JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, fırfırlama, makropinozom olgunlaşması ve dekstran ve diğer hücre etiketlemelerinin analizinin görselleştirilmesini optimize etmek için sürekli alım ve ters görüntüler kullanarak canlı hücrelerde dekstran görüntülemeyi gösterir.

Özet

Makropinositoz, hücrelerdeki sıvı, sıvı fazındaki besinler ve diğer materyallerin alımı ve yutulması için gerekli olan, yüksek oranda korunmuş ancak hala tam olarak anlaşılmamış bir süreçtir. Hücre yüzeyi fırfırlarının dramatik bir şekilde uzaması, makropinozomlar oluşturmak için kapanmaları ve içselleştirilmiş makropinozomların olgunlaşması, bu yolda, bir floresan kargo bolusunun izlenmesine dayalı geleneksel konfokal görüntüleme kullanılarak yakalanması zor olabilen kilit olaylardır. Floresan dekstrans, makropinozomlar ve diğer endositik yollar için sıvı faz belirteçleri olarak deneysel olarak yaygın olarak kullanılır. Laboratuvarın dekstran alımının görüntülenmesini optimize etmek için benimsediği bir yöntem, ortamda yüksek konsantrasyonlarda floresan dekstran ile yıkanmış hücrelerin canlı görüntülemesini içerir ve etiketlenmemiş hücreler kabartma (siyah olarak) görünür. Hücre fırfırları, fırfır kapanmasını görselleştirmek için vurgulanır ve içselleştirilmiş makropinozomlar, hücre içinde floresan vakuoller olarak görünür. Bu yöntem, makropinozom özelliklerini görselleştirmek için idealdir ve kolay segmentasyon ve niceleme sağlar. Bu makale, makropinozomları ve diğer endozomları işaretlemek için farklı boyutlarda dekstrans ile yolların ikili etiketlenmesini ve lipid problarının ve floresan membran proteinlerinin birlikte ekspresyonunu açıklamaktadır. Bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu (CLEM) kullanılarak ultrastrüktürel düzeyde içselleştirilmiş dekstranın tespiti de gösterilmiştir. Bu hücre süreçleri, 3D de dahil olmak üzere birden fazla canlı görüntüleme yöntemi kullanılarak görüntülenebilir. Birlikte ele alındığında, bu yaklaşımlar birçok farklı ortam ve deneysel sistem için makropinozom görüntülemeyi optimize eder.

Giriş

Çoğu omurgalı hücre tipi, tek hücreli amip1'e kadar uzanan, evrim boyunca öncüllerle seçici olmayan sıvı alımı için doğuştan gelen kapasiteyi paylaşır. Makropinositoz (büyük içme) ile bu yüksek oranda korunmuş sıvı fazı alım süreci, amip tarafından öncelikle besin alımıiçin kullanılır 1, omurgalı hücrelerinde ise benzer şekilde stres altında besin elde etmek için bir tedarik yolu olabilir ve doku ortamlarının örneklenmesi ve gözetimi için bağışıklık hücreleri tarafından kullanılır2. Makropinositoz, ayırt edici, büyük (>0.2 mm çapında) vakuolar benzeri makropinozomlar, sıvı ve çözünen alımının seçici olmayan doğası ve fırsatçı bir şekilde makropinozomlaraiçselleştirilmiş plazma zarının eşlik eden genişlikleri dahil olmak üzere onu diğer endositoz formlarından ayıran özelliklere sahiptir 3. Bu alımın seçici olmayan doğası, temel çözünür ve plazma zarı proteinlerini hücre yüzeyine geri dönüştürerek kurtarmak için sıralama ve geri dönüşümün hızlı bir şekilde gerçekleşmesi gerektiği anlamına gelir. Makropinozomlara alınan materyalin çoğu lizozomlarda bozunmaya yöneliktir ve makropinozom olgunlaşması ve diğer endozomlarla füzyon yoluyla endo / lizozomal yollara yönlendirilir. Plazma zarı proteinleri ayrıca makropinozomlardan hücre yüzeyine geri dönüştürülebilir. Kanser hücrelerinde aktive olan ve beslenmelerinin ve çoğalmalarının sürdürülmesine yardımcı olan makropinositoz sürecini anlamak için kanser alanına yoğun bir ilgi vardır 2,4,5,6. Makropinositoz hem yapısal olarak gerçekleşir hem de makropinozomların reseptör sinyalini barındırdığı, antijen sunumu için endo/lizozomal işlemeye katkıda bulunduğu ve çeşitli virüsler, bakteriler ve diğer patojenler için bir giriş portalı sağladığı bağışıklık hücrelerinde reseptör aracılı stimülasyon üzerine daha da indüklenebilir 3,7.

Makropinozomların az sayıda ayırt edici veya benzersiz belirteci vardır. Oluşumları sırasında en kolay şekilde, sıvı8'i yutmaya yakın olan dramatik, aktin açısından zengin hücre yüzeyi fırfırlarının tabanında tanımlanırlar. Kapatıldıktan hemen sonra, makropinozomların etrafındaki F-aktin depolimerize edilir ve makropinozomların kendileri homo- ve heterotipik füzyon, tübülasyon ve büzülme9 ile ilişkili dinamik değişikliklere uğrar. Makropinozomların ultrastrüktürel düzeyde tanımlanması da zordur, çünkü karakteristik kaplamaları veya diğer özellikleri yoktur ve sadece farklı boyutlarda vakuoller olarak görünürler. Kesin membran belirteçleri olmadan, makropinozomlar en kolay ve geleneksel olarak, deneysel olarak floresan dekstran kullanımı yoluyla olan sıvı kargoları ile tanımlanır. Dekstran, çok çeşitli floresan veya elektron yoğun belirteçlere bağlanabilen ve hücreler tarafından alınmak üzere ortama eklenebilen veya dokularda alım için perfüze edilebilen, glikoz türevli kompleks bir polisakkarittir. Ayrıca, büyük moleküler ağırlıklı (MW) dekstran (70 kDa), diğer, daha küçük endositik veziküllere girmediği için artık makropinozomlar için boyut seçici bir kargo olarak kabul edilmektedir ve makropinositoz için en yaygın etiket haline gelmiştir10,11. Makropinositozun görüntülenmesi tipik olarak hücrelerin bir floresan dekstran darbesi ile inkübe edilmesini ve makropinozomlardaki hücrelerin içindeki dekstran etiketleme bolusunu görüntülemek için floresan görüntüleme için sabit veya canlı hücrelerin kullanılmasını içerir. Büyük boyutları nedeniyle, etiketlenmemiş makropinozomlar, makropinozomların büyük beyaz boş vakuoller olarak göründüğü faz kontrastı veya parlak alan mikroskobu kullanılarak bazı hücre tiplerinde de görüntülenebilir. Hücrelerin faz kontrast görüntülerinden bazı bağlamsal bilgiler elde edilir ve bu görüntüler daha sonra floresan dekstran alımını12,13 göstermek için ek olarak floresan görüntülerle kaplanabilir. Farklı boyutlarda ve farklı etiketlere sahip dekstranslar, çoklu hücresel ve endositik yollara10,14,15 sıvı alımını izlemek için kullanılabilir ve dekstran hücre kültürlerine uygulanabilir veya intra-vital görüntüleme için farelere perfüze edilebilir16 veya hatta canlı görüntüleme için sinek embriyolarına17 enjekte edilebilir.

Makropinozomları izlemek için dekstran kullanımında ortaya çıkan zorluklardan bazıları, hücrelerin fiksasyonu veya geçirgenliğinden sonra makropinozomlardan sızması, agresif makropinositoz yapmayan hücrelerde seyreltik veya tespit edilmesi zor seviyeler ve makropinozom olgunlaşması sırasında hücreler içinde dinamik dağılımı ve dağılmasıdır3. Bu sorunlar, hücrelere eklenen ve daha sonra yıkanan tek bir dekstran darbesinin alımını izlemek için tasarlanmış çoğu deneyde birleşir.

Bunun yerine, bu makale, hücrelere floresan dekstran uygulamanın ve hücrelere sürekli alımı kaydetmek için canlı görüntüleme sırasında ortamda bırakmanın avantajlarını açıklamaktadır. Bu, makropinozomlardaki ve sonraki endozomlardaki dekstran sinyalini yükseltir ve tüm olgunlaşma yolunu gösterir. Etiketli makropinozomları hücrelerin etiketsiz (siyah) iç kısmına karşı görüntülemek, yüksek kontrastlı bir ters ayar olarak, makropinozomların tüm özelliklerini ortaya çıkarır ve tersine, hücrelerin dışında, yüksek floresan ortam, hücre yüzeyinin dinamik fırfırlamasını vurgular. Bu yöntem, ışık mikroskobik, konfokal görüntüleme ve korelasyon ışığı ve elektron mikroskobu (CLEM) ile hücre fiksasyonundan sonra tespiti için dekstranın canlı görüntülemesini tanımlar. Burada yer alan görüntüleme, makropinositozun çok aktif ve hızlı olduğu aktive makrofajlar ve mikroglial hücreler ve makropinositozun nispeten daha az bol olduğu kanser hücreleri dahil olmak üzere bu yaklaşımların geniş uygulanabilirliğini göstermek için farklı hücre tipleri üzerinde gerçekleştirildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. 35 mm'lik cam tabanlı tabaklarda hücrelerin hazırlanması (Gün 0)

  1. Nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de% 10 ısıyla inaktive edilmiş (RAW264.7 için) veya normal fetal buzağı serumuve% 1 L-glutamin ile desteklenmiş tam ortamda hücre hatlarını koruyun ve geçirin.
  2. 35 mm'lik cam tabanlı tabaklarda 24 saat içinde %60 birleşme elde etmek için uygun sayıda hücreyi plakalayın.
    NOT: Önerilen hücre yoğunluğu, burada açıklanan RAW264.7, BV2 mikroglial hücreler ve MDA-MB 231 meme kanseri hücreleri için 2 mL 0.15 x 106 hücre / mL ila 0.25 x 106 hücre / mL arasındadır.

2. Floresan DNA plazmit transfeksiyonu (1. Gün) - İsteğe bağlı

NOT: Farklı floresan etiketli proteinler ve problar, erken endozomlar, geç endozomlar veya lizozomlar gibi endositik yoldaki aktin fırfırlarını ve bölmelerini spesifik olarak etiketlemek için klonlanmış hücre hatlarında geçici veya kararlı bir şekilde eksprese edilebilir.

  1. Üreticinin talimatına göre, bir doku kültürü başlığında kaplamadan 1 gün sonra, lipid bazlı bir transfeksiyon kiti kullanarak hücreleri transfekte edin.
  2. 2 μg endotoksin içermeyen saflaştırılmış DNA plazmidini 125 μL minimum esansiyel ortamda (azaltılmış serum) seyreltin. Yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.
  3. 5 μL transfeksiyon ajanını 125 μL minimum esansiyel ortamda (azaltılmış serum) seyreltin. Yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.
  4. Seyreltilmiş DNA plazmidini ve seyreltilmiş transfeksiyon reaktifini birleştirin ve hücrelere damla damla eklemeden önce 10 dakika daha inkübe edin.
  5. Hücreleri, taze tam kültür ortamı ile değiştirmeden önce, nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de 3-4 saat boyunca transfeksiyon kompleksi ile inkübe edin.
  6. Transfekte edilmiş hücreleri ertesi gün deneyler için kullanın veya kararlı bir şekilde ifade eden hücre hatları elde etmek için sınırlı seyreltme klonlamasına tabi tutun.

3. Endositik veziküllerin ve makropinozomların görselleştirilmesi (2. Gün)

NOT: Farklı moleküler ağırlıklara sahip floresan dekstran (10 kDa MW'de Dextran Alexa Fluor 488/647 ve 70 kDa MW'de Dextran Oregon Green 488/Tetrametilrodamin, Anyonik, Lizin ile sabitlenebilir) bir dizi endositik yola14 sıvı fazı alımını izlemek için kullanılır. Makropinozomlar için 70 kDa dekstran ve tüm yollar için 10 kDa.

  1. Hücrelere eklenmek üzere önceden ısıtılmış kültür ortamında 200-500 ng / mL'de 2x konsantre süspansiyon olarak dekstran (lar) hazırlayın.
  2. İSTEĞE BAĞLI: Deneyler, endositik aktiviteyi etkilemek için takviyelerin veya ilaçların önceden veya aynı anda eklenmesini gerektirebilir. Örneğin, makrofajları ve mikroglial hücreleri büyüme faktörleri (örneğin, 200 ng / mL CSF-1) veya aktive edici ligandlar (örneğin, LPS 100 ng / mL veya 300 ng / mL CpG) ile ön işlemden geçirin. Kanser hücrelerini, tam ortamda dekstran alımından önce 12-16 saat boyunca uygun serum içermeyen bir ortamda kültürleyin. Önerilen hücre yoğunluğu için adım 1.2'ye bakın.
  3. Canlı görüntülemeye hazırlanmak için, cam tabanlı tabaklarda büyütülen hücreleri, 37 ° C ısıtma yastığı ve% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör ile donatılmış ters konfokal bir mikroskop sahnesine yerleştirin.
  4. Cam alt tabakta 500 μL tam ortam bırakarak fazla ortamı aspire edin.
  5. Uygun bir hücre bölgesi bulun ve odağı ayarlayın. Hızlandırılmış görüntüleme için, çekimden önce uygun floresan lazerleri, filtreleri ve ayarları önceden seçin. Tek tek hücreleri ve makropinozomları çözümlemek için aşağıdaki ayarları kullanın.
    1. 63x 1.4 NA yağa daldırma Plan Apochromat objektifi ile ters çevrilmiş bir konfokal mikroskopta ilgilenilen bölgeyi görüntüleyin.
    2. Görüntü boyutu için 512 x 512'yi, hızlı görüntüleme için çift yönlü taramayı seçin.
    3. Hücrelerin bireysel odak düzlemine odaklanın. Tek bir dilim olarak yakalamak için ayarlayın veya Z yığınları olarak birleştirmek için yaklaşık 0,3 μm'lik bir optik dilim kalınlığı (Nyquist) ayarlayın.
    4. Belirli hücre tiplerine bağlı olarak 20-45 dakika arasında bir süre için 5 sn aralıklarla hızlandırılmış çekimi seçin.
    5. Belirli hücre tiplerine göre uygun bir süre boyunca çekim sırasında görüntü sabitlemeye yardımcı olmak için donanım otomatik odaklama/odak izlemeyi seçin.
    6. Eşit hacimde 2x dekstran çivili ortam ekleyin ve makrofajlar için hemen canlı görüntü yakalamaya başlayın. MDA-MB 231 hücrelerinde daha yavaş alımı görüntülemeden önce 20 dakika bekleyin.
      NOT: Bu yöntemle, iki florofor kanalına sahip BV2 hücreleri, dekstran karışımının eklenmesinden sonra 45 dakika boyunca sürekli olarak maksimum hız izlemesi ile tek bir düzlemde başarılı bir şekilde görüntülendi. Makropinositozun çok hızlı gerçekleştiği RAW 264.7 hücrelerinde erken makropinozomları tespit etmek için, tek bir dilim (hızlı görüntüleme için) veya 4-6 dilimli Z yığını (3D yakalama için) elde edin ve dekstran eklendikten sonra 20 dakika boyunca 5 saniye aralıklarla hızlandırılmış çekim yapın. MDA-MB 231 hücreleri için, 40 dakika boyunca 5 saniye aralıklarla 10-15 dilim arasında optimum Z yığınları elde edin.

4. Bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu (CLEM) (Gün 3) - İsteğe bağlı

  1. Hücreleri protokolün 1, 2 ve 3. adımlarına göre uyarlamalarla hazırlayın. Kısaca, ızgaralı cam tabanlı tabaklarda (35 mm Çanak, No. 1.5 Izgaralı lamel, 14 mm cam çapı, kaplamasız) 0.2 x 106 hücre / mL RAW264.7 hücre büyütün, floresan bir plazmit ile transfekte edin (örneğin, mCherry-2xFYVE) ve dekstran-488 (70 kDa) ilavesinden önce 37 °C'de 20 dakika, %5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör.
  2. Hücreleri 1 mL buz gibi soğuk PBS ile hızlı bir şekilde yıkayın ve% 0.1 gluteraldehit ile sabitleyin.
  3. Konfokal bir mikroskopta dextran-488 ve mCherry-2xFYVE'nin sabit hücre görüntülerini elde edin.
  4. Daha önce açıklandığı gibi bulaşıklar transmisyon elektron mikroskobu (EM) için işlenmeden önce ızgara konumlarını belirlemek için parlak alan görüntüleri yakalayın18. Kısaca, ayrıca, hücreleri %2.5 glutaraldehitte sabitleyin, %1 indirgenmiş osmiyum tetroksitte postfix, %2 uranil asetat ile blok lekeleyin ve ardından LX112 reçinesine gömmeden önce bir dizi etanol ile dehidre edin. Izgaralı konumları bloktan çıkarın ve ultra mikrotom kullanarak ultra ince kesitleri toplayın. Uygun görüntüleme sistemi yazılımını kullanarak 80 kV'da bir elektron mikroskobunda görüntü yakalayın.

5. Veri işleme ve görselleştirme (4. Gün)

NOT: Açık kaynaklı bir görüntü analiz paketi olan FIJI, görselleştirme ve analiz için kullanılır33.

  1. F.A.I.R. veri ilkelerine, yani araştırma verilerinin Bulunabilir, Erişilebilir, Birlikte Çalışabilir ve Yeniden Kullanılabilir olmasına uymak için işlenmek üzere ham verileri çoğaltın.
  2. Histogram verilerini kullanarak görüntü kümeleri için parlaklığı ve kontrastı eşit olarak ayarlayın.
  3. Görüntüleri, elde edilen Z yığını görüntülerinden maksimum yoğunluk projeksiyonları olarak görüntüleyin.
  4. Görüntü kümeleri için ölçek çubuğu ekleyin.
  5. FOV verilerini kırp/döndür (isteğe bağlı). Zaman serisi verileri için temsili paneller oluşturun.
  6. Daha fazla analiz ve niceleme için, makropinositoz aktivitesinin bir ölçüsü olarak hücrelere alınan dekstranın floresan yoğunluğunu ölçün. Analizi tek tek hücrelerle sınırlamak için burada açıklanan görüntüleme yöntemini kullanın.
    1. Eşikleme gerçekleştirmek için floresan içermeyen hücre alanlarının rengini çevirmek için LUT'u ters çevirin.
    2. Ön plan nesnesini bölümlere ayırın ve tek tek hücreleri tanımlamak için bir hücre maskesi oluşturun.
    3. Hücre maskesini, daha önce yayınlanmış ve tek tek makropinozomları tanımlayan ve ölçen bir yöntem19 ile birlikte kullanın. Hücre başına boyut, sayı ve toplam alım dahil olmak üzere makropinositozu ölçmek için bu ölçümleri kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Yüksek konsantrasyonda floresan dekstrana batırılmış etiketlenmemiş canlı hücrelerin görüntülenmesi yaklaşımı, makropinositozu izlemek için geleneksel görüntüleme tekniklerine göre çeşitli avantajlara sahiptir. Görüntüleri kabartma olarak sunarak, hücre gövdeleri siyah olarak görünür ve parlak, floresan bir arka plana karşı dramatik hücre yüzeyinin daha iyi görselleştirilmesine izin verir, ardından Şekil 1A'da gösterildi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu makale, floresan dekstran(lar)da sürekli olarak yıkanan hücrelerin canlı görüntülenmesine ve etiketlenmemiş hücrelerin siyah arka planındaki alımın görselleştirilmesine dayalı olarak, makropinositozu izlemek için dekstran etiketlemeyi kullanmanın daha geleneksel yollarındaki varyasyonları açıklamaktadır. Optimize edilmiş protokol, farklı hücre içi veziküller arasında ayrım yapmak için araçlar sağlar ve çoklu makropinositotik ve endositik kargoların ve...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Yazarlar, uzman teknik yardımı için Tatiana Khromykh'e teşekkür eder. Floresan görüntüleme, Avustralya Kanser Araştırma Vakfı tarafından finanse edilen Kanser Ultrastructure and Function Facility'yi içeren IMB Mikroskobu'nda gerçekleştirildi; elektron mikroskobu, UQ'nun Mikroskopi ve Mikroanaliz Merkezi'nde gerçekleştirildi. Finansman, Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (JLS APP1176209) ve Avustralya Araştırma Konseyi'nden (DP180101910) alındı. NDC, Silikon Vadisi Topluluk Vakfı'nın tavsiye edilen bir fonu olan Chan Zuckerberg Initiative DAF'tan 2020-225648 numaralı hibe numarası ile CZI Görüntüleme Bilimcisi olarak desteklenmektedir. YH, Avustralya hükümetinden bir doktora bursu ve Yulgilbar Alzheimer Araştırma Programı'ndan fon ile desteklendi. Z-JX, Çin Bilim Akademisi bursu tarafından desteklendi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2% Osmium TetroxideProSciTechEMS19192
647-TransferrinMolecular Probes, Invitrogen  T23366
BV2 cellsGift kindly given to us by Dr Liviu Bodea (Queensland Brain Institute)-
CpG (Class B) BIntegrated DNA TechnologiesCustom Order
Dextran Alexa Fluor 488  at 10 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD22910
Dextran Alexa Fluor 647  at 10 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD22914
Dextran Oregon Green 488 at 70 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD1818
Dextran Tetramethylrhodamine at 70 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD7173
DMEM medium with sodium pyruvate and L-glutamineGibco Invitrogen#11995
Fetal Calf serumInterpath Services Pty LtdSFBS-F
Glutaraldehyde aqueous solution, EM Grade 25%ProSciTechC002
Jeol 1011 electron microscopeJEOL-
L-GlutamineGibco Invitrogen25030081
Lipofectamine 2000Gibco Invitrogen11668019
MatTek  Glass Bottom Dish 35 mm, uncoated gridMatTek CorporationP35G-2-14-CGRD
MatTek glass bottom dishes 35 mm uncoatedMatTek CorporationP35G-1.5-14C
MDA-MB 231 cellsATCCHTB-26
Opti-MEM reduced serum mediumThermo Fisher Scientific31985088
Plasmid mCherry-2XFYVEGift kindly given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)-
Plasmid mCherry-PLCδ-PHGift kindly given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)-
Raw264.7 cellsATCCTIB-71
RPMI medium 1640,without L-glutamineGibco Invitrogen#21870
Ultrapure LPSJomar Life Research Pte LtdTLR-3PELPS
Uranyl AcetateProSciTechC079
Zeiss inverted LSM880 confocal microscopeZeiss-

Referanslar

  1. King, J. S., Kay, R. R. The origins and evolution of macropinocytosis. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1765), 20180158(2019).
  2. Stow, J. L., Hung, Y., Wall, A. A. Macropinocytosis: Insights from immunology and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 65, 131-140 (2020).
  3. Kerr, M. C., Teasdale, R. D. Defining macropinocytosis. Traffic. 10 (4), 364-371 (2009).
  4. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
  5. Kim, S. M., et al. PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells. Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).
  6. Recouvreux, M. V., Commisso, C. Macropinocytosis: A metabolic adaptation to nutrient stress in cancer. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 8, 261(2017).
  7. Stow, J. L., Condon, N. D. The cell surface environment for pathogen recognition and entry. Clinical & Translational Immunology. 5 (4), 71(2016).
  8. Swanson, J. A., Watts, C. Macropinocytosis. Trends in Cell Biology. 5 (11), 424-428 (1995).
  9. Buckley, C. M., King, J. S. Drinking problems: mechanisms of macropinosome formation and maturation. FEBS Journal. 284 (22), 3778-3790 (2017).
  10. Berthiaume, E. P., Medina, C., Swanson, J. A. Molecular size-fractionation during endocytosis in macrophages. Journal of Cell Biology. 129 (4), 989-998 (1995).
  11. Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. Macropinocytosis in different cell types: Similarities and differences. Membranes (Basel). 10 (8), 177(2020).
  12. Pacitto, R., Gaeta, I., Swanson, J. A., Yoshida, S. CXCL12-induced macropinocytosis modulates two distinct pathways to activate mTORC1 in macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 101 (3), 683-692 (2017).
  13. Yoshida, S., Pacitto, R., Yao, Y., Inoki, K., Swanson, J. A. Growth factor signaling to mTORC1 by amino acid-laden macropinosomes. Journal of Cell Biology. 211 (1), 159-172 (2015).
  14. Chvanov, M., et al. Intracellular rupture, exocytosis and actin interaction of endocytic vacuoles in pancreatic acinar cells: initiating events in acute pancreatitis. Journal of Physiology. 596 (13), 2547-2564 (2018).
  15. Ballesteros, A., Swartz, K. J. Dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), e60769(2020).
  16. Weigert, R. Imaging the dynamics of endocytosis in live mammalian tissues. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (4), 017012(2014).
  17. Chen, L., et al. A novel method to image macropinocytosis in vivo. Frontiers in Neuroscience. 12, 324(2018).
  18. King, N. P., et al. Soluble NSF attachment protein receptor molecular mimicry by a Legionella pneumophila Dot/Icm effector. Cellular Microbiology. 17 (6), 767-784 (2015).
  19. Condon, N. D., et al. Macropinosome formation by tent pole ruffling in macrophages. Journal of Cell Biology. 217 (11), 3873-3885 (2018).
  20. Lemmon, M. A. Pleckstrin homology (PH) domains and phosphoinositides. Biochemical Society Symposium. 74, 81-93 (2007).
  21. Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO Journal. 19 (17), 4577-4588 (2000).
  22. Mayle, K. M., Le, A. M., Kamei, D. T. The intracellular trafficking pathway of transferrin. Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (3), 264-281 (2012).
  23. Hacker, U., Albrecht, R., Maniak, M. Fluid-phase uptake by macropinocytosis in Dictyostelium. Journal of Cell Science. 110, Pt 2 105-112 (1997).
  24. Wall, A. A., et al. Small GTPase Rab8a-recruited Phosphatidylinositol 3-Kinase gamma regulates signaling and cytokine outputs from endosomal toll-like receptors. Journal of Biological Chemistry. 292 (11), 4411-4422 (2017).
  25. Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
  26. Swanson, J. A., Yoshida, S. Macropinosomes as units of signal transduction. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1765), 20180157(2019).
  27. Schnatwinkel, C., et al. The Rab5 effector Rabankyrin-5 regulates and coordinates different endocytic mechanisms. PLoS Biology. 2 (9), 261(2004).
  28. Yeo, J. C., Wall, A. A., Luo, L., Stow, J. L. Sequential recruitment of Rab GTPases during early stages of phagocytosis. Cellular Logistics. 6 (1), 1140615(2016).
  29. Racoosin, E. L., Swanson, J. A. Macropinosome maturation and fusion with tubular lysosomes in macrophages. Journal of Cell Biology. 121 (5), 1011-1020 (1993).
  30. Dolat, L., Spiliotis, E. T. Septins promote macropinosome maturation and traffic to the lysosome by facilitating membrane fusion. Journal of Cell Biology. 214 (5), 517-527 (2016).
  31. Kuhn, S., Lopez-Montero, N., Chang, Y. Y., Sartori-Rupp, A., Enninga, J. Imaging macropinosomes during Shigella infections. Methods. , 12-22 (2017).
  32. Kommnick, C., Lepper, A., Hensel, M. Correlative light and scanning electron microscopy (CLSEM) for analysis of bacterial infection of polarized epithelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 17079(2019).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

MakropinositozH cre Kar t rmaCanl FloresanKonfokal G r nt lemeFloresan DekstranMakropinozom Tutulumuselle tirilmi Makropinozomlarift EtiketlemeLipid ProblarFloresan Membran ProteinleriKorba il I k ve Elektron Mikroskobu CLEMCanl G r nt leme Modaliteleri3D G r nt leme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır