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要約

このプロトコルは、連続的な取り込みと逆画像を使用して生細胞のデキストランイメージングを実証し、ラフリングの可視化、マクロピノソームの成熟、およびデキストランと他の細胞標識の分析を最適化します。

要約

マクロピノサイトーシスは、高度に保存されているが、まだ完全には理解されていないプロセスであり、細胞内の液体、液相栄養素、およびその他の物質の取り込みと摂取に不可欠です。細胞表面のフリルの劇的な拡大、マクロピノソームを形成するためのそれらの閉鎖、および内在化されたマクロピノソームの成熟は、この経路における重要なイベントであり、蛍光カーゴのボーラスの追跡に基づく従来の共焦点イメージングでは捉えることが困難な場合があります。蛍光デキストランは、マクロピノソームや他のエンドサイトーシス経路の液相マーカーとして実験的に一般的に使用されています。デキストラン取り込みのイメージングを最適化するために研究室が採用した方法には、培地中の高濃度の蛍光デキストランを浴びた細胞のライブイメージングを使用し、非標識細胞が浮き彫りに(黒色で)現れることが含まれます。細胞のフリルは、フリルの閉鎖を視覚化するために強調表示され、内在化されたマクロピノソームは細胞内部に蛍光液胞として現れます。この方法は、マクロピノソームの特徴を視覚化するのに最適であり、セグメンテーションと定量が容易になります。この論文では、異なるサイズのデキストランを用いた経路の二重標識と、マクロピノソームと他のエンドソームをマークするための脂質プローブと蛍光膜タンパク質の共発現について説明します。相関光電子顕微鏡(CLEM)を用いた超微細構造レベルでの内在化デキストランの検出も実証されています。これらの細胞プロセスは、3Dを含む複数のライブイメージングモダリティを使用してイメージングできます。これらのアプローチを組み合わせることで、マクロピノソームイメージングを多くの異なる設定や実験系に最適化します。

概要

ほとんどの脊椎動物細胞は、単一細胞アメーバ1にまでさかのぼる進化を通じて、体液の非選択的取り込みの先天的な能力を先行細胞と共有しています。この高度に保存されたマクロピノサイトーシス(大量飲酒)による液相取り込みのプロセスは、アメーバでは主に栄養の獲得に利用されています1が、脊椎動物の細胞では、ストレス下で栄養を得るための供給経路として同様に利用され、免疫細胞では組織環境のサンプリングや監視に利用されています2。マクロピノサイトーシスは、特有の大きな(直径>0.2mm)液胞様マクロピノソーム、流体と溶質の取り込みの非選択的性質、およびマクロピノソームに日和見的に内在化される原形質膜の広がりなど、他の形態のエンドサイトーシスとは異なる特徴を持っています3。この取り込みの非選択的性質は、選別とリサイクルが迅速に行われなければならないことを意味します。マクロピノソームに取り込まれた物質の多くは、リソソームでの分解に運命づけられており、マクロピノソームの成熟と他のエンドソームとの融合を通じてエンド/リソソーム経路に注ぎ込まれます。また、原形質膜タンパク質は、マクロピノソームから細胞表面にリサイクルすることもできます。がん分野では、がん細胞で活性化され、がん細胞の栄養と増殖の維持に役立つマクロピノサイトーシスのプロセスを理解することに強い関心が寄せられています2,4,5,6。マクロピノサイトーシスは、免疫細胞における受容体媒介刺激により構成的に発生し、さらに誘発される可能性があり、マクロピノソームは受容体シグナル伝達を宿主とし、抗原提示のためのエンド/リソソームプロセシングに寄与し、さまざまなウイルス、細菌、およびその他の病原体の侵入ポータルを提供します3,7。

マクロピノソームには、特徴的なマーカーやユニークなマーカーがほとんどありません。それらは、流体8を包み込む近くにある劇的でアクチンに富む細胞表面のフリルの基部で形成する際に最も容易に同定される。閉鎖直後に、マクロピノソームの周囲のF-アクチンは解重合され、マクロピノソーム自体は、ホモ型およびヘテロ型の融合、チューブ化、および収縮に関連する動的な変化を受ける9。また、マクロピノソームは、特徴的な被膜やその他の特徴を持たず、単にさまざまなサイズの液胞として現れるため、超微細構造レベルでの同定も困難です。決定的な膜マーカーがないため、マクロピノソームは、実験的に蛍光デキストランを使用して、流体カーゴによって最も容易かつ伝統的に定義されます。デキストランは、グルコース由来の複合多糖類であり、多数の蛍光マーカーまたは電子密度マーカーに結合し、細胞による取り込みのために培地に添加したり、組織への取り込みのために灌流することができます。さらに、高分子量(MW)デキストラン(70 kDa)は、他の小さなエンドサイトーシス小胞に侵入しないため、現在、マクロピノソームのサイズ選択的カーゴと見なされており、マクロピノサイトーシスの最も一般的な標識となっています10,11。マクロピノサイトーシスの観察には、通常、蛍光デキストランのパルスで細胞をインキュベートし、蛍光イメージング用の固定細胞または生細胞を使用して、マクロピノソームの細胞内のデキストラン標識のボーラスを観察することが含まれます。そのサイズが大きいため、非標識マクロピノソームは、位相差や明視野顕微鏡を使用して一部の細胞タイプでも観察でき、マクロピノソームは大きな白い空の液胞として現れます。いくつかの文脈情報は、細胞の位相コントラスト画像から得られ、次いで、これらの画像を蛍光画像とさらに重ね合わせて、蛍光デキストラン取り込みを描写することができる12,13。異なるサイズおよび異なる標識を有するデキストランは、複数の細胞およびエンドサイトーシス経路10,14,15への流体取り込みを監視するために使用することができ、デキストランは細胞培養に適用したり、マウスに灌流して生体内イメージング16を行ったり、さらにはハエ胚17に注入してライブイメージングを行ったりすることができる。

デキストランを使用してマクロピノソームを追跡する際に生じる困難には、細胞の固定または透過化後のマクロピノソームからの漏出、積極的なマクロピノサイトーシスを行わない細胞での希薄または検出が困難なレベル、マクロピノソーム成熟中の細胞内での動的な展開と分散などがあります3.これらの問題は、デキストランの単一パルスを細胞に添加し、その後洗い流すための取り込みを追跡するように設計されたほとんどの実験で悪化します。

代わりに、この論文では、蛍光デキストランを細胞に適用し、ライブイメージング中に培地に放置して細胞への継続的な取り込みを記録する利点について説明します。これにより、マクロピノソームとその後のエンドソームのデキストランシグナルが増幅され、成熟の全経路が示されます。標識マクロピノソームを非標識(黒色)の細胞内部に対して高コントラストの逆設定として見ると、マクロピノソームのすべての特徴が明らかになり、逆に、細胞の外側では、高蛍光媒体が細胞表面の動的な波紋を強調します。この方法では、光顕微鏡、共焦点イメージング、および相関光電子顕微鏡(CLEM)による細胞固定後の検出のためのデキストランのライブイメージングについて説明します。ここに含まれるイメージングは、マクロピノサイトーシスが非常に活発で急速な活性化マクロファージやミクログリア細胞、マクロピノサイトーシスが比較的少ないがん細胞など、これらのアプローチの広範な適用性を実証するために、さまざまな細胞タイプで実施されました。

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プロトコル

1. 35mmガラス底皿への細胞調製(0日目)

  1. 10%熱不活化(RAW264.7の場合)または通常のウシ胎児血清と1%L-グルタミンを添加した完全培地で、加湿した5%CO2 インキュベーターで37°Cで細胞株を維持し、継代します。
  2. 適切な数の細胞をプレート化して、24時間で60%のコンフルエントを達成するように、35 mmのガラス底皿にプレートします。
    注:推奨細胞密度は、ここに記載されているRAW264.7、BV2ミクログリア細胞、およびMDA-MB 231乳がん細胞の場合、0.15 x 106 細胞/mLから0.25 x 106 細胞/mLの2 mLです。

2. 蛍光DNAプラスミドトランスフェクション(1日目)-オプション

注:クローニング細胞株で、さまざまな蛍光標識タンパク質およびプローブを一過性または安定的に発現させ、初期エンドソーム、後期エンドソーム、またはリソソームなどのエンドサイトーシス経路のアクチンフリルおよびコンパートメントを特異的に標識することができる。

  1. 製造元の指示に従って、脂質ベースのトランスフェクションキットを使用して、組織培養フードに播種後1日で細胞をトランスフェクションします。
  2. エンドトキシンフリーの精製DNAプラスミド2 μgを、最小必須培地(低血清)125 μLで希釈します。穏やかに混ぜ合わせ、室温で5分間放置します。
  3. 5 μL のトランスフェクション剤を 125 μL の最小必須培地 (減量血清) で希釈します。穏やかに混ぜ合わせ、室温で5分間放置します。
  4. 希釈したDNAプラスミドと希釈したトランスフェクション試薬を組み合わせ、さらに10分間インキュベートしてから、細胞に滴下します。
  5. トランスフェクション複合体を用いて細胞を37°Cで加湿した5%CO2インキュベーターで3〜4時間インキュベートした後、新鮮な完全培養培地と交換します。
  6. トランスフェクションした細胞を翌日の実験に使用したり、希釈を限定したクローニングを行ったりして、安定的に発現する細胞株を得ることができます。

3. エンドサイトーシス小胞とマクロピノソームの可視化(2日目)

注:さまざまな分子量の蛍光デキストラン(10 kDa MWのDexlast Alexa Fluor 488/647、および70 kDa MWのDexlast O Green 488 /テトラメチルローダミン、アニオン性、リジン固定可能)を使用して、さまざまなエンドサイトーシス経路14への液相の取り込みを監視します。マクロピノソームには70 kDa、すべての経路には10 kDaのデキストラン。

  1. デキストランを200-500 ng/mLの2倍濃縮懸濁液として、あらかじめ加温した培地で調製し、細胞に添加します。
  2. オプション:実験では、エンドサイトーシス活性に影響を与えるために、サプリメントまたは薬物を事前または同時に追加する必要がある場合があります。例えば、マクロファージやミクログリア細胞を成長因子(200 ng/mL CSF-1など)や活性化リガンド(LPS 100 ng/mLまたは300 ng/mL CpGなど)で前処理し、ラフリングやマクロピノサイトーシスを強化します。デキストランが完全培地に取り込まれる前に、適切な無血清培地でがん細胞を12〜16時間培養します。推奨されるセル密度については、ステップ1.2を参照してください。
  3. ライブイメージングの準備として、ガラス底の皿で成長した細胞を、37°Cの加熱パッドと5%CO2 加湿インキュベーターを取り付けた倒立共焦点顕微鏡のステージに置きます。
  4. 余分な培地を吸引し、ガラス底皿に500μLの完全培地を残します。
  5. 細胞の適切な領域を見つけ、焦点を設定します。タイムラプスイメージングの場合は、取得前に適切な蛍光レーザー、フィルター、および設定を事前に選択してください。以下の設定を使用して、個々の細胞とマクロピノソームを分離します。
    1. 63x 1.4 NA油浸プランアポクロマート対物レンズを備えた倒立共焦点顕微鏡で関心領域を画像化します。
    2. 画像サイズには512 x 512を選択し、高速イメージングには双方向スキャンを選択します。
    3. 細胞の個々の焦点面に焦点を当てます。1つのスライスとしてキャプチャするか、光学スライスの厚さ(ナイキスト)を約0.3μmに設定してZスタックとして組み合わせます。
    4. 特定の細胞タイプに応じて 20 分から 45 分の期間で、5 秒間隔のタイムラプスを選択します。
    5. ハードウェアオートフォーカス/フォーカストラッキングを選択して、特定の細胞タイプに応じて適切な時間、キャプチャ中の画像安定化を支援します。
    6. 等量の2倍デキストランスパイク培地を添加し、マクロファージのライブ画像キャプチャをすぐに開始します。20分待ってから、MDA-MB 231細胞の取り込みが遅いことをイメージングします。
      注:この方法では、2つのフルオロフォアチャネルを有するBV2細胞を、デキストラン混合物を添加して45分間連続的に、最大速度追跡を伴う単一の平面上で成功裏にイメージングしました。マクロピノサイトーシスが非常に急速に発生するRAW 264.7細胞で初期のマクロピノソームを検出するには、1つのスライス(高速イメージング用)または4〜6スライスのZスタック(3Dキャプチャ用)を取得し、デキストランを添加して5秒間隔で20分間のタイムラプスを行います。MDA-MB 231細胞の場合、10〜15スライス間で最適なZスタックを、5秒間隔で40分間取得します。

4. 相関光電子顕微鏡 (CLEM) (3日目) - オプション

  1. プロトコルのステップ1、2、および3に従って細胞を調製し、適応します。簡単に言うと、0.2 x 106 細胞/mL RAW264.7細胞を格子底皿(35 mm皿、No.1.5格子カバーガラス、ガラス径14 mm、コーティングなし)で増殖させ、蛍光プラスミド(mCherry-2xFYVEなど)でトランスフェクションし、デキストラン-488(70 kDa)を添加する前に、37°C、5%CO2 加湿インキュベーターで20分間放置します。
  2. 氷冷したPBS1 mLで細胞を迅速に洗浄し、0.1%グルタルアルデヒドで固定します。
  3. デキストラン-488およびmCherry-2xFYVEの固定細胞像を共焦点顕微鏡で取得します。
  4. 明視野画像をキャプチャしてグリッド位置を特定する前に、前述のように、透過型電子顕微鏡(EM)用に皿を処理します18。簡単に言うと、さらに、細胞を2.5%グルタルアルデヒドに固定し、1%還元四酸化オスミウムで後置し、2%酢酸ウラニルで一括染色し、次いで一連のエタノールで脱水してからLX112樹脂に包埋する。ブロックからグリッド化された位置を切り取り、ウルトラミクロトームを使用して極薄切片を収集します。適切なイメージングシステムソフトウェアを使用して、80 kVの電子顕微鏡で画像をキャプチャします。

5. データ処理と可視化(4日目)

注:オープンソースの画像分析パッケージであるFIJIは、視覚化と分析に使用されます33。

  1. F.A.I.R. データの原則、つまり研究データが検索可能、アクセス可能、相互運用可能、再利用可能であることを示すために、処理のために生データを複製します。
  2. ヒストグラムデータを使用して、画像セットの明るさとコントラストを均等に調整します。
  3. 取得したZスタック画像から最大強度の投影として画像を表示します。
  4. 画像セットのスケールバーを挿入します。
  5. FOVデータの切り抜き/回転(オプション)。時系列データの代表的なパネルを作成します。
  6. さらなる分析と定量のために、マクロピノサイトーシス活性の尺度として細胞に取り込まれたデキストランの蛍光強度を定量します。解析を個々の細胞に限定するには、ここで説明するイメージング方法を使用します。
    1. LUTを反転して、蛍光のない細胞領域の色を反転し、閾値処理を実行します。
    2. 前景オブジェクトをセグメント化し、個々のセルを識別するためのセルマスクを作成します。
    3. セルマスクは、個々のマクロピノソームを同定および測定する以前に発表された方法19 と組み合わせて使用します。これらの指標を使用して、サイズ、数、細胞あたりの総取り込み量など、マクロピノサイトーシスを定量化します。

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結果

高濃度の蛍光デキストランに浸漬した非標識生細胞をイメージングするアプローチには、マクロピノサイトーシスを追跡するための従来のイメージング技術に比べていくつかの利点があります。画像を浮き彫りにすることで、細胞体は黒く見え、明るい蛍光背景に対する劇的な細胞表面の波動の視覚化が向上し、 図1Aに示すようにTMRデキストラ...

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ディスカッション

この論文では、蛍光デキストランに連続的に浸漬された細胞のライブイメージングと、標識されていない細胞の黒色背景への取り込みの視覚化に基づいて、デキストラン標識を使用してマクロピノサイトーシスを追跡する従来の方法のバリエーションについて説明します。最適化されたプロトコルは、異なる細胞内小胞を区別する手段を提供し、複数のマクロピノサ...

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開示事項

著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

謝辞

著者は、Tatiana Khromykhの専門的な技術支援に感謝します。蛍光イメージングは、Australian Cancer Research Foundationが資金提供するCancer Ultrastructure and Function Facilityを組み込んだIMB Microscopyで実施されました。電子顕微鏡は、UQの顕微鏡および微量分析センターで実施されました。資金は、オーストラリア国立保健医療研究評議会(JLS APP1176209)およびオーストラリア研究評議会(DP180101910)から受けました。NDCは、Silicon Valley Community FoundationのアドバイズドファンドであるChan Zuckerberg Initiative DAFからの助成金番号2020-225648により、CZI Imaging Scientistとしてサポートされています。YHは、オーストラリア政府からの奨学金とユルギルバーアルツハイマー研究プログラムからの資金提供により、博士号によって支援されました。Z-JXは、中国科学院の奨学金によって支援されました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2% Osmium TetroxideProSciTechEMS19192
647-TransferrinMolecular Probes, Invitrogen  T23366
BV2 cellsGift kindly given to us by Dr Liviu Bodea (Queensland Brain Institute)-
CpG (Class B) BIntegrated DNA TechnologiesCustom Order
Dextran Alexa Fluor 488  at 10 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD22910
Dextran Alexa Fluor 647  at 10 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD22914
Dextran Oregon Green 488 at 70 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD1818
Dextran Tetramethylrhodamine at 70 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD7173
DMEM medium with sodium pyruvate and L-glutamineGibco Invitrogen#11995
Fetal Calf serumInterpath Services Pty LtdSFBS-F
Glutaraldehyde aqueous solution, EM Grade 25%ProSciTechC002
Jeol 1011 electron microscopeJEOL-
L-GlutamineGibco Invitrogen25030081
Lipofectamine 2000Gibco Invitrogen11668019
MatTek  Glass Bottom Dish 35 mm, uncoated gridMatTek CorporationP35G-2-14-CGRD
MatTek glass bottom dishes 35 mm uncoatedMatTek CorporationP35G-1.5-14C
MDA-MB 231 cellsATCCHTB-26
Opti-MEM reduced serum mediumThermo Fisher Scientific31985088
Plasmid mCherry-2XFYVEGift kindly given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)-
Plasmid mCherry-PLCδ-PHGift kindly given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)-
Raw264.7 cellsATCCTIB-71
RPMI medium 1640,without L-glutamineGibco Invitrogen#21870
Ultrapure LPSJomar Life Research Pte LtdTLR-3PELPS
Uranyl AcetateProSciTechC079
Zeiss inverted LSM880 confocal microscopeZeiss-

参考文献

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