Fluorescenza in tempo reale, imaging inverso dell'arruffamento cellulare e macropinocitosi

Riepilogo

Questo protocollo dimostra l'imaging del destrano in cellule vive utilizzando l'assorbimento continuo e immagini inverse per ottimizzare la visualizzazione dell'arricciamento, la maturazione dei macropinosomi e l'analisi del destrano e di altre marcature cellulari.

Abstract

La macropinocitosi è un processo altamente conservato, ma ancora non completamente compreso, essenziale per l'assorbimento e l'ingestione di fluidi, nutrienti in fase fluida e altro materiale nelle cellule. La drammatica estensione delle increspature della superficie cellulare, la loro chiusura per formare macropinosomi e la maturazione dei macropinosomi internalizzati sono eventi chiave in questo percorso che possono essere difficili da catturare utilizzando l'imaging confocale convenzionale basato sul tracciamento di un bolo di carico fluorescente. I destroni fluorescenti sono comunemente usati sperimentalmente come marcatori di fase fluida per i macropinosomi e per altre vie endocitiche. Un metodo che il laboratorio ha adottato per ottimizzare l'imaging dell'assorbimento del destrano prevede l'utilizzo di immagini dal vivo di cellule immerse in alte concentrazioni di destrano fluorescente nel mezzo, con le cellule non marcate che appaiono in rilievo (come nere). Le increspature cellulari sono evidenziate per visualizzare la chiusura delle increspature e i macropinosomi internalizzati appaiono come vacuoli fluorescenti all'interno della cellula. Questo metodo è ottimale per visualizzare le caratteristiche dei macropinosomi e consente una facile segmentazione e quantificazione. Questo articolo descrive la doppia marcatura di percorsi con destrani di diverse dimensioni e la co-espressione di sonde lipidiche e proteine fluorescenti di membrana per marcare macropinosomi e altri endosomi. È stata inoltre dimostrata la rilevazione del destrano internalizzato a livello ultrastrutturale mediante microscopia elettronica e ottica correlativa (CLEM). Questi processi cellulari possono essere riprodotti utilizzando diverse modalità di imaging dal vivo, anche in 3D. Nel loro insieme, questi approcci ottimizzano l'imaging dei macropinosomi per molti contesti e sistemi sperimentali diversi.

Introduzione

La maggior parte dei tipi di cellule vertebrate condivide la capacità innata di assorbire non selettivamente il fluido con i predecessori nel corso dell'evoluzione, risalenti all'ameba unicellulare¹. Questo processo altamente conservato di assorbimento della fase fluida da parte della macropinocitosi (big drinking) è utilizzato dall'ameba principalmente per l'acquisizione di nutrienti¹, mentre nelle cellule dei vertebrati può essere una via di rifornimento per ottenere nutrienti sotto stress, ed è utilizzato dalle cellule immunitarie per il campionamento e la sorveglianza degli ambienti tissutali². La macropinocitosi ha caratteristiche che la distinguono da altre forme di endocitosi, tra cui i caratteristici macropinosomi vacuolari di grandi dimensioni (>0,2 mm di diametro), la natura non selettiva dell'assorbimento di liquidi e soluti e le relative distese di membrana plasmatica che vengono opportunisticamente internalizzate nei macropinosomi³. La natura non selettiva di questo assorbimento significa che lo smistamento e il riciclaggio devono avvenire rapidamente per salvare le proteine solubili essenziali e le proteine della membrana plasmatica, riciclandole nuovamente sulla superficie cellulare. Gran parte del materiale assunto nei macropinosomi è destinato alla degradazione nei lisosomi e viene incanalato in percorsi endo/lisosomiali attraverso la maturazione dei macropinomi e la fusione con altri endosomi. Le proteine della membrana plasmatica possono anche essere riciclate sulla superficie cellulare dai macropinosomi. C'è un intenso interesse nel campo del cancro per la comprensione del processo di macropinocitosi, che viene attivato nelle cellule tumorali e aiuta a sostenere la loro nutrizione e proliferazione 2,4,5,6. La macropinocitosi si verifica sia costitutivamente che può essere ulteriormente indotta in seguito alla stimolazione mediata dal recettore nelle cellule immunitarie, dove i macropinosomi ospitano la segnalazione del recettore, contribuiscono all'elaborazione endo/lisosomiale per la presentazione dell'antigene e forniscono un portale di ingresso per una varietà di virus, batteri e altri patogeni ^3,7.

I macropinosomi hanno pochi marcatori distintivi o unici. Sono più facilmente identificabili durante la loro formazione alla base di drammatiche increspature della superficie cellulare ricche di actina, che si avvicinano per inghiottire il fluido⁸. Immediatamente dopo la chiusura, la F-actina attorno ai macropinosomi viene depolimerizzata e i macropinosomi stessi subiscono cambiamenti dinamici associati a fusione, tubulazione e restringimento omo ed eterotipici⁹. I macropinosomi sono anche difficili da identificare a livello ultrastrutturale poiché non hanno rivestimenti caratteristici o altre caratteristiche e appaiono semplicemente come vacuoli di varie dimensioni. Senza marcatori di membrana definitivi, i macropinosomi sono più facilmente e tradizionalmente definiti dal loro carico fluido, che sperimentalmente avviene attraverso l'uso di destrano fluorescente. Il destrano è un polisaccaride complesso derivato dal glucosio che può essere accoppiato a una vasta gamma di marcatori fluorescenti o densi di elettroni e aggiunto al terreno per l'assorbimento da parte delle cellule o perfuso per l'assorbimento nei tessuti. Inoltre, il destrano a grande peso molecolare (MW) (70 kDa) è ora considerato un carico selettivo per le dimensioni dei macropinosomi poiché non entra in altre vescicole endocitiche più piccole ed è diventato l'etichetta più comune per la macropinocitosi ^10,11. La visualizzazione della macropinocitosi comporta tipicamente l'incubazione delle cellule con un impulso di destrano fluorescente e l'utilizzo di cellule fisse o vive per l'imaging a fluorescenza per visualizzare il bolo di marcatura del destrano all'interno delle cellule nei macropinosomi. A causa delle loro grandi dimensioni, i macropinosomi non marcati possono anche essere visualizzati in alcuni tipi di cellule utilizzando il contrasto di fase o la microscopia a campo chiaro, in cui i macropinosomi appaiono come grandi vacuoli bianchi vuoti. Alcune informazioni contestuali si ottengono dalle immagini a contrasto di fase delle cellule, e queste immagini possono poi essere ulteriormente sovrapposte con immagini a fluorescenza per rappresentare l'assorbimento di destrano fluorescente^12,13. Dextrans di diverse dimensioni e con etichette distinte può essere utilizzato per monitorare l'assorbimento di liquidi in più vie cellulari ed endocitiche^10,14,15 e il destrano possono essere applicati a colture cellulari o perfusi nei topi per l'imaging intravitale¹⁶ o anche iniettati in embrioni di mosca¹⁷ per l'imaging dal vivo.

Alcune delle difficoltà incontrate nell'uso del destrano per tracciare i macropinosomi includono la sua fuoriuscita dai macropinosomi dopo la fissazione o la permeabilizzazione delle cellule, i suoi livelli diluiti o difficili da rilevare nelle cellule che non eseguono macropinocitosi aggressiva e il suo dispiegamento dinamico e la dispersione all'interno delle cellule durante la maturazione dei macropinosomi³. Questi problemi sono aggravati nella maggior parte degli esperimenti che sono progettati per tracciare l'assorbimento di un singolo impulso di destrano aggiunto alle cellule e poi lavato via.

Invece, questo articolo descrive i vantaggi dell'applicazione del destrano fluorescente alle cellule e di lasciarlo nel mezzo durante l'imaging dal vivo per registrare l'assorbimento continuo nelle cellule. Questo amplifica il segnale del destrano nei macropinosomi e negli endosomi successivi, mostrando l'intero percorso di maturazione. La visualizzazione dei macropinosomi marcati contro l'interno non marcato (nero) delle cellule, come un'impostazione inversa ad alto contrasto, rivela tutte le caratteristiche dei macropinosomi e, al contrario, al di fuori delle cellule, il mezzo altamente fluorescente evidenzia l'increspatura dinamica della superficie cellulare. Questo metodo descrive l'imaging dal vivo del destrano per l'imaging confocale al microscopio ottico e per la sua rilevazione dopo la fissazione cellulare mediante microscopia ottica ed elettronica correlativa (CLEM). L'imaging qui incluso è stato eseguito su diversi tipi di cellule per dimostrare l'ampia applicabilità di questi approcci, compresi i macrofagi attivati e le cellule microgliali, dove la macropinocitosi è molto attiva e rapida, e nelle cellule tumorali dove la macropinocitosi è relativamente meno abbondante.

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Protocollo

1. Preparazione delle celle su piastre con fondo di vetro da 35 mm (Giorno 0)

1. Mantenere e far passare le linee cellulari in terreno completo integrato con siero di vitello fetale inattivato al 10% (per RAW264.7) o normale e L-glutammina all'1%, a 37 °C in incubatore umidificato al 5% di CO₂ .
2. Piastra il numero appropriato di celle per ottenere una confluenza del 60% in 24 ore, su piastre con fondo di vetro da 35 mm.
   NOTA: La densità cellulare raccomandata è compresa tra 2 mL di 0,15 x 10⁶ cellule/mL e 0,25 x 10⁶ cellule/mL per le cellule microgliali RAW264.7, BV2 e MDA-MB 231 qui descritte.

2. Trasfezione del plasmide del DNA a fluorescenza (Giorno 1) - Opzionale

NOTA: Diverse proteine e sonde marcate con fluorescenza possono essere espresse transitoriamente o stabilmente in linee cellulari clonate per marcare in modo specifico le increspature e i compartimenti di actina nella via endocitica, come gli endosomi precoci, gli endosomi tardivi o i lisosomi.

1. Trasfettare le cellule utilizzando un kit di trasfezione a base di lipidi secondo le istruzioni del produttore, 1 giorno dopo la placcatura in una cappa di coltura tissutale.
2. Diluire 2 μg di plasmide di DNA purificato privo di endotossine in 125 μL di terreno essenziale minimo (siero ridotto). Mescolate delicatamente e lasciate riposare per 5 minuti a temperatura ambiente.
3. Diluire 5 μL di agente di trasfezione in 125 μL di terreno minimo essenziale (siero ridotto). Mescolate delicatamente e lasciate riposare per 5 minuti a temperatura ambiente.
4. Combinare il plasmide di DNA diluito e il reagente di trasfezione diluito e incubare per altri 10 minuti prima di aggiungere goccia a goccia alle cellule.
5. Incubare le cellule con il complesso di trasfezione a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 per 3-4 ore, prima di sostituirle con un terreno di coltura completo fresco.
6. Utilizzare le cellule trasfettate il giorno successivo per esperimenti o sottoposte a clonazione a diluizione limitata per ottenere linee cellulari che esprimono stabilmente.

3. Visualizzazione delle vescicole endocitiche e dei macropinosomi (Giorno 2)

NOTA: I destroni fluorescenti (destrano Alexa Fluor 488/647 a 10 kDa MW e destrano Oregon Green 488/tetrametilrodamina a 70 kDa MW, anionico, lisina fissabile) di diversi pesi molecolari sono utilizzati per monitorare l'assorbimento della fase fluida in una serie di vie endocitiche¹⁴. 70 kDa destrano per i macropinosomi e 10 kDa per tutte le vie.

1. Preparare i destrini come sospensione concentrata 2x a 200-500 ng/mL in terreno di coltura preriscaldato per l'aggiunta alle cellule.
2. FACOLTATIVO: Gli esperimenti possono richiedere l'aggiunta preventiva o simultanea di integratori o farmaci per influenzare l'attività endocitica. Ad esempio, pretrattare i macrofagi e le cellule microgliali con fattori di crescita (ad esempio, 200 ng/mL CSF-1) o ligandi attivanti (ad esempio, LPS 100 ng/mL o 300 ng/mL CpG) per migliorare l'arruffamento e la macropinocitosi. Coltivare le cellule tumorali in un terreno appropriato privo di siero per 12-16 ore prima dell'assorbimento del destrano nel terreno completo. Fare riferimento al passaggio 1.2 per la densità delle celle consigliata.
3. Per prepararsi all'imaging dal vivo, posizionare le cellule coltivate in piastre con fondo di vetro sul tavolino di un microscopio confocale invertito dotato di termoforo a 37 °C e di un incubatore umidificato al 5% di CO₂ 2.
4. Aspirare il terreno in eccesso lasciando 500 μl del mezzo completo nella capsula con fondo in vetro.
5. Trova una regione di celle adatta e imposta la messa a fuoco. Per l'imaging time-lapse, preselezionare i laser a fluorescenza, i filtri e le impostazioni appropriati prima dell'acquisizione. Utilizzare le seguenti impostazioni per risolvere singole cellule e macropinosomi.
   1. Immagini della regione di interesse su un microscopio confocale invertito con un obiettivo Plan Apochromat a immersione in olio 63x 1,4 NA.
   2. Selezionare 512 x 512 per le dimensioni dell'immagine, scansione bidirezionale per immagini veloci.
   3. Concentrati su un piano focale individuale delle cellule. Impostare l'acquisizione come una singola fetta o impostare uno spessore della fetta ottica (Nyquist) di circa 0,3 μm da combinare come Z-stack.
   4. Seleziona il time-lapse con intervallo di 5 s, per una durata compresa tra 20 e 45 minuti a seconda dei tipi di cella specifici.
   5. Selezionare la messa a fuoco automatica/il tracking della messa a fuoco hardware per facilitare la stabilizzazione dell'immagine durante l'acquisizione per una durata appropriata in base ai tipi di celle specifici.
   6. Aggiungere un volume uguale di 2x mezzo addizionato con destrano e avviare immediatamente l'acquisizione di immagini dal vivo per i macrofagi. Attendere 20 minuti prima di visualizzare l'assorbimento più lento nelle cellule MDA-MB 231.
      NOTA: Con questo metodo, le cellule BV2 con due canali fluorofori sono state visualizzate con successo su un singolo piano con tracciamento della velocità massima, continuamente per 45 minuti dopo l'aggiunta della miscela di destrano. Per rilevare i macropinosomi precoci nelle cellule RAW 264.7, dove la macropinocitosi si verifica molto rapidamente, acquisire una singola fetta (per l'imaging veloce) o una pila Z di 4-6 fette (per l'acquisizione 3D) e time-lapse con intervallo di 5 s per 20 minuti dopo l'aggiunta di destrano. Per le celle MDA-MB 231, acquisire stack Z ottimali tra 10-15 sezioni, con intervalli di 5 s per 40 minuti.

4. Microscopia ottica ed elettronica correlativa (CLEM) (Giorno 3) - Opzionale

1. Preparare le cellule secondo i passaggi 1, 2 e 3 del protocollo con adattamenti. In breve, coltivare 0,2 x 10⁶ cellule/mL di cellule RAW264.7 su piastre con fondo di vetro grigliato (piatto da 35 mm, vetrino coprioggetto grigliato n. 1,5, diametro del vetro 14 mm, non rivestito), trasfettare con un plasmide fluorescente (ad esempio, mCherry-2xFYVE) e lasciare riposare per una notte prima dell'aggiunta di destrano-488 (70 kDa) per 20 minuti a 37 °C, incubatore umidificato al 5% di CO₂ .
2. Lavare rapidamente le cellule con 1 mL di PBS ghiacciato e fissare con glutaraldeide allo 0,1%.
3. Acquisisci le immagini delle cellule fisse del destronano-488 e di mCherry-2xFYVE su un microscopio confocale.
4. Acquisire immagini in campo chiaro per identificare le posizioni della griglia prima che le parabole vengano elaborate per la microscopia elettronica a trasmissione (EM) come descritto in precedenza¹⁸. In breve, fissare ulteriormente le cellule in glutaraldeide al 2,5%, postfissare in tetrossido di osmio ridotto all'1%, colorare in blocco con acetato di uranile al 2% e quindi disidratare attraverso una serie di etanolo prima di incorporarle nella resina LX112. Estrarre le posizioni grigliate dal blocco e raccogliere le sezioni ultrasottili utilizzando un ultra-microtomo. Acquisizione di immagini su un microscopio elettronico a 80 kV utilizzando il software del sistema di imaging appropriato.

5. Elaborazione e visualizzazione dei dati (Giorno 4)

NOTA: FIJI, un pacchetto di analisi delle immagini open source, viene utilizzato per la visualizzazione e l'analisi³³.

1. Duplicare i dati grezzi per l'elaborazione per conformarsi ai principi dei dati F.A.I.R., ovvero che i dati della ricerca siano reperibili, accessibili, interoperabili e riutilizzabili.
2. Regolare la luminosità e il contrasto per i set di immagini in modo uniforme utilizzando i dati dell'istogramma.
3. Visualizza le immagini come proiezioni di massima intensità dalle immagini Z-stack acquisite.
4. Inserisci la barra di scala per i set di immagini.
5. Ritaglia/Ruota i dati FOV (opzionale). Creare pannelli rappresentativi per i dati delle serie temporali.
6. Per ulteriori analisi e quantificazione, quantificare l'intensità di fluorescenza del destrano assorbito nelle cellule come misura dell'attività della macropinocitosi. Per limitare l'analisi alle singole cellule, utilizzare il metodo di imaging qui descritto.
   1. Invertire la LUT per invertire il colore per le aree cellulari prive di fluorescenza per eseguire la soglia.
   2. Segmenta l'oggetto in primo piano e crea una maschera di cella per identificare le singole celle.
   3. Utilizzare la maschera cellulare in combinazione con un metodo¹⁹ precedentemente pubblicato che identifica e misura i singoli macropinosomi. Utilizza queste metriche per quantificare la macropinocitosi, comprese le dimensioni, il numero e l'assorbimento totale per cellula.

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Risultati

L'approccio di imaging di cellule vive non marcate immerse in un'alta concentrazione di destrano fluorescente presenta diversi vantaggi rispetto alle tecniche di imaging convenzionali per il monitoraggio della macropinocitosi. Presentando le immagini in rilievo, i corpi cellulari appaiono neri e consentono una migliore visualizzazione della drammatica superficie cellulare che si increspa su uno sfondo luminoso e fluorescente, seguita dall'internalizzazione in fase fluida dei macropinosom...

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Discussione

Questo articolo descrive le variazioni sui modi più tradizionali di utilizzare l'etichettatura del destrano per monitorare la macropinocitosi, sulla base dell'imaging dal vivo di cellule immerse continuamente in destrano fluorescente e visualizzando l'assorbimento sullo sfondo nero di cellule non marcate. Il protocollo ottimizzato fornisce i mezzi per distinguere tra diverse vescicole intracellulari e consente un tracciamento spazio-temporale di molteplici carichi e proteine macropinoci...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% Osmium Tetroxide	ProSciTech	EMS19192
647-Transferrin	Molecular Probes, Invitrogen	T23366
BV2 cells	Gift kindly given to us by Dr Liviu Bodea (Queensland Brain Institute)	-
CpG (Class B) B	Integrated DNA Technologies	Custom Order
Dextran Alexa Fluor 488  at 10 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D22910
Dextran Alexa Fluor 647  at 10 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D22914
Dextran Oregon Green 488 at 70 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D1818
Dextran Tetramethylrhodamine at 70 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D7173
DMEM medium with sodium pyruvate and L-glutamine	Gibco Invitrogen	#11995
Fetal Calf serum	Interpath Services Pty Ltd	SFBS-F
Glutaraldehyde aqueous solution, EM Grade 25%	ProSciTech	C002
Jeol 1011 electron microscope	JEOL	-
L-Glutamine	Gibco Invitrogen	25030081
Lipofectamine 2000	Gibco Invitrogen	11668019
MatTek  Glass Bottom Dish 35 mm, uncoated grid	MatTek Corporation	P35G-2-14-CGRD
MatTek glass bottom dishes 35 mm uncoated	MatTek Corporation	P35G-1.5-14C
MDA-MB 231 cells	ATCC	HTB-26
Opti-MEM reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific	31985088
Plasmid mCherry-2XFYVE	Gift kindly given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)	-
Plasmid mCherry-PLCδ-PH	Gift kindly given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)	-
Raw264.7 cells	ATCC	TIB-71
RPMI medium 1640,without L-glutamine	Gibco Invitrogen	#21870
Ultrapure LPS	Jomar Life Research Pte Ltd	TLR-3PELPS
Uranyl Acetate	ProSciTech	C079
Zeiss inverted LSM880 confocal microscope	Zeiss	-