חיסון חופשי של מוחות עכבר

Summary

פרוטוקול זה מתאר גישה יעילה וניתנת לשחזור למחקרים היסתולוגיים במוח העכבר, כולל זלוף, חתך מוחי, חיסונים צפים חופשיים, הרכבת רקמות והדמיה.

Abstract

הכתמת אימונוהיסטוכימית של מוחות עכברים היא טכניקה שגרתית הנפוצה במדעי המוח כדי לחקור מנגנונים מרכזיים שבבקרה את ויסות חילוף החומרים של האנרגיה ותהליכים נוירוביולוגיים אחרים. עם זאת, האיכות, האמינות והשחזור של תוצאות היסטולוגיה במוח עשויות להשתנות בין מעבדות. עבור כל ניסוי מכתים, יש צורך לייעל את ההליכים העיקריים המבוססים על הבדלים בין מינים, רקמות, חלבונים ממוקדים ותנאי העבודה של ריאגנטים. מאמר זה מדגים זרימת עבודה אמינה בפירוט, כולל זלוף תוך-בתחום, חתך מוחי, חיסון צף חופשי, הרכבת רקמות והדמיה, אשר ניתן לעקוב בקלות על ידי חוקרים בתחום זה.

כמו כן נדונים כיצד לשנות נהלים אלה כדי לספק את הצרכים האישיים של החוקרים. כדי להמחיש את האמינות והיעילות של פרוטוקול זה, רשתות פרינורונאליות הוכתמו עם ביוטין תווית ויסטריה florbunda agglutinin (WFA) ו ארגינין וזופרסין (AVP) עם נוגדן אנטי AVP במוח העכבר. לבסוף, הפרטים הקריטיים עבור ההליך כולו טופלו, ואת היתרונות של פרוטוקול זה לעומת אלה של פרוטוקולים אחרים. יחד, מאמר זה מציג פרוטוקול ממוטב לחיסון חופשי של רקמת מוח העכבר. בעקבות פרוטוקול זה מקל על מדענים זוטרים ובכירים כאחד לשפר את האיכות, האמינות והשחזור של מחקרים חיסוניים.

Introduction

השכיחות של השמנת יתר ותחלואה נלווית הגיעה לרמות מגיפה, גרימת נטל חברתי-כלכלי ^עצום1,2. מודלים עכבר שונים פותחו כדי להבין טוב יותר את התהליכים הביולוגיים האחראים להשמנת ^יתר3,4. מכיוון שמנגנונים מרכזיים חשובים לוויסות הומאוסטזיס אנרגטי במודלים אלה של בעלי חיים, מחקרים נוירואנטומיים של מוחות עכברים הפכו לטכניקה הכרחית בתחום זה. עם זאת, האיכות, האמינות והשחזור של טכניקות היסטולוגיה במוח משתנות במידה ניכרת בין מעבדות ואפילו חוקרים באותה מעבדה מסיבות שונות (למשל, נוגדנים, רקמות, טיפולים, מינים, מטרות מחקר). לכן, יש צורך לקבוע פרוטוקול כללי למחקרים היסתולוגיים של מוח העכבר, כולל זלוף, חתך מוחי, חיסונים צפים חופשיים, הרכבת רקמות והדמיה. בינתיים, מתחילים יכולים ללמוד במהירות, לשלוט ולהתאים פרוטוקול זה כדי לספק את הצרכים האישיים שלהם.

כתמים אימונוהיסטוכימיים היא שיטה מבוססת כי נעשה שימוש נרחב כדי לדמיין סוגי תאים ספציפיים, mRNAs, וחלבונים במגוון רחב של רקמות (למשל, המוח ורקמות היקפיות)^5,6. ליתר דיוק, אנטיגן של עניין יכול להיות מתויג על ידי נוגדן ראשוני מסוים נוגדן משני מתאים מקושר אנזים (למשל, אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית) או צבע פלואורסצנטי (פלואורסצין איזוטיוצינט)⁶. כדוגמה לתועלת של טכניקות אלה, β-אנדורפין [פפטיד אחד מקודד על ידי פרו-אופיומלאנוקורטין (POMC)] ו- c-fos (סמן של פעילות עצבית) הוכתמו בגרעין הארקואט. מחיקה של טריפטופן הידרוקסילאז 2 (אנזים אינטגרלי לסינתזת סרוטונין) בגרעין raphe גבית תורסאלי הוכח להקטין ביטוי c-fos נוירונים POMC בגרעין ^arcuate7. בנוסף, ההפצה של mRNA קולטן ויטמין D מופה במוח העכבר באמצעות הכלאה במקום (RNAscope)⁸. מאמר זה מציג שיטה אמינה ויעילה עם זרימת עבודה שלב אחר שלב עבור חיסון צף חופשי, במטרה לשפר את האיכות ואת הרבייה של מחקרים היסטולוגיים של מוח העכבר.

Protocol

C57BL / 6J עכברים משני המינים (8-16 שבועות של גיל) שימשו במחקר הנוכחי. טיפול בכל בעלי החיים וכל ההליכים אושרו על ידי ועדות הטיפול והשימוש בבעלי חיים של מכללת ביילור.

1. זלוף

הערה: שלבים 1.1 - 1.6 מבוצעים במכסה אדים.

1. הרדמה
   1. יוצקים 5 מ"ל של איזופלוראן (ראה שולחן החומרים) על מגבת נייר המונחת בתחתית חיטוי. הציגו את העכבר על המחסום התבצר בתוך התבשר והמתינו עד לסימני נשימה.
      הערה: ללא נשימה, העכבר עדיין יש פעימות לב לתקופה קצרה של זמן, וזה יהיה perfused לפני היעלמות פעימות הלב.
   2. לפני שתמשיך, אשר שאין רפלקס לצבוט בוהן.
   3. תקן את העכבר ללוח קצף על ידי נהיגה סיכה דרך כל רגל. ודא כי לוח הקצף ממוקם במגש כדי לאסוף נוזל נוזל.
2. חשיפת הלב
   1. בצע תותח שטחי אורך לאורך קו האמצע מעל בית החזה והבטן, ולאחר מכן להזיז את העור הצידה כדי לחשוף את דופן השריר של בית החזה והבטן. לאחר מכן, לעשות נתק בשכבת השריר כדי לחשוף את הכבד ואת המעי. לבסוף, לחתוך את כלוב הצלעות עם מספריים כדי לפתוח את בית החזה ולחשוף את הלב והריאות. השתמש במלקחיים hemostatic כדי למשוך את בית החזה הצידה כדי להרחיב את אזור העבודה.
3. איסוף דם סופני (אופציונלי)
   1. הכנס מזרק של 1 מ"ל (ראה טבלת החומרים) בזהירות לתוך האטריום הימני של הלב עד שהקצה מוטבע לחלוטין. החזק את המזרק יציב ולשאוב דם לאט עד הנפח הרצוי הוא הגיע.
      הערה: הדאג לא לחדור מעבר לאטריום הנכון; אוסף של 300-400 μL של דם הוא בר השגה לכל עכבר מבוגר. תוספים כגון מאיץ קריש או נוגד קרישה עשוי לשמש, בהתאם למטרה של איסוף דם.
4. מיקום צינורית זלוף
   1. למתחילים, לחתוך חור קטן (<1 מ"מ) בחדר השמאלי של הלב עם מספריים ולהכניס צינורית קהה (18 G מחט לעכברים צעירים ו 21 G מחט לעכברים זקנים) דרך החדר השמאלי לתוך aorta עולה. לחלופין, עבור ניסויים מנוסים, לחדור את חדר הלב השמאלי עם צינורית קהה ישירות ולהכניס אותו לתוך ביבי העורקים עולה בזהירות.
   2. מניחים סיכות סביב השילוב של הצינורית וצינורות מצמידים על לוח הקצף כדי למנוע תנועה במהלך זלוף. לחלופין, השתמש במלקחיים hemostatic כדי לתקן את הצינורית במקום. המשך לחתוך את האטריום הנכון כדי לאפשר את זרימת הדם מהמחזור.
      הערה: צינורית זלוף צינורות מצמידים מחוברים משאבת זלוף.
5. זלוף עם תמיסת מלח
   1. הפעל את מתג לחץ המלח, ולפרוט את העכבר באופן transcardially עם 40-60 מ"ל של מלוחים (0.9% NaCl: 25 °C , pH 7.4). שימו לב לזרימה מהאטריום הימני ולצבע הכבד מקרוב.
      הערה: משאבת זלוף אוטומטית (ראה טבלת החומרים) משמשת לשטיפת הדם תוך 1-2 דקות. כמו טווח הלחץ של המשאבה הוא 1-300 מ"מ כ"ג, ניתן להתאים את המהירות בהתאם. אם תמיסת מלח דולפת מהאף ו/או שהריאה מנופחת, יש להפחית את הלחץ ולהתאים את הצינורית. ברגע שהזרימה כבר לא מכילה דם, המוח מוצף מספיק עם תמיסת מלח. בינתיים, הכבד נטול דם והופך לצבע חום-אפור.
6. זלוף עם פורמלין
   1. כבה את מתג לחץ המלח והפעל את מתג הלחץ הפורמלין כדי לחדיר את העכבר עם 40 מ"ל של 10% פורמלין חוצץ נייטרלי (10% NBF: 25 °C ,pH 6.8-7.2, ראה טבלת החומרים). התבונן בגפיים של החיה לראיות לרעידות.
      הערה: תנועת זנב ניתן לראות גם לאחר עירוי של 10% NBF. זהירות: מכיוון ש- NBF מסוכן, מוצע כי החוקרים ילבשו ציוד מגן אישי (למשל, מכונת הנשמה מתאימה, מגן פנים) לאורך כל ההליך.
7. בידוד ^מוחי9
   1. השתמש במספריים כדי להסיר את הראש. לעשות התנגשות קו אמצעי לאורך ההסתבכות כדי לחשוף את הגולגולת. לקצץ את העור ואת ההתקשרות שריר עם מספריים.
   2. לעשות לחתוך ברכס מסלולית, ולאחר מכן למקם את הקצה החד של מספריים קשתית לתוך מגנום foramen. לקדם את המספריים לאורך פני השטח הפנימיים של הגולגולת, שמירה על לחץ כלפי מעלה כדי למנוע נזק למוח. מוציאים את העצמות הקודקודיות/חזיתיות ומתקנים בזהירות. לבסוף, הסר את המוח מהגולגולת הפתוחה בעדינות.
8. לאחר קיבוע
   1. מניחים את המוח בצינור 15 מ"ל מלא ב-10 מ"ל של 5% NBF ו-15% סוכרוז עבור קיבעון לילה ב-4 °C (7%).
      הערה: כדי להכין 10 מ"ל של 5% NBF ו 15% סוכרוז, לשלב 5 מ"ל של 10% NBF ו 5 מ"ל של 30% סוכרוז (w / v, מומס לתוך תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS), ראה את טבלת החומרים). ודא שנפח המאגר הקיבווני גדול לפחות פי 10 מהדגימה עצמה. בתחילה, המוח יצוף במאגר וישקע לתחתית לאחר קיבעון בן לילה.
9. התייבשות
   1. העבר את דגימת המוח לצינור 15 מ"ל מלא 10 מ"ל של 30% סוכרוז להתייבשות ב 4 °C (70 °F) עד שהוא שוקע.

2. קריוזקציה (קטעים קורונל)

1. הכנה
   1. מניחים קרח יבש על גבי צלחת התאמת הגובה של מיקרוטומיה מחליקה, וממתינים עד לקבלת כפור לבן. בזהירות להתפשט 5 מ"ל של 30% סוכרוז על גבי הצלחת כדי ליצור שכבה של בסיס מוצק לאחר פתרון סוכרוז קפוא לחלוטין. מקם את כל דגימות המוח (עד 5 דגימות מוח בקבוצה אחת) אופקית בשורה מעל סוכרוז, ולאחר מכן להוסיף 0.5 מ"ל של 30% סוכרוז לתחתית כל מוח.
      הערה: המוח ידבק מיד לבסיס סוכרוז הקפוא ויקפא בהדרגה מלמטה למעלה. מניחים סוכרוז נוסף סביב החלק הרכוב של המוח כדי ליצור בסיס חזק יותר לחיתוך.
2. חתך לקטעים
   1. לאחר 5-10 דקות של הקפאה, כאשר המוח הפך קשה ולבן, לקצץ את המוח עד השכבה הרצויה / אזור הוא הגיע.
      הערה: התאימו את כמות הקרח היבש על הצלחת כדי לשלוט בטמפרטורה. הטמפרטורה נמוכה מדי כאשר גבישי קרח מופיעים על פני השטח של המוח. הטמפרטורה גבוהה מדי כאשר המוח הופך רך והוא כבר לא לבן.
   2. עבור ממצב חיתוך למצב הזנה ולרקמת המוח של המקטע לעובי של 25 מיקרומטר. הכן צלחת 48 באר מלאה PBS 1x, ולסמן חמש בארות למוח עכבר אחד. השתמש במברשת צבע כדי לאסוף כל מקטע מעכבר אחד ולהניח אותו בבאר אחת. לאסוף את החלק הבא של אותו עכבר ולמקם אותו לתוך הבאר ^השנייה .
   3. חזור על הפעולה 2.2.2 עד לבאר ^{החמישית} , הצבת קטעים 6-10 בבאר ^{1-5 וכן} הלאה. חזור על אותו הליך עבור שאר המוחות בו זמנית. חזור על הפעולה עד שכל המקטעים מעכבר אחד נאספים לתוך 5 בארות בסדר אנטומי.
      הערה: בעקבות הליך זה, מקטעי המוח מכל עכבר הם aliquoted לתוך 5 סדרות, אשר ניתן להשתמש עד 5 מחקרים היסתולוגיים שונים.
3. אחסון
   1. השתמש במכחול כדי להעביר את המקטעים מכל באר למיקרו-Tube בגודל 1.5 מ"ל מלא במאגר קריו-הגנה (20% גליצל, 30% אתילן גליקול ו-50% PBS), ולאחסן את הדגימות ב-20 °C (20 °F).
      הערה: קטעים אלה המאוחסנים בצינורות קטנים (1.5 מ"ל) יכולים לחסוך מקום פיזי במקפיא, ואת שלמות החלקים ניתן לשמר במשך מספר חודשים.

3. כתמי WFA צפים בחינם וחיסון נגד AVP

1. מניחים מסננת תאים לתוך באר של צלחת תרבית תאים 6-well מלא PBS, ולהשתמש במכחול כדי להעביר סדרה אחת של מקטעי מוח לתוך מסננת התא. לשטוף את החלקים PBS על ידי העברת מסננת התא אחר מלא PBS. יש לשטוף במשך 6 x 10 דקות על שייקר עבור חלקים המאוחסנים במאגר קריו-הגנה ו-3x10 דקות למקטעים חתוכים טריים.
   הערה: כל הליכי הכביסה מבוצעים בצלחת תרבית תאים של 6 טוב עם מסננת תאים בתוך כל באר (ראה את טבלת החומרים). כל מסננת מחזיקה את חלקי המוח של עניין מכל עכבר. כדי להציל ריאגנטים, כל הליכי הדגירה המתוארים להלן מבוצעים בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. בין הליכי כביסה ודגרה, השתמש במכחול כדי להעביר את מקטעי המוח בין כל מסננת תאים לכל צינור. לכביסה עם PBS, 12 מ"ל מתאימים לכל באר.
2. הכן 1 מ"ל של פתרון WFA (1:1,000) עם תווית ביוטין ב- PBT (2.5 מ"ל של טריטון X-100 מומס ב-1,000 מ"ל של PBS) חוצץ בצינור 1.5 מ"ל. מעבירים מקטעי מוח מסננת התא לצינור ודגר בטמפרטורת החדר על משטח נדנדה ~ 50 סל"ד לילה.
3. לשטוף את מקטעי המוח עם PBS במשך 3 x 10 דקות כמתואר ב 3.1.
4. הכן 1 מ"ל של פתרון סטרפטאבידין-Dylight 488 (1:500) ב- PBT בצינור 1.5 מ"ל. העבר מקטעי מוח לתוך הצינור ודגר בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות על פלטפורמת נדנדה ב ~ 50 סל"ד.
   הערה: לכסות את הצלחת בנייר כסף כדי למנוע חשיפה לאור מצעד זה קדימה.
5. יש לשטוף את מקטעי המוח ב-PBS למשך 3 x 10 דקות. לדגור על מקטעי המוח בחסימת חיץ (3% סרום חמור רגיל מדולל PBT) במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
   הערה: הבחירה של חסימת סרום נקבעת על ידי המינים שמהם נוצר הנוגדן המשני. למשל, אם הנוגדן המשני הוא מעז, יש להשתמש בסרום עזים רגיל.
6. לדגור על מקטעי המוח בנוגדן העיקרי (ארנב נגד AVP, 1:500) בטמפרטורת החדר על פלטפורמת נדנדה ב ~ 50 סל"ד לילה.
   הערה: הכן נוגדנים ראשוניים ומשניים במאגר חסימה. הריכוז, משך הדגירה וטמפרטורת הדגירה צריכים להיות ממוטבים במחקרי פיילוט.
7. יש לשטוף את מקטעי המוח ב-PBS למשך 3 x 10 דקות. לדגור את מקטעי המוח בנוגדן משני (קמח אלכסה 594 חמור נגד ארנב IgG (H + L), 1:500) בטמפרטורת החדר עבור 2 שעות על פלטפורמת נדנדה ב ~ 50 סל"ד. יש לשטוף את מקטעי המוח ב-PBS למשך 3 x 10 דקות.

4. הרכבה

1. מלא שתי מנות פטרי (קוטר של 150 מ"מ) עם 100 מ"ל של 1x PBS כל אחד. מעבירים את כל מקטעי המוח מסננת אחת למנה הראשונה, ומיישרים את מקטעי המוח בסדר נוירואנטומי מ-caudal ל-rostral.
   הערה: כדי להימנע מערבוב קטעים מבעלי חיים שונים, הר סדרה אחת של מקטעי מוח מבעל חיים אחד בכל פעם.
2. לאחר שכל חלקי המוח מיושרים במנה הראשונה, הטביעו שקופית אחת לתוך המנה השנייה עם קצה אחד מוטה מעט עם מעמד (ראו איור 1 ואיור 2). השתמש במברשת צבע עדינה כדי למקם בעדינות מקטע מוח ממש מתחת לממשק חיץ האוויר על השקופית המוטה. חזור על אותו הליך עם קטע מוח אחר והרכב אותו זה לצד זה עם החלק הראשון.
3. השתמש pipette העברה לאט ובעדינות להסיר את המאגר כדי להוריד את רמתו עד ששני חלקי המוח הם לגמרי מעל ממשק חיץ האוויר.
   הערה: יש להקפיד למזער את ההפרעה של משטח המאגר, או שמקטעי המוח עלולים לצוף. כאשר יבש, שורה זו של מקטעי המוח תדבוק בשקופית בחוזקה. במידת הצורך, להתאים בעדינות את החלקים בשקופית כדי להבטיח שאין קמטים או קפלים ברקמה כאשר החלקים עדיין רטובים.
4. חזור על תהליך זה עד להגעה לתחתית השקופית. המשך לחזור על הפעולה עד שכל המקטעים ייטענו על השקופיות.

5. כיסויים

1. לאחר שכל החלקים התייבשו (1-24 שעות בטמפרטורת החדר), מניחים 80-100 מיקרול של מדיום הרכבה נגד דהייה עם DAPI (ראה טבלת החומרים) בשקופית, והחלו בעדינות כיסוי זכוכית כדי לכסות את הדגימות.
   הערה: יש למרוח את כיסוי הזכוכית בזהירות ובאיטיות כדי למנוע בועות.
2. מקם את השקופיות בתיבת שקופית מיקרוסקופ (ראה את טבלת החומרים) ולאחסן אותם ב 4 °C (7 °F).
   הערה: תמונה כל הסעיפים בתוך 1-3 ימים כדי למנוע דהייה של פלואורסצנטיות ופיתוח של autofluorescence.

6. הדמיה

1. הפעלת הסורק והמחשב (ראה טבלת חומרים). מקם את השקופיות במחזיק השקופיות עם התקן הטעינה והכנס את המחזיק לסורק.
   הערה: הסורק מאפשר סריקה של ערוצים מרובים (למשל, 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI), ערוצים ירוקים ואדומים) בו-זמנית. הסורק סורק שקופיות רק בהגדלה של פי 20, וניתן להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי מסורתי (ראה טבלת חומרים) כאשר יש צורך בהגדלה גבוהה יותר (למשל, פי 40).
2. פתח את התוכנה עבור הסורק (עיין בטבלת החומרים). בחר את מיקום האחסון המתאים ואת פרופיל הסריקה.
3. התחל את סריקת התצוגה המקדימה על-ידי לחיצה על לחצן התחל סריקה מקדימה . לאחר סריקת התצוגה המקדימה, פתח את אשף זיהוי הרקמות והקף את אזורי העניין להדמיה.
4. לחץ על לחצן התחל סריקה לאחר בחירת האזורים להדמיה. המתן עד שהמכונה תסיים את הסריקה. בדוק את קובץ התוצאה וייצוא התמונות.
   הערה: אם הפרופיל אינו מתאים לשקופית, התאם על-ידי מיקוד מחדש ושינוי זמן החשיפה או עוצמת האור כדי להתאים את הפרופיל לרקמות. עיין בהוראות עבור הסורק לקבלת פרטים טכניים נוספים (טבלת חומרים).

תוצאות

תרשים הזרימה של פרוטוקול זה מומחש בקצרה באיור 1. הליך ההקפאה של מעבדה זו מוצג באיור 2A, שבו 5 דגימות מוח נותחו בו זמנית. ההרכבה של מקטעי המוח מוצגת באיור 2B, ושקופית המותקנת במלואה עם מקטעי מוח מודגמת באיור 2C. באיור 3

Discussion

פרוטוקול זה מספק שיטה מבוססת למחקרים נוירואנטומיים של מוח העכבר, כולל זלוף, חתך רקמות, חיסונים צפים חופשיים, הרכבת רקמות והדמיה. עם זאת, יש למטב כמה פרטים מרכזיים החיוניים לתוצאות עקביות ואמינות.

איכות הזלוף היא קריטית להכתמת מוצלחות. כתמי תוצאות עשויים להיות מושפעים אם הדם ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21207
30% Sucrose	VWR	470302	30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS
Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128	10%, 25 °C, pH 6.8-7.2
1 mL Sub-Q Syringe	BD	309597
48 Well Cell Culture Plate	Corning	3548
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
Antifading mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Autoclavable plastic desiccator	Thermo Scientific Nalgene	5315-0150
AVP antibody	Phoenix Pharmaceuticals	H-065-07
Cell Strainer	Corning	431752
Cryoprotectant buffer	User preference	Not applicable	20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Leica DFC310FX microscope	Leica	Not applicable
Microscope Slide Boxes (50-place)	VWR	Not applicable
PBT	User preference	Not applicable	2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS
Perfusion two automated Perfusion System	Leica	39471005
Phosphate-buffered saline (PBS) 20x	VWR	VWRVE703-1L	25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer
Slideing Microtome Microm HM450	ThermoFisher	Microm HM450
Sodium Chloride	RICCA Chemical	7220-32	0.9%, 25 °C, pH 7.4
Streptavidin Protein, DyLight 488	ThermoFisher	#21832
Triton X-100	Sigma-Aldrich	089k01921
WFA antibody	Sigma-Aldrich	L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner	Zeiss	Not applicable
Zen 3.1 software			scanner software