Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling 및 Macropinocytosis

요약

이 프로토콜은 러플링(ruffling), 거대피노솜(macropinosome) 성숙의 시각화, 덱스트란 및 기타 세포 라벨링 분석의 시각화를 최적화하기 위해 연속 흡수 및 역 이미지를 사용하여 살아있는 세포에서 dextran 이미징을 보여줍니다.

초록

마크로피노사이토시스(Macropinocytosis)는 고도로 보존되어 있지만 여전히 불완전하게 이해되고 있는 과정으로, 세포 내 액체, 유동상 영양소 및 기타 물질의 흡수 및 섭취에 필수적입니다. 세포 표면 주름의 극적인 확장, 매크로피노솜 형성을 위한 폐쇄 및 내재화된 매크로피노솜의 성숙은 이 경로의 핵심 이벤트이며, 이는 형광 화물의 덩어리 추적을 기반으로 하는 기존의 컨포칼 이미징을 사용하여 포착하기 어려울 수 있습니다. 형광 덱스트랜스는 일반적으로 거대피노솜 및 기타 내포성 경로에 대한 유체 상 마커로 실험적으로 사용됩니다. 실험실에서 덱스트란 흡수의 이미징을 최적화하기 위해 채택한 방법은 배지에서 고농도의 형광 덱스트란으로 목욕한 세포의 라이브 이미징을 사용하는 것이며, 표지되지 않은 세포는 부조(검은색)로 나타납니다. 세포 주름 닫힘을 시각화하기 위해 세포 주름이 강조 표시되며, 내재화된 거대피노좀(macropinosome)은 세포 내부에 형광 액포로 나타납니다. 이 방법은 거대피노솜 특징을 시각화하는 데 최적이며 쉽게 세분화하고 정량화할 수 있습니다. 이 논문은 다양한 크기의 dextrans를 가진 경로의 이중 표지와 마크로피노솜 및 기타 엔도솜을 표시하기 위한 지질 프로브와 형광 막 단백질의 동시 발현에 대해 설명합니다. CLEM(Correlative Light and Electron Microscopy)을 사용하여 초구조 수준에서 내부화된 덱스트란을 검출하는 것도 입증되었습니다. 이러한 세포 과정은 3D를 포함한 여러 라이브 이미징 방식을 사용하여 이미지화할 수 있습니다. 종합하면, 이러한 접근 방식은 다양한 설정 및 실험 시스템에서 거대피노솜 이미징을 최적화합니다.

서문

대부분의 척추동물 세포 유형은 단세포 아메바¹로 거슬러 올라가는 진화 전반에 걸쳐 선배들과 함께 액체의 비선택적 흡수에 대한 타고난 능력을 공유합니다. 거대세포작용(macropinocytosis)에 의한 고도로 보존된 유체상 흡수 과정은 아메바가 주로 영양^{분 획득을} 위해 사용하는 반면, 척추동물 세포에서는 스트레스를 받는 영양분을 얻기 위한 공급 경로로 사용되며, 면역 세포가 조직 환경의 샘플링 및 감시를 위해 사용합니다². 마크로피노사이토시스(Macropinocytosis)는 독특하고 큰(직경 >0.2mm) 액포와 같은 마크로피노솜, 유체 및 용질 흡수의 비선택적인 특성, 그리고 기회주의적으로 마크로피노솜으로 내재화되는 원형질막의 확장을 포함하여 다른 형태의 세포내이입증과 구별되는 특징을 가지고 있습니다³. 이러한 흡수의 비선택적인 특성은 필수 용해성 및 원형질막 단백질을 세포 표면으로 다시 재활용하여 구하기 위해 분류 및 재활용이 신속하게 이루어져야 함을 의미합니다. 거대피노솜으로 흡수된 대부분의 물질은 리소좀에서 분해될 운명이며, 거대피노솜 성숙 및 다른 엔도솜과의 융합을 통해 내/리소좀 경로로 유입됩니다. 원형질막 단백질은 또한 거대피노좀에서 세포 표면으로 다시 재활용될 수 있습니다. 암 분야에서는 암세포에서 활성화되고 암세포의 영양 공급과 증식을 유지하는 데 도움이 되는 거대세포증가증(macropinocytosis)의 과정을 이해하기 위해 많은 관심이 집중되고 있다 2,4,5,6. 마크로피노세포증(Macropinocytosis)은 구조적으로 발생하며 면역 세포에서 수용체 매개 자극에 의해 추가로 유도될 수 있으며, 마크로피노좀은 수용체 신호 전달을 숙주하고, 항원 발현을 위한 엔도/리소좀 처리에 기여하며, 다양한 바이러스, 박테리아 및 기타 병원체에 대한 진입 포털을 제공합니다 ^3,7.

Macropinosomes는 독특하거나 독특한 마커가 거의 없습니다. 그들은 유체⁸을 삼킬 정도로 극적인 액틴이 풍부한 세포 표면 주름 장식의 기저부에서 형성되는 동안 가장 쉽게 식별됩니다. 폐쇄 직후, 마크로피노좀 주위의 F-액틴은 탈중합화되고, 마크로피노솜 자체는 동형형 및 이형형 융합, 세뇨관 및 수축과 관련된 동적 변화를 겪습니다⁹. Macropinosomes는 또한 특징적인 털이나 다른 특징이 없고 단순히 다양한 크기의 액포로 나타나기 때문에 초구조 수준에서 식별하기 어렵습니다. 명확한 멤브레인 마커가 없는 경우, 매크로피노솜은 가장 쉽고 전통적으로 유체 화물에 의해 정의되며, 이는 실험적으로 형광 덱스트란의 사용을 통해 이루어집니다. 덱스트란은 포도당 유래 복합 다당류로, 다량의 형광 또는 전자 밀도가 높은 마커에 결합할 수 있으며 세포에 의한 흡수를 위해 배지에 추가하거나 조직에서 흡수하기 위해 관류할 수 있습니다. 더욱이, 고분자량(MW) 덱스트란(70kDa)은 다른 더 작은 세포내포에 침투하지 않기 때문에 현재 거대세포소체에 대한 크기 선택 화물로 간주되며, 거대세포이입증^10,11에 대한 가장 흔한 표지가 되었습니다. 거대세포증가증(macropinocytosis)을 관찰하려면 일반적으로 형광 덱스트란 펄스로 세포를 배양하고 형광 이미징을 위해 고정 또는 살아있는 세포를 사용하여 거대피노솜의 세포 내부 덱스트란 라벨링 볼루스를 보는 것이 포함됩니다. 크기가 크기 때문에 표지되지 않은 매크로피노솜은 위상차 또는 명시야 현미경을 사용하여 일부 세포 유형에서도 볼 수 있으며, 여기서 매크로피노솜은 큰 흰색 빈 액포로 나타납니다. 일부 컨텍스트 정보는 세포의 위상차 이미지로부터 얻어지며, 이러한 이미지는 형광 덱스트란 흡수를 묘사하기 위해 형광 이미지와 추가로 오버레이 될 수 있습니다^12,13. 다양한 크기와 뚜렷한 라벨을 가진 Dextrans는 여러 세포 및 내세포 경로로의 체액 흡수를 모니터링하는 데 사용할 수 있으며^{, 10,14,15} 및 Dextran은 세포 배양에 적용하거나 생체 내 이미징¹⁶을 위해 마우스에 관류하거나 라이브 이미징을 위해 파리 배아¹⁷에 주입할 수 있습니다.

덱스트란을 사용하여 매크로피노좀을 추적할 때 발생하는 어려움 중 일부는 세포의 고정 또는 투과 후 매크로피노좀에서 누출되는 점, 공격적인 마크로피노솜증을 수행하지 않는 세포에서 수치가 희석되거나 검출하기 어려운 수준, 매크로피노좀 성숙 중 세포 내부의 동적 배치 및 분산 3 등을 포함합니다. 이러한 문제는 세포에 추가된 다음 씻겨 나간 덱스트란의 단일 펄스의 흡수를 추적하도록 설계된 대부분의 실험에서 복잡해집니다.

대신, 이 논문은 세포에 형광 덱스트란을 적용하고 라이브 이미징 중에 배지에 남겨두어 세포로의 지속적인 흡수를 기록하는 이점을 설명합니다. 이것은 거대피노솜과 후속 엔도솜에서 덱스트란 신호를 증폭시켜 전체 성숙 경로를 보여줍니다. 표지된 세포의 내부와 대조하여 표지된 거대피노좀을 고대비 역 설정으로 보면 거대피노솜의 모든 특징이 드러나고, 반대로 세포 외부에서는 고형광 매질이 세포 표면의 역동적인 주름을 강조합니다. 이 방법은 광 현미경, 컨포칼 이미징 및 상관 광 및 전자 현미경(CLEM)에 의한 세포 고정 후 감지를 위한 dextran의 라이브 이미징을 설명합니다. 여기에 포함된 이미징은 거대세포증가증이 매우 활발하고 빠른 활성 대식세포 및 미세아교세포를 포함한 이러한 접근법의 광범위한 적용 가능성을 입증하기 위해 다양한 세포 유형에 대해 수행되었으며, 거대세포증가증이 상대적으로 적은 암세포에서 수행되었습니다.

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프로토콜

1. 35mm 유리 바닥 접시에 세포 준비 (Day 0)

1. 가습된 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 10% 열 비활성화(RAW264.7의 경우) 또는 일반 태아 송아지 혈청 및 1% L-글루타민이 보충된 완전한 배지에서 세포주를 유지하고 계대절시킵니다.
2. 35mm 유리 바닥 접시에서 24시간 내에 60% 포화도를 달성하기 위해 적절한 수의 셀을 플레이트에 넣습니다.
   참고: 권장 세포 밀도는 여기에 설명된 RAW264.7, BV2 미세아교세포 및 MDA-MB 231 유방암 세포의 경우 0.15 x 10⁶ cells/mL 2mL에서 0.25 x 10⁶ cells/mL 사이입니다.

2. 형광 DNA 플라스미드 transfection(1일차) - 선택 사항

참고: 서로 다른 형광 표지된 단백질 및 프로브는 클론 세포주에서 일시적 또는 안정적으로 발현되어 초기 엔도솜, 후기 엔도솜 또는 리소좀과 같은 내세포 경로의 액틴 러플 및 구획을 특이적으로 라벨링할 수 있습니다.

1. 제조업체의 지침에 따라 지질 기반 transfection 키트를 사용하여 세포를 transfection하고, 조직 배양 후드에서 도금 1일 후에 수행합니다.
2. 2 μg의 내독소가 없는 정제된 DNA 플라스미드를 125 μL의 최소 필수 배지(환원된 혈청)에 희석합니다. 부드럽게 섞어 실온에서 5분 동안 그대로 두십시오.
3. 5 μL의 transfection agent를 125 μL의 최소 필수 배지(환원된 혈청)에 희석합니다. 부드럽게 섞어 실온에서 5분 동안 그대로 두십시오.
4. 희석된 DNA 플라스미드와 희석된 transfection 시약을 결합하고 세포에 적가하기 전에 10분 더 배양합니다.
5. 37°C의 transfection 복합체가 있는 세포를 가습된 5% CO2 배양기에서 3-4시간 동안 배양한 후 새로운 전체 배양 배지로 교체합니다.
6. transfection된 세포를 다음날 실험에 사용하거나 제한된 희석 클로닝을 적용하여 안정적으로 발현하는 세포주를 얻을 수 있습니다.

3. 세포내포(endocytic vesicles) 및 거대피노좀(macropinosome)의 시각화(2일차)

참고: 분자량이 다른 형광 덱스트랜스(Dextran Alexa Fluor 488/647, 10kDa MW에서 Dextran Oregon Green 488/Tetramethylrhodamine, 70kDa MW, 음이온성, 라이신 고정성)는 다양한 내세포 경로로의 유체상 흡수를 모니터링하는 데 사용됩니다¹⁴. 마크로피노좀에 대한 70kDa 덱스트란 및 모든 경로에 대한 10kDa.

1. 세포에 첨가하기 위해 예열된 배양 배지에서 200-500ng/mL에서 2x 농축 현탁액으로 덱스트란을 준비합니다.
2. 선택 사항: 실험은 내세포 활성에 영향을 미치기 위해 보충제 또는 약물의 사전 또는 동시 첨가를 요구할 수 있습니다. 예를 들어, 대식세포와 미세아교세포를 성장 인자(예: 200ng/mL CSF-1) 또는 활성화 리간드(예: LPS 100ng/mL 또는 300ng/mL CpG)로 전처리하여 주름 형성 및 거대세포증가증을 강화할 수 있습니다. 완전한 배지에서 덱스트란을 흡수하기 전에 12-16시간 동안 적절한 무혈청 배지에서 암세포를 배양합니다. 권장 세포 밀도는 1.2단계를 참조하십시오.
3. 라이브 이미징을 준비하기 위해 유리 바닥 접시에서 자란 세포를 37°C 가열 패드와 5% CO₂ 가습 인큐베이터가 장착된 도립 컨포칼 현미경의 스테이지에 배치합니다.
4. 잔여 배지를 흡입하여 유리 바닥 접시에 500μL의 전체 배지를 남겨둡니다.
5. 적절한 셀 영역을 찾고 초점을 설정합니다. 타임 랩스 이미징의 경우, 획득하기 전에 적절한 형광 레이저, 필터 및 설정을 미리 선택하십시오. 다음 설정을 사용하여 개별 세포와 매크로피노좀을 해결할 수 있습니다.
   1. 63x 1.4 NA 오일 이멀젼 Plan Apochromat 대물렌즈를 사용한 도립 컨포칼 현미경에서 관심 영역을 이미지화합니다.
   2. 이미지 크기는 512 x 512를 선택하고 빠른 이미징을 위해 양방향 스캔을 선택합니다.
   3. 세포의 개별 초점면에 초점을 맞춥니다. 단일 슬라이스로 캡처하도록 설정하거나 약 0.3μm의 광학 슬라이스 두께(Nyquist)를 설정하여 Z-스택으로 결합합니다.
   4. 특정 세포 유형에 따라 5-20분 사이의 시간 동안 45초 간격으로 타임랩스를 선택합니다.
   5. 하드웨어 자동 초점/초점 추적을 선택하여 특정 세포 유형에 따라 적절한 기간 동안 캡처하는 동안 이미지 안정화를 지원합니다.
   6. 동일한 부피의 2x dextran 스파이크 배지를 추가하고 대식세포에 대한 실시간 이미지 캡처를 즉시 시작합니다. MDA-MB 231 세포에서 느린 흡수를 이미징하기 전에 20분 정도 기다립니다.
      참고: 이 방법을 통해 두 개의 형광단 채널이 있는 BV2 세포는 덱스트란 혼합물 첨가 시 45분 동안 연속적으로 최대 속도 추적으로 단일 평면에서 성공적으로 이미징되었습니다. 거대세포증가증이 매우 빠르게 발생하는 RAW 264.7 세포에서 초기 거대피노솜을 검출하려면 단일 슬라이스(고속 이미징용) 또는 4-6 슬라이스의 Z 스택(3D 캡처용)을 획득하고 덱스트란을 추가한 후 20분 동안 5초 간격으로 타임 랩스를 수행합니다. MDA-MB 231 셀의 경우 40분 동안 5초 간격으로 10-15개 슬라이스 사이에서 최적의 Z 스택을 획득합니다.

4. 상관광 및 전자 현미경(CLEM)(3일차) - 선택 사항

1. 적응을 통해 프로토콜의 1, 2, 3단계에 따라 세포를 준비합니다. 간단히 말해서, 격자 무늬 유리 바닥 접시(35mm Dish, No. 1.5 Gridded coverslip, 14mm 유리 직경, 비코팅)에서 0.2 x 10⁶ cells/mL RAW264.7 세포를 성장시키고, 형광 플라스미드(예: mCherry-2xFYVE)로 transfection하고, 37°C, 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 20분 동안 dextran-488(70kDa)을 첨가하기 전에 밤새 방치합니다.
2. 얼음처럼 차가운 PBS 1mL로 세포를 신속하게 세척하고 0.1% 글루타르알데히드로 고정합니다.
3. 컨포칼 현미경에서 dextran-488 및 mCherry-2xFYKE의 고정 세포 이미지를 획득합니다.
4. 명시야 이미지를 캡처하여 앞서 설명한 바와 같이 투과 전자 현미경(EM)을 위해 접시를 처리하기 전에 그리드 위치를 식별합니다¹⁸. 간단히 말해서, 더 나아가, 세포를 2.5% 글루타르알데히드로 고정하고, 1% 환원된 사산화오스뮴으로 후미사를 고정하고, 2% 우라닐 아세테이트로 en-bloc 염색을 한 다음, LX112 수지에 삽입하기 전에 일련의 에탄올을 통해 탈수합니다. 블록에서 격자 위치를 절제하고 초소형 절편을 사용하여 초박형 부분을 수집합니다. 적절한 이미징 시스템 소프트웨어를 사용하여 80kV에서 전자 현미경으로 이미지를 캡처합니다.

5. 데이터 처리 및 시각화 (4일차)

참고: 오픈 소스 이미지 분석 패키지인 FIJI는 시각화 및 분석³³에 사용됩니다.

1. F.A.I.R. 데이터 원칙, 즉 연구 데이터가 검색 가능하고, 접근 가능하고, 상호 운용 가능하고, 재사용 가능하다는 것을 준수하기 위해 처리할 원시 데이터를 복제합니다.
2. 히스토그램 데이터를 사용하여 이미지 세트의 밝기와 대비를 동일하게 조정합니다.
3. 이미지를 획득한 Z-스택 이미지에서 최대 강도 투영으로 표시합니다.
4. 이미지 세트에 대한 축척 막대를 삽입합니다.
5. FOV 데이터 자르기/회전(선택 사항). 시계열 데이터에 대한 대표 패널을 만듭니다.
6. 추가 분석 및 정량화를 위해 세포에 흡수된 덱스트란의 형광 강도를 macropinocytosis 활성의 척도로 정량화합니다. 분석을 개별 세포로 제한하려면 여기에 설명된 이미징 방법을 사용하십시오.
   1. LUT를 반전시켜 형광이 없는 세포 영역의 색상을 뒤집어 임계값을 수행합니다.
   2. 전경 개체를 분할하고 셀 마스크를 만들어 개별 셀을 식별합니다.
   3. 세포 마스크를 개별 거대피노솜을 식별하고 측정하는 이전에 발표된 방법¹⁹ 과 함께 사용하십시오. 이러한 메트릭을 사용하여 크기, 수 및 세포당 총 흡수를 포함한 거대세포증가증을 정량화할 수 있습니다.

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결과

고농도의 형광 덱스트란에 담근 표지되지 않은 살아 있는 세포를 이미징하는 접근 방식은 거대세포증가증을 추적하기 위한 기존 이미징 기술에 비해 몇 가지 이점이 있습니다. 이미지를 릴리프하게 표시하면 세포체가 검은색으로 나타나고 밝은 형광 배경에서 극적인 세포 표면이 주름을 잡는 것을 더 잘 시각화할 수 있으며, 그림 1A와 같이 TMR 덱스...

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토론

이 논문은 형광 덱스트란으로 연속적으로 목욕하는 세포의 실시간 이미징과 라벨링되지 않은 세포의 검은색 배경에서의 흡수를 시각화하는 것을 기반으로 덱스트란 라벨링을 사용하여 거대세포증가증을 추적하는 보다 전통적인 방법의 변형을 설명합니다. 최적화된 프로토콜은 서로 다른 세포 내 소포를 구별할 수 있는 수단을 제공하고 여러 macropinocytotic 및 endocytic cargo...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% Osmium Tetroxide	ProSciTech	EMS19192
647-Transferrin	Molecular Probes, Invitrogen	T23366
BV2 cells	Gift kindly given to us by Dr Liviu Bodea (Queensland Brain Institute)	-
CpG (Class B) B	Integrated DNA Technologies	Custom Order
Dextran Alexa Fluor 488  at 10 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D22910
Dextran Alexa Fluor 647  at 10 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D22914
Dextran Oregon Green 488 at 70 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D1818
Dextran Tetramethylrhodamine at 70 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D7173
DMEM medium with sodium pyruvate and L-glutamine	Gibco Invitrogen	#11995
Fetal Calf serum	Interpath Services Pty Ltd	SFBS-F
Glutaraldehyde aqueous solution, EM Grade 25%	ProSciTech	C002
Jeol 1011 electron microscope	JEOL	-
L-Glutamine	Gibco Invitrogen	25030081
Lipofectamine 2000	Gibco Invitrogen	11668019
MatTek  Glass Bottom Dish 35 mm, uncoated grid	MatTek Corporation	P35G-2-14-CGRD
MatTek glass bottom dishes 35 mm uncoated	MatTek Corporation	P35G-1.5-14C
MDA-MB 231 cells	ATCC	HTB-26
Opti-MEM reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific	31985088
Plasmid mCherry-2XFYVE	Gift kindly given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)	-
Plasmid mCherry-PLCδ-PH	Gift kindly given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)	-
Raw264.7 cells	ATCC	TIB-71
RPMI medium 1640,without L-glutamine	Gibco Invitrogen	#21870
Ultrapure LPS	Jomar Life Research Pte Ltd	TLR-3PELPS
Uranyl Acetate	ProSciTech	C079
Zeiss inverted LSM880 confocal microscope	Zeiss	-