الطفو الحر مناعة أدمغة الفأر

Summary

يصف هذا البروتوكول نهجا فعالا وقابلا للاستنساخ للدراسات النسيجية للدماغ الماوس ، بما في ذلك التشوه ، وتقسم الدماغ ، والتأنيم المناعي العائم الحر ، وتركيب الأنسجة ، والتصوير.

Abstract

تلطيخ المناعي الكيميائية من أدمغة الفئران هو تقنية روتينية تستخدم عادة في علم الأعصاب للتحقيق في الآليات المركزية الكامنة وراء تنظيم استقلاب الطاقة وغيرها من العمليات العصبية البيولوجية. ومع ذلك، قد تختلف جودة وموثوقية والاستنساخ لنتائج الأنسجة الدماغية بين المختبرات. لكل تجربة تلطيخ ، من الضروري تحسين الإجراءات الرئيسية استنادا إلى الاختلافات في الأنواع والأنسجة والبروتينات المستهدفة وظروف عمل الكواشف. توضح هذه الورقة سير عمل موثوق به بالتفصيل ، بما في ذلك التشوه داخل الأبهر ، وتفتيت الدماغ ، والتشبع المناعي العائم ، وتركيب الأنسجة ، والتصوير ، والتي يمكن متابعتها بسهولة من قبل الباحثين في هذا المجال.

كما تناقش كيفية تعديل هذه الإجراءات لتلبية الاحتياجات الفردية للباحثين. لتوضيح موثوقية وكفاءة هذا البروتوكول ، كانت الشباك العجان ملطخة بالوستاريا فلوربوندا أغغلوتينين (WFA) وأرجينين فاسوبريسين (AVP) مع مضاد مضاد ل AVP في دماغ الماوس. وأخيرا، تمت معالجة التفاصيل الهامة للإجراء بأكمله، ومزايا هذا البروتوكول مقارنة بمزايا البروتوكولات الأخرى. تقدم هذه الورقة مجتمعة بروتوكولا محسنا لاحتواء المناعة العائمة الحرة لأنسجة دماغ الماوس. إن اتباع هذا البروتوكول يجعل هذه العملية أسهل لكل من العلماء المبتدئين وكبار العلماء لتحسين جودة وموثوقية واستنساخ دراسات التضمين المناعي.

Introduction

وقد بلغ انتشار السمنة والأمراض المصاحبة لها مستويات وبائية، مما تسبب في عبء اجتماعي واقتصادي ^هائل1،2. وقد تم تطوير نماذج الماوس المختلفة لفهم أفضل للعمليات البيولوجية المسؤولة عن ^{السمنة3،4}. لأن الآليات المركزية مهمة لتنظيم التوازن الطاقة في هذه النماذج الحيوانية، أصبحت الدراسات التشريحية العصبية من أدمغة الفئران تقنية ضرورية في هذا المجال. ومع ذلك، تختلف جودة وموثوقية واستنساخ تقنيات الأنسجة الدماغية بشكل كبير بين المختبرات وحتى الباحثين داخل المختبر نفسه لأسباب مختلفة (مثل الأجسام المضادة والأنسجة والعلاجات والأنواع وأهداف البحث). لذلك ، من الضروري وضع بروتوكول عام للدراسات النسيجية لدماغ الماوس ، بما في ذلك التشوه ، وتقسم الدماغ ، والتشبع المناعي العائم الحر ، وتركيب الأنسجة ، والتصوير. وفي الوقت نفسه، يمكن للمبتدئين تعلم بسرعة، وإتقان، وضبط هذا البروتوكول لتلبية احتياجاتهم الفردية.

تلطيخ Immunohistochemical هو طريقة راسخة التي تم استخدامها على نطاق واسع لتصور أنواع محددة من الخلايا، ورنا، والبروتينات في مجموعة متنوعة من الأنسجة (مثل الدماغ والأنسجة الطرفية)^5،6. وبشكل أكثر تحديدا، يمكن تسمية مستضد الاهتمام بأجسام مضادة أولية محددة وأجسام مضادة ثانوية مقابلة مرتبطة إنزيم (مثل الكيمياء المناعية الكروموجينية) أو صبغة فلورية (الفلوريسين إيزوثيوسيانات)⁶. وكمثال على فائدة هذه التقنيات، كان β-إندورفين [ببتيد واحد مشفر بواسطة الموالية للأوبيوميلانوكرتيين (POMC)] وc-fos (علامة على نشاط الخلايا العصبية) ملطخة في نواة arcuate. وقد تبين حذف هيدروكسيلولاز التربتوفان 2 (إنزيم جزء لا يتجزأ من تخليق السيروتونين) في نواة رابي الظهرية لتقليل التعبير ج فوس في الخلايا العصبية POMC في النواة arcuate7. وبالإضافة إلى ذلك، تم تعيين توزيع مستقبلات فيتامين (د) مرنا في دماغ الماوس عن طريق التهجين في الموقع (RNAscope)⁸. تقدم هذه الورقة طريقة موثوقة وفعالة مع سير عمل خطوة بخطوة لاحتواء المناعة العائمة مجانا ، بهدف تحسين جودة واستنساخ الدراسات النسيجية لدماغ الماوس.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

استخدمت الفئران C57BL/6J من كلا الجنسين (8-16 أسابيع من العمر) في هذه الدراسة. تمت الموافقة على رعاية جميع الحيوانات وجميع الإجراءات من قبل اللجان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في كلية بايلور للطب.

1. التخبط

ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات 1.1 -1.6 في غطاء محرك السيارة fume.

1. تخدير
   1. صب 5 مل من isoflurane (انظر جدول المواد) على منشفة ورقية وضعت في الجزء السفلي من المجفف. أدخل الماوس على الحاجز المتحصن داخل المجفف وانتظر حتى تختفي علامات التنفس.
      ملاحظة: بدون التنفس الماوس مازال لديه heartbeat لفترة قصيرة من الوقت ثم سيتم perfused قبل اختفاء heartbeat.
   2. قبل المتابعة، تأكد من عدم وجود رد فعل لقرصة إصبع القدم.
   3. إصلاح الماوس إلى لوحة رغوة عن طريق قيادة دبوس من خلال كل قدم. تأكد من وضع لوح الرغوة في صينية لجمع السوائل غير المباشرة.
2. تعريض القلب
   1. إجراء شق سطحي طولي على طول خط الوسط على الصدر والبطن، ثم تحريك الجلد جانبا لفضح جدار العضلات من الصدر والبطن. بعد ذلك، قم بإجراء شق في طبقة العضلات لكشف الكبد والأمعاء. وأخيرا، قطع القفص الصدري مع مقص لفتح الصدر وفضح القلب والرئتين. استخدام ملقط الهيموستاتيكي لسحب القفص الصدري جانبا لتوسيع منطقة العمل.
3. جمع الدم النهائي (اختياري)
   1. أدخل حقنة 1 مل (انظر جدول المواد) بعناية في الأذين الأيمن للقلب حتى يتم تضمين الطرف بالكامل. أمسك المحقنة بثبات واسحب الدم ببطء حتى يتم الوصول إلى الحجم المطلوب.
      ملاحظة: الحرص على عدم اختراق الماضي الأذين الأيمن; جمع 300-400 ميكرولتر من الدم يمكن تحقيقه لكل فأر بالغ. يمكن استخدام إضافات مثل مسرع الجلطة أو مضادات التخثر، اعتمادا على الغرض من جمع الدم.
4. وضع قنية التغلغل
   1. للمبتدئين، وقطع ثقب صغير (<1 ملم) في البطين الأيسر من القلب مع مقص وإدراج قنية حادة (18 إبرة G للفئران الصغيرة و 21 إبرة G للفئران الذين تتراوح أعمارهم بين) من خلال البطين الأيسر في الشريان الأورطي الصاعد. بدلا من ذلك، للمجربين ذوي الخبرة، واختراق البطين القلب الأيسر مع قنية حادة مباشرة وإدراجه في الشريان الأورطي التصاعدي بعناية.
   2. وضع دبابيس حول اقتران القنية وأنابيب مقرونة على لوحة الرغوة لمنع الحركة أثناء التخبط. بدلا من ذلك، استخدم ملقط الهيموستاتيكي لإصلاح القنية في مكانها. المضي قدما في خفض الأذين الأيمن للسماح لتدفق الدم من الدورة الدموية.
      ملاحظة: يتم توصيل قنية النفخ والأنابيب المقترنة بمضخة النفخ.
5. التغلغل مع المالحة
   1. قم بتشغيل مفتاح الضغط المالح، وثقب الماوس عبر البطاقة مع 40-60 مل من المالحة (0.9٪ NaCl: 25 درجة مئوية، درجة الحموضة 7.4). مراقبة تدفق من الأذين الأيمن ولون الكبد عن كثب.
      ملاحظة: يتم استخدام مضخة التشوه الآلي (انظر جدول المواد) لتدفق الدم في غضون 1-2 دقيقة. وبما أن نطاق ضغط المضخة يتراوح بين 1 و300 مم زئبق، يمكن تعديل السرعة وفقا لذلك. إذا كان المالحة يتسرب من الأنف و / أو تضخم الرئة، وتقليل الضغط وضبط القنية. بمجرد أن لا يحتوي التدفق إلى الخارج على الدم ، يتم مسح الدماغ بما فيه الكفاية بالمحلول الملحي. وفي الوقت نفسه، الكبد يخلو من الدم ويصبح البني الرمادي في اللون.
6. التخبط مع الفورمولين
   1. إيقاف التبديل الضغط المالحة وتشغيل مفتاح ضغط الفورمالين لثقب الماوس مع 40 مل من 10٪ الفورمالين العازلة محايدة (10٪ NBF: 25 درجة مئوية، درجة الحموضة 6.8-7.2، انظر جدول المواد). مراقبة أطراف الحيوان للحصول على أدلة على الهزات.
      ملاحظة: يمكن ملاحظة حركة الذيل أيضا بعد ضخ 10٪ من فرنك بلجيكي. تنبيه: بما أن بنك الفجيرة الوطني خطر، يقترح أن يرتدي الباحثون معدات الحماية الشخصية (مثل جهاز التنفس المناسب، درع الوجه) طوال العملية.
7. عزل ^{الدماغ9}
   1. استخدام مقص لإزالة الرأس. جعل شق الخط الأوسط على طول integument لفضح الجمجمة. تقليم قبالة الجلد والعضلات المرفق مع مقص.
   2. جعل قطع في التلال المدارية، ومن ثم وضع نهاية حادة من مقص قزحية العين في ماغنوم foramen. تقدم المقص على طول السطح الداخلي للجمجمة ، مع الحفاظ على الضغط التصاعدي لتجنب تلف الدماغ. إزالة العظام الجدارية / الجبهية وس السحايا بعناية. وأخيرا، إزالة الدماغ من الجمجمة المفتوحة بلطف.
8. مرحلة ما بعد التثبيت
   1. ضع الدماغ في أنبوب 15 مل مملوءا ب 10 مل من 5٪ NBF و 15٪ سكروز للتثبيت بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: لإعداد 10 مل من 5٪ NBF و 15٪ سكروز، اجمع 5 مل من 10٪ NBF و 5 مل من السكروز بنسبة 30٪ (ث/ v، المذاب في المالحة العازلة بالفوسفات (PBS)، انظر جدول المواد). تأكد من أن حجم المخزن المؤقت المثبت أكبر من النموذج نفسه ب 10 أضعاف على الأقل. في البداية، سوف يطفو الدماغ في المخزن المؤقت وسوف تغرق إلى أسفل بعد التثبيت بين عشية وضحاها.
9. تجفاف
   1. نقل عينة الدماغ إلى أنبوب 15 مل مليئة 10 مل من السكروز 30٪ للجفاف في 4 درجة مئوية حتى يغرق.

2. Cryosectioning (المقاطع التاجية)

1. اعداد
   1. ضع الثلج الجاف فوق لوحة تعديل الارتفاع من ميكروتوم منزلق، وانتظر حتى يظهر الصقيع الأبيض. انتشار بعناية 5 مل من السكروز 30٪ على رأس لوحة لتشكيل طبقة من قاعدة صلبة بعد تجميد محلول السكروز تماما. ضع جميع عينات الدماغ (حتى 5 عينات من الدماغ في دفعة واحدة) أفقيا في خط أعلى السكروز ، ثم أضف 0.5 مل من السكروز بنسبة 30٪ إلى الجزء السفلي من كل دماغ.
      ملاحظة: سوف الدماغ التمسك فورا إلى قاعدة السكروز المجمدة وتجميد تدريجيا من أسفل إلى أعلى. ضع السكروز الإضافي حول الجزء المثبت من الدماغ لتشكيل قاعدة أكثر متانة للقطع.
2. تقسيم
   1. بعد 5-10 دقيقة من التجمد ، عندما يصبح الدماغ صلبا وأبيض ، قم بتقليم الدماغ حتى يتم الوصول إلى الطبقة / المنطقة المطلوبة.
      ملاحظة: ضبط كمية الثلج الجاف على لوحة للتحكم في درجة الحرارة. درجة الحرارة منخفضة جدا عندما تظهر بلورات الثلج على سطح الدماغ. درجة الحرارة مرتفعة جدا عندما يصبح الدماغ لينة ولم يعد أبيض.
   2. انتقل من وضع التقليم إلى وضع التغذية وقسم أنسجة الدماغ إلى سمك 25 ميكرومتر. إعداد لوحة 48 جيدا مليئة 1x برنامج تلفزيوني، ووضع علامة على خمسة آبار لدماغ فأر واحد. استخدام فرشاة لجمع كل قسم من ماوس واحد ووضعه في بئر واحد. جمع المقطع اللاحق من نفس الماوس ووضعه ^{في البئر 2} .
   3. كرر 2.2.2 حتى يتم الوصول ^{إلى البئر الخامس} ، ووضع الأقسام 6-10 ^{في البئر 1-5} وهلم جرا. كرر نفس الإجراء لبقية الأدمغة في وقت واحد. كرر حتى يتم جمع جميع المقاطع من فأر واحد في الآبار 5 في الترتيب التشريحي.
      ملاحظة: بعد هذا الإجراء، يتم اقتباس أقسام الدماغ من كل فأر إلى 5 سلسلة، والتي يمكن استخدامها لمدة تصل إلى 5 دراسات النسيجية المختلفة.
3. خزن
   1. استخدام فرشاة لنقل المقاطع من كل بئر إلى 1.5 مل microtube مليئة مخزن التبريد (20٪ الجلسرين، 30٪ جلايكول الإيثيلين، و 50٪ برنامج تلفزيوني)، وتخزين العينات في -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: هذه المقاطع المخزنة في أنابيب صغيرة (1.5 مل) يمكن أن توفر المساحة الفعلية في الثلاجة، ويمكن الحفاظ على سلامة المقاطع لعدة أشهر.

3. الحرة العائمة WFA تلطيخ ومكافحة AVP المناعية

1. ضع مصفاة الخلية في بئر من لوحة ثقافة الخلايا 6-جيدا مليئة برنامج تلفزيوني، واستخدام فرشاة الرسم لنقل سلسلة واحدة من أقسام الدماغ إلى مصفاة الخلية. شطف المقاطع في برنامج تلفزيوني عن طريق نقل مصفاة الخلية إلى بئر آخر مملوءة برنامج تلفزيوني. شطف لمدة 6 × 10 دقيقة على شاكر للأقسام المخزنة في عازلة cryoprotectant و 3 × 10 دقيقة لأقسام قطع الطازجة.
   ملاحظة: يتم تنفيذ جميع إجراءات الغسيل في لوحة ثقافة الخلايا 6-جيدا مع مصفاة الخلية داخل كل بئر (انظر جدول المواد). كل مصفاة يحمل أقسام الدماغ من الفائدة من كل فأر. لحفظ الكواشف، يتم تنفيذ جميع إجراءات الحضانة الموضحة أدناه في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل. بين إجراءات الغسيل والحضانة، استخدم فرشاة الطلاء لنقل أقسام الدماغ بين كل مصفاة خلايا وكل أنبوب. لغسل مع برنامج تلفزيوني، 12 مل كافية لكل بئر.
2. إعداد 1 مل من biotin المسمى WFA (1:1,000) الحل في PBT (2.5 مل من تريتون X-100 حل في 1,000 مل من برنامج تلفزيوني) العازلة في أنبوب 1.5 مل. نقل أقسام الدماغ من مصفاة الخلية إلى الأنبوب واحتضان في درجة حرارة الغرفة على منصة هزاز ~ 50 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.
3. شطف أقسام الدماغ مع برنامج تلفزيوني لمدة 3 × 10 دقيقة كما هو موضح في 3.1.
4. إعداد 1 مل من streptavidin-Dylight 488 (1:500) الحل في PBT في أنبوب 1.5 مل. نقل أقسام الدماغ في الأنبوب واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة على منصة هزاز في ~ 50 دورة في الدقيقة.
   ملاحظة: قم بتغطية اللوحة بورق لتجنب التعرض للضوء من هذه الخطوة إلى الأمام.
5. شطف أقسام الدماغ مع برنامج تلفزيوني لمدة 3 × 10 دقيقة. احتضان أقسام الدماغ في منع العازلة (3٪ مصل الحمير العادي المخفف في PBT) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: يتم تحديد اختيار منع المصل من قبل الأنواع التي يتم إنشاء الأجسام المضادة الثانوية. على سبيل المثال، إذا كان الجسم المضاد الثانوي من الماعز، يجب استخدام مصل الماعز الطبيعي.
6. احتضان أقسام الدماغ في الأجسام المضادة الأولية (أرنب المضادة لAMP، 1:500) في درجة حرارة الغرفة على منصة هزاز في ~ 50 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: تحضير كل من الأجسام المضادة الأساسية والثانوية في حظر المخزن المؤقت. يجب تحسين التركيز ومدة الحضانة ودرجة حرارة الحضانة في الدراسات التجريبية.
7. شطف أقسام الدماغ مع برنامج تلفزيوني لمدة 3 × 10 دقيقة. احتضان أقسام الدماغ في الأجسام المضادة الثانوية (اليكسا الدقيق 594 حمار المضادة للأرنب IgG (H + L)، 1:500) في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة على منصة هزاز في ~ 50 دورة في الدقيقة. شطف أقسام الدماغ مع برنامج تلفزيوني لمدة 3 × 10 دقيقة.

4. تصاعد

1. ملء اثنين من أطباق بيتري (قطرها 150 ملم) مع 100 مل من برنامج تلفزيوني 1x لكل منهما. نقل جميع أقسام الدماغ من مصفاة واحدة في الطبق الأول، ومحاذاة أقسام الدماغ في ترتيب التشريح العصبي من caudal إلى rostral.
   ملاحظة: لتجنب خلط المقاطع من الحيوانات المختلفة، قم بتركيب سلسلة واحدة من أقسام الدماغ من واحد في كل مرة.
2. بعد أن يتم محاذاة جميع أقسام الدماغ في الطبق الأول، غمر شريحة واحدة في الطبق الثاني مع نهاية واحدة مائلة قليلا مع موقف (انظر الشكل 1 والشكل 2). استخدم فرشاة طلاء دقيقة لوضع قسم الدماغ برفق أسفل واجهة العازلة الهوائية مباشرة على الشريحة المائلة. كرر نفس الإجراء مع قسم آخر من الدماغ وجبل جنبا إلى جنب مع القسم الأول.
3. استخدام ماصة نقل لإزالة ببطء وبلطف المخزن المؤقت لخفض مستواه حتى كلا القسمين الدماغ تماما فوق واجهة الهواء العازلة.
   ملاحظة: الحرص على تقليل اضطراب سطح العازلة، أو قد تطفو أقسام الدماغ بعيدا. عندما تجف، وهذا الصف من أقسام الدماغ تلتزم الشريحة بحزم. إذا لزم الأمر، قم بضبط المقاطع الموجودة على الشريحة برفق لضمان عدم وجود تجاعيد أو طيات في الأنسجة عندما تكون الأقسام لا تزال رطبة.
4. كرر هذه العملية حتى يتم الوصول إلى أسفل الشريحة. استمر في التكرار حتى يتم تحميل كافة المقاطع على الشريحة (الشرائح).

5. تغطية

1. بعد أن جفت جميع الأقسام (1-24 ساعة في درجة حرارة الغرفة)، ضع 80-100 ميكرولتر من المتوسط المتصاعد المضاد للتلاشي مع DAPI (انظر جدول المواد) على الشريحة، وتطبيق بلطف غطاء زجاجي لتغطية العينات.
   ملاحظة: تطبيق غطاء الزجاج بعناية وببطء لتجنب الفقاعات.
2. ضع الشرائح في مربع شرائح المجهر (راجع جدول المواد) وخزنها عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: صورة جميع المقاطع في غضون 1-3 أيام لتجنب يتلاشى من الفلورسينس وتطوير autofluorescence.

6. التصوير

1. قم بتشغيل الماسح الضوئي والكمبيوتر (راجع جدول المواد). ضع الشرائح في حامل الشريحة مع جهاز التحميل وأدخل الحامل في الماسح الضوئي.
   ملاحظة: يتيح الماسح الضوئي مسح قنوات متعددة (على سبيل المثال، 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), قنوات خضراء وحمراء) في وقت واحد. المسح الضوئي الشرائح فقط مع التكبير 20x، ويمكن استخدام المجهر الفلوري التقليدي (انظر جدول المواد) عند الحاجة إلى تكبير أعلى (على سبيل المثال، 40x).
2. افتح البرنامج للماسح الضوئي (راجع جدول المواد). اختر موقع التخزين المناسب وملف تعريف المسح الضوئي.
3. ابدأ فحص المعاينة بالنقر على الزر بدء معاينة الفحص . بعد معاينة الفحص، افتح معالج الكشف عن الأنسجة وحلق حول المناطق التي تهم التصوير.
4. انقر على زر بدء المسح الضوئي بعد اختيار المناطق للتصوير. انتظر حتى ينتهي الجهاز من المسح الضوئي. تحقق من ملف النتائج ثم قم بتصدير الصور.
   ملاحظة: إذا كان الملف الشخصي غير مناسب للشريحة، فاضبط عن طريق إعادة التركيز وتغيير وقت التعرض أو قوة الضوء لتكييف الملف الشخصي مع الأنسجة. راجع إرشادات الماسح الضوئي للحصول على مزيد من التفاصيل التقنية (جدول المواد).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يوضح الرسم البياني الانسيابي لهذا البروتوكول بإيجاز في الشكل 1. يظهر إجراء هذا المختبر في عملية استئصال البكاء في الشكل 2A، حيث تم تقسيم 5 عينات من الدماغ في وقت واحد. يظهر تركيب أقسام الدماغ في الشكل 2B ، ويتضح انزلاق محمول بالكامل مع أقسام ال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يوفر هذا البروتوكول طريقة راسخة للدراسات التشريحية العصبية لدماغ الفأر ، بما في ذلك التشوه ، وتقسم الأنسجة ، والتشبع المناعي العائم الحر ، وتركيب الأنسجة ، والتصوير. ومع ذلك، يجب تحسين بعض التفاصيل الأساسية اللازمة لتحقيق نتائج متسقة وموثوقة.

نوعية التشوه أمر بالغ الأهمية...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21207
30% Sucrose	VWR	470302	30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS
Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128	10%, 25 °C, pH 6.8-7.2
1 mL Sub-Q Syringe	BD	309597
48 Well Cell Culture Plate	Corning	3548
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
Antifading mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Autoclavable plastic desiccator	Thermo Scientific Nalgene	5315-0150
AVP antibody	Phoenix Pharmaceuticals	H-065-07
Cell Strainer	Corning	431752
Cryoprotectant buffer	User preference	Not applicable	20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Leica DFC310FX microscope	Leica	Not applicable
Microscope Slide Boxes (50-place)	VWR	Not applicable
PBT	User preference	Not applicable	2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS
Perfusion two automated Perfusion System	Leica	39471005
Phosphate-buffered saline (PBS) 20x	VWR	VWRVE703-1L	25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer
Slideing Microtome Microm HM450	ThermoFisher	Microm HM450
Sodium Chloride	RICCA Chemical	7220-32	0.9%, 25 °C, pH 7.4
Streptavidin Protein, DyLight 488	ThermoFisher	#21832
Triton X-100	Sigma-Aldrich	089k01921
WFA antibody	Sigma-Aldrich	L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner	Zeiss	Not applicable
Zen 3.1 software			scanner software