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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo muestra la obtención de imágenes de dextrano en células vivas utilizando la absorción continua y las imágenes inversas para optimizar la visualización de la ondulación, la maduración de los macropinosomas y el análisis del dextrano y otros marcadores celulares.

Resumen

La macropinocitosis es un proceso altamente conservado, pero aún no completamente comprendido, que es esencial para la absorción e ingestión de líquidos, nutrientes en fase fluida y otros materiales en las células. La dramática extensión de los nervios de la superficie celular, su cierre para formar macropinosomas y la maduración de los macropinosomas internalizados son eventos clave en esta vía que pueden ser difíciles de capturar utilizando imágenes confocales convencionales basadas en el seguimiento de un bolo de carga fluorescente. Los dextranos fluorescentes se utilizan habitualmente experimentalmente como marcadores de fase fluida para los macropinosomas y para otras vías endocíticas. Un método que el laboratorio ha adoptado para optimizar la obtención de imágenes de la absorción de dextrano implica el uso de imágenes en vivo de células bañadas en altas concentraciones de dextrano fluorescente en el medio, con las células no marcadas que aparecen en relieve (como negras). Los pliegues celulares se resaltan para visualizar el cierre de los volantes, y los macropinosomas internalizados aparecen como vacuolas fluorescentes en el interior de la célula. Este método es óptimo para visualizar las características de los macropinosomas y permite una fácil segmentación y cuantificación. Este artículo describe el marcaje dual de vías con dextranos de diferentes tamaños y la coexpresión de sondas lipídicas y proteínas de membrana fluorescente para demarcar macropinosomas y otros endosomas. También se demuestra la detección de dextrano internalizado a nivel ultraestructural mediante microscopía óptica y electrónica correlativa (CLEM). Estos procesos celulares se pueden visualizar utilizando múltiples modalidades de imágenes en vivo, incluso en 3D. En conjunto, estos enfoques optimizan la obtención de imágenes de macropinosomas para muchos entornos y sistemas experimentales diferentes.

Introducción

La mayoría de los tipos de células de vertebrados comparten la capacidad innata para la absorción no selectiva de líquido con sus predecesores a lo largo de la evolución, que se remontan a la ameba unicelular1. Este proceso altamente conservado de absorción de la fase líquida por la macropinocitosis (gran bebida) es utilizado por las amebas principalmente para la adquisición de nutrientes1, mientras que en las células de vertebrados, puede ser igualmente una ruta de suministro para la obtención de nutrientes bajo estrés, y es utilizado por las células inmunitarias para el muestreo y la vigilancia de los entornos tisulares2. La macropinocitosis tiene características que la distinguen de otras formas de endocitosis, incluyendo los macropinosomas vacuolares distintivos de gran tamaño (>0,2 mm de diámetro), la naturaleza no selectiva de la absorción de líquidos y solutos y las extensiones de membrana plasmática que la acompañan y que se internalizan de manera oportunista en macropinosomas3. La naturaleza no selectiva de esta absorción significa que la clasificación y el reciclaje deben ocurrir rápidamente para rescatar las proteínas solubles y de membrana plasmática esenciales reciclándolas de nuevo a la superficie celular. Gran parte del material que se introduce en los macropinosomas está destinado a la degradación en los lisosomas, y se canaliza hacia las vías endo/lisosomales a través de la maduración y fusión de los macropinosomas con otros endosomas. Las proteínas de la membrana plasmática también se pueden reciclar de nuevo a la superficie celular desde los macropinosomas. Existe un gran interés en el campo del cáncer por comprender el proceso de la macropinocitosis, que se activa en las células cancerosas y ayuda a mantener su nutrición y proliferación 2,4,5,6. La macropinocitosis ocurre de manera constitutiva y puede ser inducida aún más por la estimulación mediada por receptores en las células inmunitarias, donde los macropinosomas albergan la señalización del receptor, contribuyen al procesamiento endo/lisosomal para la presentación de antígenos y proporcionan un portal de entrada para una variedad de virus, bacterias y otros patógenos 3,7.

Los macropinosomas tienen pocos marcadores distintivos o únicos. Se identifican más fácilmente durante su formación en la base de las dramáticas ondulaciones de la superficie celular ricas en actina, que se acercan a engullir el líquido8. Inmediatamente después del cierre, la F-actina alrededor de los macropinosomas se despolimeriza, y los propios macropinosomas experimentan cambios dinámicos asociados con la fusión, tubulación y contracción homo y heterotípicas9. Los macropinosomas también son difíciles de identificar a nivel ultraestructural, ya que no tienen capas características u otros rasgos y aparecen simplemente como vacuolas de diferentes tamaños. Sin marcadores de membrana definitivos, los macropinosomas se definen más fácil y tradicionalmente por su carga de fluido, que experimentalmente es a través del uso de dextrano fluorescente. El dextrano es un polisacárido complejo derivado de la glucosa que puede acoplarse a una gran variedad de marcadores fluorescentes o densos en electrones y añadirse al medio para su absorción por las células o perfundirse para su absorción en los tejidos. Por otra parte, el dextrano de gran peso molecular (MW) (70 kDa) se considera ahora como una carga selectiva de tamaño para los macropinosomas, ya que no entra en otras vesículas endocíticas más pequeñas, y se ha convertido en la etiqueta más común para la macropinocitosis10,11. La visualización de la macropinocitosis generalmente implica la incubación de células con un pulso de dextrano fluorescente y el uso de células fijas o vivas para imágenes de fluorescencia para ver el bolo de marcaje de dextrano dentro de las células de los macropinosomas. Debido a su gran tamaño, los macropinosomas no marcados también se pueden ver en algunos tipos de células mediante contraste de fase o microscopía de campo claro, en la que los macropinosomas aparecen como grandes vacuolas blancas vacías. Se obtiene cierta información contextual de las imágenes de contraste de fase de las células, y estas imágenes se pueden superponer adicionalmente con imágenes de fluorescencia para representar la absorción de dextrano fluorescente12,13. Los dextranos de diferentes tamaños y con etiquetas distintas se pueden utilizar para monitorizar la absorción de líquidos en múltiples vías celulares y endocíticas 10,14,15 y el dextrano pueden aplicarse a cultivos celulares o perfundirse en ratones para la obtención de imágenes intravitales16 o incluso inyectarse en embriones de mosca17 para la obtención de imágenes en vivo.

Algunas de las dificultades en las que se incurre en el uso de dextrano para rastrear los macropinosomas incluyen su fuga de los macropinosomas después de la fijación o permeabilización de las células, sus niveles diluidos o difíciles de detectar en las células que no realizan una macropinocitosis agresiva, y su despliegue dinámico y dispersión dentro de las células durante la maduración de los macropinosomas3. Estos problemas se agravan en la mayoría de los experimentos, que están diseñados para rastrear la absorción de un solo pulso de dextrano agregado a las células y luego lavado.

En cambio, este artículo describe las ventajas de aplicar dextrano fluorescente a las células y dejarlo en el medio durante la obtención de imágenes en vivo para registrar la absorción continua en las células. Esto amplifica la señal de dextrano en los macropinosomas y endosomas posteriores que muestran toda la vía de maduración. La visualización de los macropinosomas marcados contra el interior no marcado (negro) de las células, como una configuración inversa de alto contraste, revela todas las características de los macropinosomas y, a la inversa, fuera de las células, el medio altamente fluorescente destaca la ondulación dinámica de la superficie celular. Este método describe la obtención de imágenes en vivo de dextrano para microscopía óptica, imágenes confocales y para su detección después de la fijación celular mediante microscopía óptica y electrónica correlativa (CLEM). Las imágenes incluidas aquí se realizaron en diferentes tipos de células para demostrar la amplia aplicabilidad de estos enfoques, incluidos los macrófagos activados y las células microgliales, donde la macropinocitosis es muy activa y rápida, y en células cancerosas donde la macropinocitosis es relativamente menos abundante.

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Protocolo

1. Preparación de celdas en platos con fondo de vidrio de 35 mm (Día 0)

  1. Mantener y pasar líneas celulares en medio completo suplementado con un 10% de suero de ternero fetal regular o inactivado por calor (para RAW264.7) y L-glutamina al 1%, a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 .
  2. Coloque el número adecuado de celdas para lograr un 60% de confluencia en 24 h, en platos con fondo de vidrio de 35 mm.
    NOTA: La densidad celular recomendada está entre 2 mL de 0,15 x 106 células/mL y 0,25 x 106 células/mL para las células de cáncer de mama RAW264.7, BV2 y MDA-MB 231 descritas aquí.

2. Transfección de plásmidos de ADN con fluorescencia (Día 1) - Opcional

NOTA: Diferentes proteínas y sondas marcadas con fluorescencia pueden expresarse de forma transitoria o estable en líneas celulares clonadas para marcar específicamente los pliegues y compartimentos de actina en la vía endocítica, como los endosomas tempranos, los endosomas tardíos o los lisosomas.

  1. Transfecte las células utilizando un kit de transfección a base de lípidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante, 1 día después de la siembra en una campana de cultivo de tejidos.
  2. Diluir 2 μg de plásmido de ADN purificado libre de endotoxinas en 125 μL de medio esencial mínimo (suero reducido). Mezclar suavemente y dejar reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  3. Diluir 5 μL de agente de transfección en 125 μL de medio esencial mínimo (suero reducido). Mezclar suavemente y dejar reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  4. Combine el plásmido de ADN diluido y el reactivo de transfección diluido e incube durante otros 10 minutos antes de añadir gota a gota a las células.
  5. Incubar las células con complejo de transfección a 37 °C en una incubadora humidificada de CO2 al 5% durante 3-4 h, antes de sustituirlas por un medio de cultivo completo fresco.
  6. Utilice las células transfectadas al día siguiente para experimentos o someta a clonación de dilución limitada para obtener líneas celulares que se expresen de manera estable.

3. Visualización de vesículas endocíticas y macropinosomas (Día 2)

NOTA: Los dextranos fluorescentes (Dextran Alexa Fluor 488/647 a 10 kDa MW, y Dextran Oregon Green 488/Tetrametilrodamina a 70 kDa MW, aniónicos, fijables en lisina) de diferentes pesos moleculares se utilizan para controlar la absorción en fase fluida en una serie de vías endocíticas14. 70 kDa de dextrano para los macropinosomas y 10 kDa para todas las vías.

  1. Prepare dextrano (s) como una suspensión concentrada 2x a 200-500 ng/mL en medio de cultivo precalentado para agregarlo a las células.
  2. OPCIONAL: Los experimentos pueden requerir la adición previa o simultánea de suplementos o fármacos para influir en la actividad endocítica. Por ejemplo, pretratar los macrófagos y las células microgliales con factores de crecimiento (p. ej., 200 ng/mL de CSF-1) o ligandos activadores (p. ej., LPS 100 ng/mL o 300 ng/mL de CpG) para mejorar la irritación y la macropinocitosis. Cultivar las células cancerosas en un medio adecuado sin suero durante 12-16 h antes de la absorción de dextrano en el medio completo. Consulte el paso 1.2 para conocer la densidad de celdas recomendada.
  3. Para prepararse para la obtención de imágenes en vivo, coloque las células cultivadas en placas con fondo de vidrio en la platina de un microscopio confocal invertido equipado con una almohadilla térmica a 37 °C y una incubadora humidificada al 5% deCO2 .
  4. Aspirar el exceso de medio dejando 500 μL del medio completo en el plato con fondo de vidrio.
  5. Encuentre una región adecuada de las celdas y establezca el enfoque. Para obtener imágenes de lapso de tiempo, preseleccione los láseres de fluorescencia, los filtros y los ajustes adecuados antes de la adquisición. Utilice los siguientes ajustes para resolver células individuales y macropinosomas.
    1. Visualice la región de interés en un microscopio confocal invertido con un objetivo Plan Apochromat de inmersión en aceite de 63x 1.4 NA.
    2. Seleccione 512 x 512 para el tamaño de la imagen, escaneo bidireccional para imágenes rápidas.
    3. Enfoque en un plano focal individual de las células. Se configura para capturar como un solo corte o establezca un grosor de corte óptico (Nyquist) de aproximadamente 0,3 μm para combinar como pilas Z.
    4. Seleccione un lapso de tiempo con un intervalo de 5 s, para una duración de entre 20 y 45 minutos, dependiendo de los tipos de celda específicos.
    5. Seleccione el enfoque automático/seguimiento de enfoque por hardware para ayudar en la estabilización de la imagen durante la captura durante un período adecuado de acuerdo con los tipos de celda específicos.
    6. Agregue un volumen igual de medio enriquecido con dextrano 2x e inicie la captura de imágenes en vivo de inmediato para los macrófagos. Espere 20 minutos antes de obtener imágenes de la absorción más lenta en las células MDA-MB 231.
      NOTA: Con este método, las células BV2 con dos canales de fluoróforo se obtuvieron con éxito en un solo plano con seguimiento de velocidad máxima, de forma continua durante 45 minutos tras la adición de la mezcla de dextrano. Para detectar macropinosomas tempranos en células RAW 264.7, donde la macropinocitosis ocurre muy rápidamente, adquiera un solo corte (para imágenes rápidas) o una pila Z de 4-6 cortes (para captura 3D) y un lapso de tiempo con un intervalo de 5 s durante 20 minutos tras la adición de dextrano. Para las celdas MDA-MB 231, adquiera pilas Z óptimas entre 10 y 15 cortes, con intervalos de 5 s durante 40 minutos.

4. Microscopía correlativa de luz y electrónica (CLEM) (Día 3) - Opcional

  1. Prepare las celdas de acuerdo con los pasos 1, 2 y 3 del protocolo con adaptaciones. En resumen, cultive 0,2 x 106 células/mL RAW264,7 células en placas con fondo de vidrio cuadriculado (plato de 35 mm, cubreobjetos rejiculados n.º 1,5, diámetro de vidrio de 14 mm, sin recubrimiento), transfecte con un plásmido fluorescente (por ejemplo, mCherry-2xFYVE) y déjelo toda la noche antes de la adición de dextran-488 (70 kDa) durante 20 minutos a 37 °C, incubadora humidificada con 5% de CO2 .
  2. Lave las células rápidamente con 1 ml de PBS helado y fije con glutaraldehído al 0,1%.
  3. Adquiera las imágenes de célula fija del dextran-488 y mCherry-2xFYVE en un microscopio confocal.
  4. Capturar imágenes de campo claro para identificar las posiciones de la rejilla antes de que las antenas se procesen para la microscopía electrónica de transmisión (EM) como se describió anteriormente18. En resumen, además, fije las células en glutaraldehído al 2,5%, postfije en tetróxido de osmio reducido al 1%, manche en bloque con acetato de uranilo al 2% y luego deshidrate a través de una serie de etanol antes de incrustarlas en la resina LX112. Extirpe las ubicaciones cuadriculadas del bloque y recoja secciones ultrafinas con un tomo ultramicrométrico. Capture imágenes en un microscopio electrónico a 80 kV utilizando el software del sistema de imágenes adecuado.

5. Procesamiento y visualización de datos (Día 4)

NOTA: FIJI, un paquete de análisis de imágenes de código abierto, se utiliza para la visualización y el análisis33.

  1. Duplicar los datos brutos para su procesamiento a fin de cumplir con los principios de datos F.A.I.R., es decir, que los datos de investigación sean localizables, accesibles, interoperables y reutilizables.
  2. Ajuste el brillo y el contraste de los conjuntos de imágenes por igual utilizando los datos del histograma.
  3. Muestre las imágenes como proyecciones de intensidad máxima de las imágenes de pila Z adquiridas.
  4. Inserte la barra de escala para conjuntos de imágenes.
  5. Recortar/Rotar datos FOV (opcional). Cree paneles representativos para los datos de series temporales.
  6. Para su posterior análisis y cuantificación, cuantificar la intensidad de fluorescencia del dextrano absorbido por las células como medida de la actividad de la macropinocitosis. Para limitar el análisis a células individuales, utilice el método de imagen descrito aquí.
    1. Invierta la LUT para invertir el color de las áreas de celda desprovistas de fluorescencia para realizar el umbral.
    2. Segmente el objeto en primer plano y cree una máscara de celda para identificar celdas individuales.
    3. Utilice la máscara celular junto con un método19 publicado anteriormente que identifica y mide los macropinosomas individuales. Utilice estas métricas para cuantificar la macropinocitosis, incluido el tamaño, el número y la absorción total por célula.

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Resultados

El enfoque de obtener imágenes de células vivas no marcadas inmersas en una alta concentración de dextrano fluorescente tiene varias ventajas sobre las técnicas de imagen convencionales para el seguimiento de la macropinocitosis. Al presentar las imágenes en relieve, los cuerpos celulares aparecen como negros y permiten una mejor visualización de la dramática superficie celular que se agita contra un fondo brillante y fluorescente, seguido de la internalización en fase fluida de ...

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Discusión

Este artículo describe variaciones en formas más tradicionales de usar el marcaje con dextrano para rastrear la macropinocitosis, basándose en imágenes en vivo de células bañadas continuamente en dextrano fluorescente y visualizando la absorción en el fondo negro de células no marcadas. El protocolo optimizado proporciona los medios para distinguir entre diferentes vesículas intracelulares y permite un seguimiento espacio-temporal de múltiples cargas y proteínas macropinocíti...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Tatiana Khromykh por su experta asistencia técnica. Las imágenes de fluorescencia se realizaron en microscopía IMB incorporando el Centro de Ultraestructura y Función del Cáncer financiado por la Fundación Australiana de Investigación del Cáncer; La microscopía electrónica se realizó en el Centro de Microscopía y Microanálisis de la UQ. Se recibieron fondos del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud de Australia (JLS APP1176209) y del Consejo Australiano de Investigación (DP180101910). NDC cuenta con el apoyo de la subvención número 2020-225648 de la Chan Zuckerberg Initiative DAF, un fondo asesorado por la Fundación Comunitaria de Silicon Valley. YH contó con el apoyo de una beca de doctorado del gobierno australiano y fondos del Programa de Investigación de Alzheimer de Yulgilbar. Z-JX contó con el apoyo de una beca de la Academia China de Ciencias.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2% Osmium TetroxideProSciTechEMS19192
647-TransferrinMolecular Probes, Invitrogen  T23366
BV2 cellsGift kindly given to us by Dr Liviu Bodea (Queensland Brain Institute)-
CpG (Class B) BIntegrated DNA TechnologiesCustom Order
Dextran Alexa Fluor 488  at 10 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD22910
Dextran Alexa Fluor 647  at 10 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD22914
Dextran Oregon Green 488 at 70 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD1818
Dextran Tetramethylrhodamine at 70 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD7173
DMEM medium with sodium pyruvate and L-glutamineGibco Invitrogen#11995
Fetal Calf serumInterpath Services Pty LtdSFBS-F
Glutaraldehyde aqueous solution, EM Grade 25%ProSciTechC002
Jeol 1011 electron microscopeJEOL-
L-GlutamineGibco Invitrogen25030081
Lipofectamine 2000Gibco Invitrogen11668019
MatTek  Glass Bottom Dish 35 mm, uncoated gridMatTek CorporationP35G-2-14-CGRD
MatTek glass bottom dishes 35 mm uncoatedMatTek CorporationP35G-1.5-14C
MDA-MB 231 cellsATCCHTB-26
Opti-MEM reduced serum mediumThermo Fisher Scientific31985088
Plasmid mCherry-2XFYVEGift kindly given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)-
Plasmid mCherry-PLCδ-PHGift kindly given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)-
Raw264.7 cellsATCCTIB-71
RPMI medium 1640,without L-glutamineGibco Invitrogen#21870
Ultrapure LPSJomar Life Research Pte LtdTLR-3PELPS
Uranyl AcetateProSciTechC079
Zeiss inverted LSM880 confocal microscopeZeiss-

Referencias

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