Fluorescence en direct, imagerie inverse du bourrelet cellulaire et macropinocytose

Résumé

Ce protocole démontre l’imagerie du dextran dans des cellules vivantes à l’aide d’une absorption continue et d’images inverses pour optimiser la visualisation du froissement, la maturation des macropinosomes et l’analyse du dextran et d’autres marquages cellulaires.

Résumé

La macropinocytose est un processus hautement conservé mais encore incomplètement compris, essentiel à l’absorption et à l’ingestion de liquides, de nutriments en phase liquide et d’autres matériaux dans les cellules. L’extension spectaculaire des volants de surface cellulaire, leur fermeture pour former des macropinosomes et la maturation des macropinosomes internalisés sont des événements clés de cette voie qui peuvent être difficiles à capturer à l’aide de l’imagerie confocale conventionnelle basée sur le suivi d’un bolus de cargaison fluorescente. Les dextrans fluorescents sont couramment utilisés expérimentalement comme marqueurs de phase fluide pour les macropinosomes et pour d’autres voies endocytaires. Une méthode adoptée par le laboratoire pour optimiser l’imagerie de l’absorption de dextran consiste à utiliser l’imagerie en direct de cellules baignées dans de fortes concentrations de dextran fluorescent dans le milieu, les cellules non marquées apparaissant en relief (sous forme de noir). Les volants cellulaires sont mis en évidence pour visualiser la fermeture du volant, et les macropinosomes internalisés apparaissent sous forme de vacuoles fluorescentes à l’intérieur des cellules. Cette méthode est optimale pour visualiser les caractéristiques des macropinosomes et permet une segmentation et une quantification faciles. Cet article décrit le double marquage de voies avec des dextrans de différentes tailles et la co-expression de sondes lipidiques et de protéines membranaires fluorescentes pour marquer les macropinosomes et autres endosomes. La détection du dextran internalisé à un niveau ultrastructural à l’aide de la microscopie corrélative à la lumière et à l’électronique (CLEM) est également démontrée. Ces processus cellulaires peuvent être imagés à l’aide de plusieurs modalités d’imagerie en direct, y compris en 3D. Ensemble, ces approches optimisent l’imagerie des macropinosomes pour de nombreux contextes et systèmes expérimentaux différents.

Introduction

La plupart des types de cellules de vertébrés partagent la capacité innée d’absorption non sélective de liquide avec leurs prédécesseurs tout au long de l’évolution, remontant à l’amibe unicellulaire¹. Ce processus hautement conservé d’absorption de la phase liquide par macropinocytose (grande consommation d’alcool) est utilisé par les amibes principalement pour l’acquisition de nutriments¹, tandis que dans les cellules de vertébrés, il peut également être une voie d’approvisionnement pour obtenir des nutriments en cas de stress, et il est utilisé par les cellules immunitaires pour l’échantillonnage et la surveillance des environnements tissulaires². La macropinocytose présente des caractéristiques qui la distinguent des autres formes d’endocytose, notamment les macropinosomes vacuolaires distinctifs (>0,2 mm de diamètre), la nature non sélective de l’absorption de liquide et de soluté et les étendues de membrane plasmique qui l’accompagnent qui sont internalisées de manière opportuniste dans les macropinosomes³. La nature non sélective de cette absorption signifie que le tri et le recyclage doivent se faire rapidement pour sauver les protéines solubles essentielles et les protéines membranaires plasmiques en les recyclant à la surface de la cellule. Une grande partie du matériel absorbé dans les macropinosomes est destinée à la dégradation dans les lysosomes, et il est acheminé dans les voies endo/lysosomales par la maturation des macropinosomes et la fusion avec d’autres endosomes. Les protéines de la membrane plasmique peuvent également être recyclées à la surface cellulaire à partir des macropinosomes. Le domaine du cancer suscite un vif intérêt pour la compréhension du processus de macropinocytose, qui est activé dans les cellules cancéreuses et aide à maintenir leur nutrition et leur prolifération 2,4,5,6. La macropinocytose se produit à la fois de manière constitutive et peut être induite lors d’une stimulation médiée par les récepteurs dans les cellules immunitaires, où les macropinosomes hébergent la signalisation des récepteurs, contribuent au traitement endo/lysosomal pour la présentation de l’antigène et fournissent une porte d’entrée pour une variété de virus, de bactéries et d’autres agents pathogènes ^3,7.

Les macropinosomes ont peu de marqueurs distinctifs ou uniques. Ils sont plus facilement identifiés lors de leur formation à la base de volants cellulaires spectaculaires et riches en actine, qui sont près d’engloutir le liquide⁸. Immédiatement après la fermeture, l’actine F autour des macropinosomes est dépolymérisée et les macropinosomes eux-mêmes subissent des changements dynamiques associés à la fusion, à la tubulation et au rétrécissement homo- et hétérotypiques⁹. Les macropinosomes sont également difficiles à identifier à un niveau ultrastructurel car ils n’ont pas de manteau caractéristique ou d’autres caractéristiques et apparaissent simplement comme des vacuoles de tailles variables. En l’absence de marqueurs membranaires définitifs, les macropinosomes sont plus facilement et traditionnellement définis par leur cargaison fluide, ce qui, expérimentalement, se fait par l’utilisation de dextran fluorescent. Le dextran est un polysaccharide complexe dérivé du glucose qui peut être couplé à un large éventail de marqueurs fluorescents ou denses en électrons et ajouté au milieu pour être absorbé par les cellules ou perfusé pour être absorbé dans les tissus. De plus, le dextran de grand poids moléculaire (MW) (70 kDa) est maintenant considéré comme une cargaison sélective pour les macropinosomes car il ne pénètre pas dans d’autres vésicules endocytaires plus petites, et il est devenu le marqueur le plus courant pour la macropinocytose^10,11. L’observation de la macropinocytose implique généralement l’incubation de cellules avec une impulsion de dextran fluorescent et l’utilisation de cellules fixes ou vivantes pour l’imagerie de fluorescence afin de visualiser le marquage du bolus de dextran à l’intérieur des cellules des macropinosomes. En raison de leur grande taille, les macropinosomes non marqués peuvent également être observés dans certains types de cellules à l’aide de la microscopie à contraste de phase ou à fond clair, dans laquelle les macropinosomes apparaissent sous la forme de grandes vacuoles blanches vides. Certaines informations contextuelles sont obtenues à partir des images en contraste de phase des cellules, et ces images peuvent ensuite être superposées avec des images de fluorescence pour décrire l’absorption de dextran fluorescent^12,13. Des dextrans de différentes tailles et avec des marqueurs distincts peuvent être utilisés pour surveiller l’absorption de liquide dans plusieurs voies cellulaires et endocytaires ^10,14,15 et le dextran peut être appliqué à des cultures cellulaires ou perfusé à des souris pour l’imagerie intra-vitale¹⁶ ou même injecté dans des embryons de mouches¹⁷ pour l’imagerie en direct.

Parmi les difficultés rencontrées lors de l’utilisation du dextran pour suivre les macropinosomes, citons sa fuite hors des macropinosomes après la fixation ou la perméabilisation des cellules, ses niveaux dilués ou difficiles à détecter dans les cellules qui n’effectuent pas de macropinocytose agressive, et son déploiement dynamique et sa dispersion à l’intérieur des cellules pendant la maturation des macropinosomes³. Ces problèmes sont aggravés dans la plupart des expériences, qui sont conçues pour suivre l’absorption d’une seule impulsion de dextran ajoutée aux cellules puis lavée.

Au lieu de cela, cet article décrit les avantages de l’application de dextran fluorescent sur les cellules et de le laisser dans le milieu pendant l’imagerie en direct pour enregistrer l’absorption continue dans les cellules. Cela amplifie le signal dextran dans les macropinosomes et les endosomes ultérieurs, montrant ainsi toute la voie de maturation. L’observation des macropinosomes marqués sur l’intérieur non marqué (noir) des cellules, en tant que réglage inverse à contraste élevé, révèle toutes les caractéristiques des macropinosomes et, inversement, à l’extérieur des cellules, le milieu hautement fluorescent met en évidence le froissement dynamique de la surface cellulaire. Cette méthode décrit l’imagerie en direct du dextran pour la microscopie optique, l’imagerie confocale, et pour sa détection après fixation cellulaire par microscopie corrélative à la lumière et au microscope électronique (CLEM). L’imagerie incluse ici a été réalisée sur différents types de cellules pour démontrer la large applicabilité de ces approches, y compris les macrophages activés et les cellules microgliales, où la macropinocytose est très active et rapide, et dans les cellules cancéreuses où la macropinocytose est relativement moins abondante.

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Protocole

1. Préparation des cellules sur des plats à fond de verre de 35 mm (Jour 0)

1. Maintenir et faire passer des lignées cellulaires en milieu complet complété par 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (pour RAW264.7) ou régulier et 1 % de L-glutamine, à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO₂ .
2. Plaquez le nombre approprié de cellules pour obtenir une confluence de 60 % en 24 h, sur des plats à fond de verre de 35 mm.
   REMARQUE : La densité cellulaire recommandée est comprise entre 2 mL de 0,15 x 10⁶ cellules/mL et 0,25 x 10⁶ cellules/mL pour les cellules microgliales RAW264.7, BV2 et MDA-MB 231 cellules cancéreuses du sein décrites ici.

2. Transfection de plasmide d’ADN par fluorescence (Jour 1) - Facultatif

REMARQUE : Différentes protéines et sondes marquées par fluorescence peuvent être exprimées de manière transitoire ou stable dans des lignées cellulaires clonées pour marquer spécifiquement les volants et les compartiments d’actine dans la voie endocytaire tels que les endosomes précoces, les endosomes tardifs ou les lysosomes.

1. Transfecter les cellules à l’aide d’un kit de transfection à base de lipides selon les instructions du fabricant, 1 jour après le placage dans une hotte de culture tissulaire.
2. Diluer 2 μg de plasmide d’ADN purifié exempt d’endotoxines dans 125 μL de milieu essentiel minimum (sérum réduit). Mélangez délicatement et laissez reposer 5 min à température ambiante.
3. Diluer 5 μL d’agent de transfection dans 125 μL de milieu essentiel minimum (sérum réduit). Mélangez délicatement et laissez reposer 5 min à température ambiante.
4. Combinez le plasmide d’ADN dilué et le réactif de transfection dilué et incubez pendant encore 10 minutes avant d’ajouter goutte à goutte aux cellules.
5. Incuber les cellules avec complexe de transfection à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 pendant 3-4 h, avant de les remplacer par un milieu de culture frais et complet.
6. Utilisez les cellules transfectées le lendemain pour des expériences ou soumises à un clonage à dilution limitée pour obtenir des lignées cellulaires exprimant de manière stable.

3. Visualisation des vésicules endocytaires et des macropinosomes (Jour 2)

REMARQUE : Des dextrans fluorescents (Dextran Alexa Fluor 488/647 à 10 kDa MW, et Dextran Oregon Green 488/Tetramethylrhodamine à 70 kDa MW, Anionic, Lysine fixable) de différents poids moléculaires sont utilisés pour surveiller l’absorption de la phase liquide dans une gamme de voies endocytaires¹⁴. 70 kDa de dextran pour les macropinosomes et 10 kDa pour toutes les voies.

1. Préparer le dextran sous forme de suspension concentrée 2x à 200-500 ng/mL dans un milieu de culture préchauffé pour l’ajout aux cellules.
2. FACULTATIF : Les expériences peuvent nécessiter l’ajout préalable ou simultané de suppléments ou de médicaments pour influencer l’activité endocytaire. Par exemple, prétraitez les macrophages et les cellules microgliales avec des facteurs de croissance (par exemple, 200 ng/mL de CSF-1) ou des ligands activateurs (par exemple, LPS 100 ng/mL ou 300 ng/mL de CpG) pour améliorer le froncement et la macropinocytose. Cultivez les cellules cancéreuses dans un milieu exempt de sérum approprié pendant 12 à 16 h avant l’absorption du dextran dans le milieu complet. Reportez-vous à l’étape 1.2 pour la densité cellulaire recommandée.
3. Pour se préparer à l’imagerie en direct, positionnez les cellules cultivées dans des boîtes à fond de verre sur la platine d’un microscope confocal inversé équipé d’un coussin chauffant à 37 °C et d’un incubateur humidifié à 5 % de CO₂ .
4. Aspirez l’excédent de fluide en laissant 500 μL du fluide complet dans le plat à fond de verre.
5. Trouvez une région appropriée de cellules et réglez la mise au point. Pour l’imagerie en accéléré, présélectionnez les lasers à fluorescence, les filtres et les paramètres appropriés avant l’acquisition. Utilisez les paramètres suivants pour résoudre les cellules individuelles et les macropinosomes.
   1. Imagez la région d’intérêt sur un microscope confocal inversé avec un objectif apochromatique Plan d’immersion dans l’huile 63x 1,4 NA.
   2. Sélectionnez 512 x 512 pour la taille de l’image, balayage bidirectionnel pour une imagerie rapide.
   3. Concentrez-vous sur un plan focal individuel des cellules. Définir pour capturer en une seule tranche ou définir une épaisseur de tranche optique (Nyquist) d’environ 0,3 μm pour combiner en Z-stacks.
   4. Sélectionnez le time-lapse avec un intervalle de 5 s, pour une durée comprise entre 20 et 45 min selon les types de cellules spécifiques.
   5. Sélectionnez la mise au point automatique/le suivi de la mise au point matérielle pour faciliter la stabilisation de l’image pendant la capture pendant une durée appropriée en fonction des types de cellules spécifiques.
   6. Ajoutez un volume égal de milieu dopé au dextran 2x et démarrez immédiatement la capture d’images en direct pour les macrophages. Attendez 20 min avant d’imager l’absorption plus lente dans les cellules MDA-MB 231.
      REMARQUE : Avec cette méthode, les cellules BV2 avec deux canaux fluorophores ont été imagées avec succès sur un seul plan avec suivi de vitesse maximale, en continu pendant 45 min lors de l’ajout du mélange de dextran. Pour détecter les macropinosomes précoces dans les cellules RAW 264.7, où la macropinocytose se produit très rapidement, acquérez une tranche unique (pour l’imagerie rapide) ou une pile Z de 4 à 6 tranches (pour la capture 3D) et un time-lapse avec un intervalle de 5 s pendant 20 min lors de l’ajout de dextran. Pour les cellules MDA-MB 231, obtenez des piles Z optimales entre 10 et 15 tranches, avec des intervalles de 5 s pendant 40 minutes.

4. Microscopie corrélative à la lumière et électronique (CLEM) (Jour 3) - Facultatif

1. Préparez les cellules selon les étapes 1, 2 et 3 du protocole avec les adaptations. En bref, faire pousser 0,2 x 10 cellules RAW264.7 de⁶ cellules/ml sur des plats à fond de verre grillagé (plat de 35 mm, lamelle quadrillée n° 1.5, diamètre du verre de 14 mm, non revêtu), transfecter avec un plasmide fluorescent (par exemple, mCherry-2xFYVE) et laisser reposer toute la nuit avant l’ajout de dextran-488 (70 kDa) pendant 20 minutes à 37 °C, incubateur humidifié à 5 % de CO₂ .
2. Lavez rapidement les cellules avec 1 ml de PBS glacé et fixez avec 0,1 % de glutaraldéhyde.
3. Acquérez les images de cellules fixes du dextran-488 et du mCherry-2xFYVE sur un microscope confocal.
4. Capturez des images en fond clair pour identifier les positions de la grille avant que les paraboles ne soient traitées pour la microscopie électronique à transmission (EM), comme décrit précédemment¹⁸. En bref, fixez les cellules dans du glutaraldéhyde à 2,5 %, postfixez dans du tétroxyde d’osmium réduit à 1 %, coloriez en bloc avec de l’acétate d’uranyle à 2 %, puis déshydratez-les à travers une série d’éthanol avant de les intégrer dans de la résine LX112. Excisez les emplacements quadrillés du bloc et collectez les sections ultra-minces à l’aide d’un ultra-microtome. Capturez des images au microscope électronique à 80 kV à l’aide d’un logiciel de système d’imagerie approprié.

5. Traitement et visualisation des données (jour 4)

REMARQUE : FIJI - un progiciel d’analyse d’images open source - est utilisé pour la visualisation et l’analyse³³.

1. Dupliquer les données brutes pour le traitement afin de se conformer aux principes de données F.A.I.R., c’est-à-dire que les données de recherche sont trouvables, accessibles, interopérables et réutilisables.
2. Ajustez la luminosité et le contraste des jeux d’images de manière égale à l’aide des données de l’histogramme.
3. Affichez les images sous forme de projections d’intensité maximale à partir des images de la pile Z acquises.
4. Insérer une barre d’échelle pour les visionneuses d’images.
5. Recadrer/faire pivoter les données FOV (facultatif). Créez des panneaux représentatifs pour les données de séries chronologiques.
6. Pour une analyse et une quantification plus approfondies, quantifiez l’intensité de fluorescence du dextran absorbé dans les cellules comme mesure de l’activité de la macropinocytose. Pour limiter l’analyse à des cellules individuelles, utilisez la méthode d’imagerie décrite ici.
   1. Inversez la LUT pour inverser la couleur des zones de cellules dépourvues de fluorescence afin d’effectuer le seuillage.
   2. Segmentez l’objet de premier plan et créez un masque de cellule pour identifier les cellules individuelles.
   3. Utilisez le masque cellulaire en conjonction avec une méthode¹⁹ précédemment publiée qui identifie et mesure les macropinosomes individuels. Utilisez ces paramètres pour quantifier la macropinocytose, y compris la taille, le nombre et l’absorption totale par cellule.

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Résultats

L’approche consistant à imager des cellules vivantes non marquées immergées dans une forte concentration de dextran fluorescent présente plusieurs avantages par rapport aux techniques d’imagerie conventionnelles pour le suivi de la macropinocytose. En présentant les images en relief, les corps cellulaires apparaissent en noir et permettent une meilleure visualisation de la surface cellulaire spectaculaire sur un fond brillant et fluorescent, suivie d’une internalisation en pha...

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Discussion

Cet article décrit des variantes de méthodes plus traditionnelles d’utilisation du marquage au dextran pour suivre la macropinocytose, basées sur l’imagerie en direct de cellules baignées en continu dans du dextran fluorescent et la visualisation de l’absorption sur fond noir de cellules non marquées. Le protocole optimisé fournit les moyens de distinguer les différentes vésicules intracellulaires et permet un suivi spatio-temporel de plusieurs cargaisons et protéines macr...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% Osmium Tetroxide	ProSciTech	EMS19192
647-Transferrin	Molecular Probes, Invitrogen	T23366
BV2 cells	Gift kindly given to us by Dr Liviu Bodea (Queensland Brain Institute)	-
CpG (Class B) B	Integrated DNA Technologies	Custom Order
Dextran Alexa Fluor 488  at 10 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D22910
Dextran Alexa Fluor 647  at 10 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D22914
Dextran Oregon Green 488 at 70 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D1818
Dextran Tetramethylrhodamine at 70 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D7173
DMEM medium with sodium pyruvate and L-glutamine	Gibco Invitrogen	#11995
Fetal Calf serum	Interpath Services Pty Ltd	SFBS-F
Glutaraldehyde aqueous solution, EM Grade 25%	ProSciTech	C002
Jeol 1011 electron microscope	JEOL	-
L-Glutamine	Gibco Invitrogen	25030081
Lipofectamine 2000	Gibco Invitrogen	11668019
MatTek  Glass Bottom Dish 35 mm, uncoated grid	MatTek Corporation	P35G-2-14-CGRD
MatTek glass bottom dishes 35 mm uncoated	MatTek Corporation	P35G-1.5-14C
MDA-MB 231 cells	ATCC	HTB-26
Opti-MEM reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific	31985088
Plasmid mCherry-2XFYVE	Gift kindly given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)	-
Plasmid mCherry-PLCδ-PH	Gift kindly given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)	-
Raw264.7 cells	ATCC	TIB-71
RPMI medium 1640,without L-glutamine	Gibco Invitrogen	#21870
Ultrapure LPS	Jomar Life Research Pte Ltd	TLR-3PELPS
Uranyl Acetate	ProSciTech	C079
Zeiss inverted LSM880 confocal microscope	Zeiss	-