פלואורסצנציה חיה, הדמיה הפוכה של סלסול תאים ומקרופינוציטוזיס

Summary

פרוטוקול זה מדגים הדמיית דקסטרן בתאים חיים באמצעות קליטה רציפה ותמונות הפוכות כדי לייעל את ההדמיה של סלסול, התבגרות מקרופינוזום וניתוח של דקסטרן ותיוגי תאים אחרים.

Abstract

מקרופינוציטוזיס הוא תהליך שמור מאוד אך עדיין לא מובן לחלוטין החיוני לספיגה ובליעה של נוזלים, חומרים מזינים בשלב נוזלי וחומרים אחרים בתאים. ההתרחבות הדרמטית של סלסולים על פני התא, סגירתם ליצירת מקרופינוזומים והבשלת מקרופינוזומים מופנמים הם אירועי מפתח במסלול זה שיכולים להיות קשים ללכידה באמצעות הדמיה קונפוקלית קונבנציונלית המבוססת על מעקב אחר בולוס של מטען פלואורסצנטי. דקסטרנים פלואורסצנטיים משמשים בדרך כלל בניסוי כסמני פאזה נוזלית עבור מקרופינוזומים ועבור מסלולים אנדוציטיים אחרים. שיטה שאימצה המעבדה כדי לייעל את ההדמיה של קליטת דקסטרן כוללת שימוש בהדמיה חיה של תאים שטופים בריכוזים גבוהים של דקסטרן פלואורסצנטי בתווך, כאשר התאים הלא מסומנים מופיעים בתבליט (כשחור). סלסולי התא מודגשים כדי לדמיין סגירת סלסולים, ומקרופינוזומים מופנמים מופיעים כוואקואולים פלואורסצנטיים בפנים התא. שיטה זו אופטימלית להמחשת תכונות מקרופינוזום ומאפשרת פילוח וכימות קלים. מאמר זה מתאר תיוג כפול של מסלולים עם דקסטרנים בגדלים שונים וביטוי משותף של בדיקות שומנים וחלבוני ממברנה פלואורסצנטיים לסימון מקרופינוזומים ואנדוזומים אחרים. מודגם גם זיהוי של דקסטרן מופנם ברמה אולטרה-מבנית באמצעות מיקרוסקופ אור ואלקטרונים מתאם (CLEM). ניתן לדמות תהליכי תאים אלה באמצעות מספר שיטות הדמיה חיות, כולל בתלת מימד. יחד, גישות אלה מייעלות את הדמיית המקרופינוזומים עבור הגדרות ומערכות ניסיוניות רבות ושונות.

Introduction

רוב סוגי תאי החולייתנים חולקים את היכולת המולדת לספיגה לא סלקטיבית של נוזלים עם קודמיו לאורך האבולוציה, החל מאמבה חד-תאית¹. תהליך שמור מאוד זה של ספיגת שלב נוזלי על ידי מקרופינוציטוזיס (שתייה גדולה) משמש אמבה בעיקר לרכישת חומרים מזינים¹, בעוד שבתאי חוליות, הוא יכול להיות נתיב אספקה להשגת חומרים מזינים תחת לחץ, והוא משמש את תאי החיסון לדגימה ומעקב אחר סביבות רקמות². למקרופינוציטוזיס יש מאפיינים המבדילים אותו מצורות אחרות של אנדוציטוזיס, כולל המקרופינוזומים הייחודיים והגדולים (בקוטר >0.2 מ"מ), האופי הלא סלקטיבי של ספיגת נוזלים ומומסים והמרחבים הנלווים של קרום הפלזמה המופנמים באופן אופורטוניסטי למקרופינוזומים³. האופי הלא סלקטיבי של ספיגה זו פירושו שמיון ומיחזור חייבים להתרחש במהירות כדי להציל חלבונים מסיסים חיוניים וממברנת פלזמה על ידי מיחזורם בחזרה לפני השטח של התא. חלק גדול מהחומר שנלקח למקרופינוזומים מיועד לפירוק בליזוזומים, והוא מנותב למסלולים אנדו/ליזוזומליים באמצעות התבגרות מקרופינוזומים ואיחוי עם אנדוזומים אחרים. ניתן גם למחזר חלבוני קרום פלזמה בחזרה אל פני התא ממקרופינוזומים. בתחום הסרטן יש עניין רב להבנת תהליך המקרופינוציטוזיס, המופעל בתאי סרטן ומסייע לשמירה על תזונתם והתפשטותם 2,4,5,6. מקרופינוציטוזיס מתרחשת הן מבחינה קונסטיטוציונית ויכולה להיות מושרית עוד יותר עם גירוי בתיווך קולטנים בתאי חיסון, כאשר מקרופינוזומים מארחים איתות קולטנים, תורמים לעיבוד אנדו/ליזוזומלי להצגת אנטיגן ומספקים שער כניסה למגוון וירוסים, חיידקים ופתוגנים אחרים ^3,7.

למקרופינוזומים יש מעט סמנים ייחודיים או ייחודיים. הם מזוהים בקלות רבה יותר במהלך היווצרותם בבסיס סלסולים דרמטיים ועשירים באקטין, הקרובים לבליעת נוזל⁸. מיד לאחר הסגירה, ה-F-אקטין סביב המקרופינוזומים עובר דה-פולימריזציה, והמקרופינוזומים עצמם עוברים שינויים דינמיים הקשורים לאיחוי הומו והטרוטיפי, צינוריות והתכווצות⁹. קשה לזהות מקרופינוזומים גם ברמה אולטרה-מבנית מכיוון שאין להם פרווה אופיינית או תכונות אחרות והם מופיעים פשוט כוואקואולים בגדלים שונים. ללא סמני ממברנה מוחלטים, מקרופינוזומים מוגדרים בקלות ובאופן מסורתי ביותר על ידי המטען הנוזלי שלהם, אשר באופן ניסיוני נעשה באמצעות דקסטרן פלואורסצנטי. דקסטרן הוא פוליסכריד מורכב שמקורו בגלוקוז שניתן לחבר למערך גדול של סמנים פלואורסצנטיים או צפופים באלקטרונים ולהוסיף למדיום לספיגה על ידי תאים או לחלחל לספיגה ברקמות. יתר על כן, דקסטרן בעל משקל מולקולרי גדול (MW) (70 kDa) נחשב כיום כמטען סלקטיבי לגודל עבור מקרופינוזומים מכיוון שהוא אינו נכנס לשלפוחיות אנדוציטיות אחרות, קטנות יותר, והוא הפך לתווית הנפוצה ביותר למקרופינוציטוזיס^10,11. צפייה במקרופינוציטוזיס כוללת בדרך כלל דגירה של תאים עם דופק של דקסטרן פלואורסצנטי ושימוש בתאים קבועים או חיים להדמיה פלואורסצנטית כדי לראות את הבולוס של תיוג דקסטרן בתוך תאים במקרופינוזומים. בשל גודלם הגדול, ניתן לראות מקרופינוזומים ללא תווית גם בסוגי תאים מסוימים באמצעות ניגודיות פאזה או מיקרוסקופ שדה בהיר, שבו מקרופינוזומים מופיעים כוואקואולים ריקים לבנים גדולים. מידע קונטקסטואלי מסוים מתקבל מתמונות ניגודיות הפאזה של התאים, ולאחר מכן ניתן לכסות את התמונות הללו בתמונות פלואורסצנטיות כדי לתאר קליטת דקסטרן פלואורסצנטי^12,13. ניתן להשתמש בדקסטרנים בגדלים שונים ועם תוויות נפרדות כדי לנטר את ספיגת הנוזלים למסלולים תאיים ואנדוציטים מרובים 10,14,15 וניתן ליישם דקסטרן על תרביות תאים או להחדיר לעכברים להדמיה תוך-חיונית ¹⁶ או אפילו להזריק לעוברי זבובים¹⁷ להדמיה חיה.

חלק מהקשיים שנגרמו בשימוש בדקסטרן למעקב אחר מקרופינוזומים כוללים את דליפתו החוצה מהמקרופינוזומים לאחר קיבוע או חדירה של תאים, רמות מדוללות או קשות לזיהוי בתאים שאינם מבצעים מקרופינוציטוזיס אגרסיבי, והפריסה והפיזור הדינמי שלו בתוך התאים במהלך התבגרות המקרופינוזום³. בעיות אלה מורכבות ברוב הניסויים שנועדו לעקוב אחר ספיגת פולס בודד של דקסטרן שנוסף לתאים ולאחר מכן נשטף.

במקום זאת, מאמר זה מתאר את היתרונות של יישום דקסטרן פלואורסצנטי על התאים והשארתו בתווך במהלך הדמיה חיה כדי לתעד קליטה רציפה לתאים. זה מגביר את אות הדקסטרן במקרופינוזומים ובאנדוזומים הבאים המראים את כל מסלול ההתבגרות. צפייה במקרופינוזומים מסומנים כנגד החלק הפנימי הלא מסומן (שחור) של התאים, כהגדרה הפוכה בעלת ניגודיות גבוהה, חושפת את כל התכונות של המקרופינוזומים, ולהיפך, מחוץ לתאים, המדיום הפלואורסצנטי מאוד מדגיש את ההשתוללות הדינמית של פני התא. שיטה זו מתארת הדמיה חיה של דקסטרן להדמיה מיקרוסקופית וקונפוקלית של אור, ולגילויו לאחר קיבוע התאים על ידי מיקרוסקופ אור ואלקטרונים מתאם (CLEM). ההדמיה הכלולה כאן בוצעה על סוגי תאים שונים כדי להדגים את הישימות הרחבה של גישות אלה, כולל מקרופאגים מופעלים ותאי מיקרוגליה, שבהם מקרופינוציטוזיס פעיל ומהיר מאוד, ובתאי סרטן שבהם מקרופינוציטוזיס פחות נפוץ יחסית.

Protocol

1. הכנת תאים על כלי זכוכית 35 מ"מ (יום 0)

1. תחזוקה ומעבר של קווי תאים במדיום שלם בתוספת 10% מומת בחום (עבור RAW264.7) או סרום עגל עוברי רגיל ו-1% L-גלוטמין, ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5% CO₂ לח.
2. צלחת את מספר התאים המתאים כדי להשיג מפגש של 60% תוך 24 שעות, על צלחות עם תחתית זכוכית 35 מ"מ.
   הערה: צפיפות התאים המומלצת היא בין 2 מ"ל של 0.15 x 10⁶ תאים/מ"ל ל-0.25 x 10⁶ תאים/מ"ל עבור תאי סרטן השד RAW264.7, BV2 ו-MDA-MB 231 המתוארים כאן.

2. טרנספקציה של פלסמיד DNA פלואורסצנטי (יום 1) - אופציונלי

הערה: חלבונים ובדיקות שונים המתויגים פלואורסצנטית יכולים להתבטא באופן חולף או יציב בשורות תאים משובטים כדי לסמן באופן ספציפי סלסולים ותאים של אקטין במסלול האנדוציטי כגון אנדוזומים מוקדמים, אנדוזומים מאוחרים או ליזוזומים.

1. העבירו את התאים באמצעות ערכת טרנספקציה מבוססת ליפידים לפי הוראות היצרן, יום אחד לאחר הציפוי במכסה המנוע של תרבית רקמות.
2. לדלל 2 מיקרוגרם של פלסמיד DNA מטוהר ללא אנדוטוקסין ב-125 מיקרוליטר של מדיה חיונית מינימלית (סרום מופחת). מערבבים בעדינות ונותנים לו לעמוד 5 דקות בטמפרטורת החדר.
3. לדלל 5 מיקרוליטר של חומר טרנספקציה ב-125 מיקרוליטר של מדיה חיונית מינימלית (סרום מופחת). מערבבים בעדינות ונותנים לו לעמוד 5 דקות בטמפרטורת החדר.
4. שלב את פלסמיד ה-DNA המדולל ואת מגיב הטרנספקציה המדולל ודגר למשך 10 דקות נוספות לפני הוספת טיפה לתאים.
5. דגרו את התאים עם קומפלקס טרנספקציה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה של 5% CO2 למשך 3-4 שעות, לפני החלפתם במדיום תרבית מלא טרי.
6. השתמש בתאים שעברו טרנספטציה למחרת לניסויים או כפוף לשיבוט דילול מוגבל כדי להשיג קווי תאים המבטאים ביציבות.

3. הדמיה של שלפוחיות אנדוציטיות ומקרופינוזומים (יום 2)

הערה: דקסטרנים פלואורסצנטיים (Dextran Alexa Fluor 488/647 ב-10 kDa MW, ו-Dextran Oregon Green 488/Tetramethylrhodamine ב-70 kDa MW, Anionic, Lysine Fixable) במשקלים מולקולריים שונים משמשים לניטור ספיגת שלב נוזל למגוון מסלולים אנדוציטיים¹⁴. 70 kDa דקסטרן למקרופינוזומים ו-10 kDa לכל המסלולים.

1. הכן דקסטרן/ים כתרחיף מרוכז פי 2 ב-200-500 ננוגרם/מ"ל במדיום תרבית מחומם מראש לתוספת לתאים.
2. אופציונלי: ניסויים עשויים לדרוש הוספה מוקדמת או בו-זמנית של תוספי מזון או תרופות כדי להשפיע על הפעילות האנדוציטית. לדוגמה, טיפול מקדים במקרופאגים ותאי מיקרוגליה עם גורמי גדילה (למשל, 200 ננוגרם/מ"ל CSF-1) או הפעלת ליגנדים (למשל, LPS 100 ננוגרם/מ"ל או 300 ננוגרם/מ"ל CpG) כדי לשפר את הסלסולים והמקרופינוציטוזיס. תרבית את התאים הסרטניים במדיום מתאים נטול סרום למשך 12-16 שעות לפני ספיגת דקסטרן במדיום השלם. עיין בשלב 1.2 לצפיפות תאים מומלצת.
3. כדי להתכונן להדמיה חיה, מקם את התאים הגדלים בכלי זכוכית על במה של מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך המצויד בכרית חימום של 37 מעלות צלזיוס ואינקובטור לח של 5% CO₂ .
4. שואבים את המדיום העודף ומשאירים 500 מיקרוליטר מהמדיום השלם בכלי תחתית הזכוכית.
5. מצא אזור מתאים של תאים והגדר מיקוד. להדמיית זמן-lapse, בחר מראש את הלייזרים הקרינה, המסננים וההגדרות המתאימים לפני הרכישה. השתמש בהגדרות הבאות כדי לפתור תאים ומקרופינוזומים בודדים.
   1. דמיין את אזור העניין במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך עם מטרת טבילת שמן 63x 1.4 NA תוכנית אפוכרומאט.
   2. בחר 512 x 512 עבור גודל תמונה, סריקה דו-כיוונית להדמיה מהירה.
   3. התמקדו במישור מוקד אינדיבידואלי של התאים. הגדר ללכוד כפרוסה בודדת או הגדר עובי פרוסה אופטי (Nyquist) של כ-0.3 מיקרומטר לשילוב כערימות Z.
   4. בחר זמן-lapse עם מרווח של 5 שניות, למשך זמן שבין 20-45 דקות, בהתאם לסוגי תאים ספציפיים.
   5. בחר מיקוד אוטומטי/מעקב מיקוד בחומרה כדי לסייע בייצוב התמונה במהלך הצילום למשך זמן מתאים בהתאם לסוגי התאים הספציפיים.
   6. הוסף נפח שווה של מדיום דוקרני פי 2 והתחל לכידת תמונה חיה באופן מיידי עבור מקרופאגים. המתן 20 דקות לפני הדמיית הספיגה האיטית יותר בתאי MDA-MB 231.
      הערה: בשיטה זו, תאי BV2 עם שתי תעלות פלואורופור צולמו בהצלחה במישור יחיד עם מעקב אחר מהירות מרבית, ברציפות במשך 45 דקות עם הוספת תערובת הדקסטרן. כדי לזהות מקרופינוזומים מוקדמים בתאי RAW 264.7, שבהם מקרופינוציטוזיס מתרחש במהירות רבה, רכשו פרוסה בודדת (להדמיה מהירה) או ערימת Z של 4-6 פרוסות (ללכידה תלת מימדית) וזמן-lapse עם מרווח של 5 שניות למשך 20 דקות עם הוספת דקסטרן. עבור תאי MDA-MB 231, רכשו ערימות Z אופטימליות בין 10-15 פרוסות, עם מרווחים של 5 שניות למשך 40 דקות.

4. מיקרוסקופ אור ואלקטרונים (CLEM) (יום 3) - אופציונלי

1. הכן תאים לפי שלבים 1, 2 ו -3 של הפרוטוקול עם התאמות. בקצרה, לגדל 0.2 x 10⁶ תאים/מ"ל RAW264.7 תאים על צלחות תחתית זכוכית מרושתות (צלחת 35 מ"מ, מס' 1.5 כיסוי מרושת, קוטר זכוכית 14 מ"מ, לא מצופה), להעביר עם פלסמיד פלואורסצנטי (למשל, mCherry-2xFYVE) ולהשאיר למשך הלילה לפני הוספת דקסטרן-488 (70 kDa) למשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, אינקובטור לח 5% CO₂ .
2. שטפו את התאים במהירות עם 1 מ"ל PBS קר כקרח וקבעו עם 0.1% גלוטרלדהיד.
3. רכוש את תמונות התא הקבועות של ה-dextran-488 ו-mCherry-2xFYVE במיקרוסקופ קונפוקלי.
4. צלם תמונות שדה בהיר כדי לזהות את מיקומי הרשת לפני עיבוד הכלים למיקרוסקופ אלקטרונים שידור (EM) כפי שתואר קודם לכן¹⁸. בקצרה, יתר על כן, לתקן תאים ב-2.5% גלוטראלדהיד, לתקן ב-1% אוסמיום טטרוקסיד מופחת, לצבוע בלוק עם 2% אורניל אצטט, ולאחר מכן להתייבש באמצעות סדרה של אתנול לפני ההטמעה בשרף LX112. הסר את המיקומים המרושתים מהבלוק ואסוף חלקים דקים במיוחד באמצעות אולטרה-מיקרוטום. צלם תמונות במיקרוסקופ אלקטרונים ב-80 קילו וולט באמצעות תוכנת מערכת הדמיה מתאימה.

5. עיבוד נתונים והדמיה (יום 4)

הערה: פיג'י - חבילת ניתוח תמונות בקוד פתוח - משמשת להדמיה וניתוח³³.

1. שכפל את הנתונים הגולמיים לעיבוד כדי לעמוד בעקרונות הנתונים של F.A.I.R., כלומר, שנתוני המחקר ניתנים למציאה, נגישים, ניתנים לפעולה הדדית וניתנים לשימוש חוזר.
2. התאימו את הבהירות והניגודיות של ערכות תמונות באופן שווה באמצעות נתוני ההיסטוגרמה.
3. הצג את התמונות כהקרנות בעוצמה מקסימלית מתמונות Z-stack שנרכשו.
4. הוסף סרגל קנה מידה עבור ערכות תמונות.
5. חיתוך/סיבוב נתוני FOV (אופציונלי). צור לוחות מייצגים עבור נתוני סדרות הזמן.
6. לניתוח וכימות נוספים, כמת את עוצמת הקרינה של דקסטרן שנקלט בתאים כמדד לפעילות מקרופינוציטוזיס. כדי להגביל את הניתוח לתאים בודדים, השתמש בשיטת ההדמיה המתוארת כאן.
   1. הפוך את ה-LUT כדי להפוך את הצבע עבור אזורי תאים נטולי פלואורסצנטיות כדי לבצע סף.
   2. פלח את האובייקט הקדמי וצור מסיכת תא לזיהוי תאים בודדים.
   3. השתמש במסכת התא בשילוב עם שיטה¹⁹ שפורסמה בעבר המזהה ומודדת מקרופינוזומים בודדים. השתמש במדדים אלה כדי לכמת מקרופינוציטוזיס, כולל גודל, מספר וספיגה כוללת לתא.

תוצאות

לגישה של הדמיית תאים חיים ללא תווית השקועים בריכוז גבוה של דקסטרן פלואורסצנטי יש מספר יתרונות על פני טכניקות הדמיה קונבנציונליות למעקב אחר מקרופינוציטוזיס. על ידי הצגת התמונות בתבליט, גופי התאים נראים שחורים ומאפשרים הדמיה משופרת של פני התא הדרמטיים המשתוללים על רקע פ?...

Discussion

מאמר זה מתאר וריאציות על דרכים מסורתיות יותר לשימוש בתיוג דקסטרן למעקב אחר מקרופינוציטוזיס, בהתבסס על הדמיה חיה של תאים שטופים ברציפות בדקסטרן פלואורסצנטי והדמיה של הספיגה על הרקע השחור של תאים ללא תווית. הפרוטוקול האופטימלי מספק את האמצעים להבחין בין שלפוחיות תוך-תאי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% Osmium Tetroxide	ProSciTech	EMS19192
647-Transferrin	Molecular Probes, Invitrogen	T23366
BV2 cells	Gift kindly given to us by Dr Liviu Bodea (Queensland Brain Institute)	-
CpG (Class B) B	Integrated DNA Technologies	Custom Order
Dextran Alexa Fluor 488  at 10 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D22910
Dextran Alexa Fluor 647  at 10 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D22914
Dextran Oregon Green 488 at 70 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D1818
Dextran Tetramethylrhodamine at 70 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D7173
DMEM medium with sodium pyruvate and L-glutamine	Gibco Invitrogen	#11995
Fetal Calf serum	Interpath Services Pty Ltd	SFBS-F
Glutaraldehyde aqueous solution, EM Grade 25%	ProSciTech	C002
Jeol 1011 electron microscope	JEOL	-
L-Glutamine	Gibco Invitrogen	25030081
Lipofectamine 2000	Gibco Invitrogen	11668019
MatTek  Glass Bottom Dish 35 mm, uncoated grid	MatTek Corporation	P35G-2-14-CGRD
MatTek glass bottom dishes 35 mm uncoated	MatTek Corporation	P35G-1.5-14C
MDA-MB 231 cells	ATCC	HTB-26
Opti-MEM reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific	31985088
Plasmid mCherry-2XFYVE	Gift kindly given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)	-
Plasmid mCherry-PLCδ-PH	Gift kindly given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)	-
Raw264.7 cells	ATCC	TIB-71
RPMI medium 1640,without L-glutamine	Gibco Invitrogen	#21870
Ultrapure LPS	Jomar Life Research Pte Ltd	TLR-3PELPS
Uranyl Acetate	ProSciTech	C079
Zeiss inverted LSM880 confocal microscope	Zeiss	-