	-
L-Glutamine	Gibco Invitrogen	25030081
Lipofectamine 2000	Gibco Invitrogen	11668019
MatTek  Glass Bottom Dish 35 mm, uncoated grid	MatTek Corporation	P35G-2-14-CGRD
MatTek glass bottom dishes 35 mm uncoated	MatTek Corporation	P35G-1.5-14C
MDA-MB 231 cells	ATCC	HTB-26
Opti-MEM reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific	31985088
Plasmid mCherry-2XFYVE	Gift kindly given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)	-
Plasmid mCherry-PLCδ-PH	Gift kindly given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)	-
Raw264.7 cells	ATCC	TIB-71
RPMI medium 1640,without L-glutamine	Gibco Invitrogen	#21870
Ultrapure LPS	Jomar Life Research Pte Ltd	TLR-3PELPS
Uranyl Acetate	ProSciTech	C079
Zeiss inverted LSM880 confocal microscope	Zeiss	-