Свободно плавающее иммуноокрашание мозга мыши

Резюме

Этот протокол описывает эффективный и воспроизводимый подход к гистологическим исследованиям мозга мышей, включая перфузию, сечение мозга, свободно плавающее иммуноокрашивание, монтаж тканей и визуализацию.

Аннотация

Иммуногистохимическое окрашивание мозга мыши является рутинным методом, обычно используемым в неврологии для исследования центральных механизмов, лежащих в основе регуляции энергетического обмена и других нейробиологических процессов. Однако качество, надежность и воспроизводимость результатов гистологии мозга могут варьироваться в зависимости от лаборатории. Для каждого эксперимента по окрашиванию необходимо оптимизировать ключевые процедуры, основанные на различиях в видах, тканях, целевых белках и условиях работы реагентов. Эта статья демонстрирует надежный рабочий процесс в деталях, включая внутриаортальную перфузию, сечение мозга, свободно плавающее иммуноокрашивание, монтаж тканей и визуализацию, за которыми могут легко следить исследователи в этой области.

Также обсуждается, как модифицировать эти процедуры для удовлетворения индивидуальных потребностей исследователей. Чтобы проиллюстрировать надежность и эффективность этого протокола, перинейрональные сетки были окрашены биотиновым меченым гглибутинином Wisteria florbunda (WFA) и аргининовым вазопрессином (AVP) антителом против AVP в мозге мыши. Наконец, были рассмотрены критические детали для всей процедуры и преимущества этого протокола по сравнению с другими протоколами. Взятый вместе, в этой статье представлен оптимизированный протокол для свободно плавающего иммуноокрашения ткани мозга мыши. Следование этому протоколу облегчает этот процесс как младшим, так и старшим ученым для улучшения качества, надежности и воспроизводимости иммуноокрашивающих исследований.

Введение

Распространенность ожирения и связанных с ним сопутствующих заболеваний достигла уровня эпидемии, что приводит к огромному социально-экономическому ^{бремени1,2}. Различные мышиные модели были разработаны, чтобы лучше понять биологические процессы, ответственные за ^{ожирение3,4}. Поскольку центральные механизмы важны для регуляции энергетического гомеостаза на этих животных моделях, нейроанатомические исследования мозга мышей стали необходимой техникой в этой области. Тем не менее, качество, надежность и воспроизводимость методов гистологии мозга значительно различаются между лабораториями и даже исследователями в одной и той же лаборатории по разным причинам (например, антитела, ткани, методы лечения, виды, цели исследований). Поэтому необходимо установить общий протокол гистологических исследований мозга мыши, включая перфузию, сечение мозга, свободно плавающее иммуноокрашивание, крепление тканей и визуализацию. Между тем, новички могут быстро изучить, освоить и настроить этот протокол для удовлетворения своих индивидуальных потребностей.

Иммуногистохимическое окрашивание является признанным методом, который широко используется для визуализации конкретных типов клеток, мРНК и белков в различных тканях (например, мозге и периферических тканях)^5,6. Более конкретно, представляющий интерес антиген может быть меченым специфическим первичным антителом и соответствующим вторичным антителом, связанным с ферментом (например, хромогенной иммуногистохимией) или флуоресцентным красителем (флуоресцеин изотиоцианат)⁶. В качестве примера полезности этих методов β-эндорфин [один пептид, кодируемый про-опиомеланокортином (POMC)] и c-fos (маркер нейрональной активности) были окрашены в дугообразное ядро. Было показано, что делеция триптофангидроксилазы 2 (фермента, интегрального синтеза серотонина) в дорсальном ядре рафе снижает экспрессию c-fos в нейронах POMC в дугообразном ядре7. Кроме того, распределение мРНК рецептора витамина D было нанесено на карту в мозге мыши посредством гибридизации in situ (RNAscope)⁸. В данной работе представлен надежный и эффективный метод с пошаговым рабочим процессом для свободно плавающего иммуноокрашения, направленный на улучшение качества и воспроизводимости гистологических исследований мозга мыши.

протокол

В настоящем исследовании использовались мыши C57BL/6J обоих полов (в возрасте 8-16 недель). Уход за всеми животными и все процедуры были одобрены комитетами по институциональному уходу и использованию животных Медицинского колледжа Бейлора.

1. Перфузия

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.1 - 1.6 выполняются в вытяжном шкафу.

1. Анестезия
   1. Налейте 5 мл изофлурана (см. Таблицу материалов) на бумажное полотенце, расположенное в нижней части осушителя. Введите мышь на отверстие барьера внутри осушителя и подождите, пока признаки дыхания не исчезнут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Без дыхания у мыши все еще есть сердцебиение в течение короткого периода времени, и оно будет перфузировано до исчезновения сердцебиения.
   2. Прежде чем продолжить, убедитесь, что нет рефлекса на защемление пальца ноги.
   3. Прикрепите мышь к пенопластовой доске, введя булавку через каждую ногу. Убедитесь, что пенопластовая плита помещена в лоток для сбора вторичных жидкостей.
2. Обнажение сердца
   1. Сделайте продольный поверхностный разрез вдоль средней линии над грудной клеткой и животом, затем отодвиньте кожу в сторону, чтобы обнажить мышечную стенку грудной клетки и живота. Далее сделайте разрез в мышечном слое, чтобы обнажить печень и кишечник. Наконец, разрежьте грудную клетку ножницами, чтобы открыть грудную клетку и обнажить сердце и легкие. Используйте гемостатические щипцы, чтобы оттянуть грудную клетку в сторону, чтобы расширить рабочую зону.
3. Забор терминальной крови (по желанию)
   1. Осторожно вставьте шприц объемом 1 мл (см. Таблицу материалов) в правое предсердие сердца до полного встраивания наконечника. Держите шприц неподвижно и медленно вытягивайте кровь, пока не будет достигнут желаемый объем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы не проникнуть за пределы правого предсердия; Сбор 300-400 мкл крови достижим на одну взрослую мышь. Могут использоваться добавки, такие как ускоритель сгустков или антикоагулянт, в зависимости от цели сбора крови.
4. Размещение перфузионной канюли
   1. Для начинающих вырежьте ножницами небольшое отверстие (<1 мм) в левом желудочке сердца и вставьте тупую канюлю (игла 18 г для молодых мышей и игла 21 г для пожилых мышей) через левый желудочек в восходящую аорту. В качестве альтернативы, для опытных экспериментаторов, проникните в левый желудочек сердца тупой канюлей напрямую и аккуратно вставьте ее в восходящую аорту.
   2. Поместите штифты вокруг соединения канюли и спаренной трубки на пенопластовой доске, чтобы предотвратить движение во время перфузии. В качестве альтернативы, используйте гемостатические щипцы, чтобы зафиксировать канюлю на месте. Приступайте к разрезанию правого предсердия, чтобы обеспечить отток крови из кровообращения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузионная канюля и соединенная трубка соединены с перфузионным насосом.
5. Перфузия с физиологическим раствором
   1. Включите переключатель давления физиологического раствора и перфьминируйте мышь транскардиально 40-60 мл физиологического раствора (0,9% NaCl: 25 °C, рН 7,4). Внимательно наблюдайте за оттоком из правого предсердия и цветом печени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизированный перфузионный насос (см. Таблицу материалов) используется для промывки крови в течение 1-2 мин. Поскольку диапазон давления насоса составляет 1-300 мм рт.ст., скорость может быть отрегулирована соответствующим образом. Если физиологический раствор вытекает из носа и / или легкое раздувается, уменьшите давление и отрегулируйте канюлю. Как только отток перестает содержать кровь, мозг достаточно промывается физиологическим раствором. Между тем печень лишена крови и приобретает коричневато-серый цвет.
6. Перфузия с формалином
   1. Выключите реле давления физиологического раствора и включите переключатель давления формалина, чтобы перфузить мышь 40 мл 10% нейтрального буферизованного формалина (10% NBF: 25 °C, рН 6,8-7,2, см. Таблицу материалов). Понаблюдайте за конечностями животного на наличие признаков тремора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Движение хвоста может также наблюдаться после инфузии 10% NBF. ВНИМАНИЕ: Поскольку NBF опасен, исследователям предлагается носить средства индивидуальной защиты (например, соответствующий респиратор, лицевой щиток) на протяжении всей процедуры.
7. Изоляция ^мозга9
   1. Используйте ножницы, чтобы удалить голову. Сделайте разрез средней линии вдоль кожного покрова, чтобы обнажить череп. Обрежьте кожу и прикрепление мышц ножницами.
   2. Сделайте разрез на орбитальном гребне, а затем поместите острый конец ножниц радужной оболочки в отверстие magnum. Выдвигайте ножницы вдоль внутренней поверхности черепа, поддерживая давление вверх, чтобы избежать повреждения мозга. Осторожно удалите теменные/лобные кости и мозговые оболочки. Наконец, аккуратно извлеките мозг из вскрытого черепа.
8. Постфиксация
   1. Поместите мозг в трубку объемом 15 мл, заполненную 10 мл 5% NBF и 15% сахарозы для ночной фиксации при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения 10 мл 5% NBF и 15% сахарозы соедините 5 мл 10% NBF и 5 мл 30% сахарозы (мас./об., растворенные в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS), см. Таблицу материалов). Убедитесь, что объем фиксирующего буфера по крайней мере в 10 раз больше, чем сам образец. Первоначально мозг будет плавать в буфере и опустится на дно после ночной фиксации.
9. Обезвоживание
   1. Переместите образец мозга в пробирку объемом 15 мл, заполненную 10 мл 30% сахарозы для обезвоживания при 4 °C, пока она не утонет.

2. Криосекционирование (корональные сечения)

1. Подготовка
   1. Поместите сухой лед поверх пластины регулировки высоты скользящего микротома и подождите, пока не будет виден белый иней. Аккуратно выложите 5 мл 30% сахарозы поверх пластины, чтобы сформировать слой твердой основы после того, как раствор сахарозы будет полностью заморожен. Поместите все образцы мозга (до 5 образцов мозга в одной партии) горизонтально в линию поверх сахарозы, а затем добавьте 0,5 мл 30% сахарозы в нижнюю часть каждого мозга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мозг сразу же прилипнет к замороженному основанию сахарозы и постепенно замерзнет снизу вверх. Поместите дополнительную сахарозу вокруг установленной части мозга, чтобы сформировать более прочную основу для резки.
2. Секционирование
   1. После 5-10 минут замораживания, когда мозг стал твердым и белым, обрежьте мозг до тех пор, пока не будет достигнут желаемый слой / область.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте количество сухого льда на пластине, чтобы контролировать температуру. Температура слишком низкая, когда кристаллы льда появляются на поверхности мозга. Температура слишком высока, когда мозг становится мягким и больше не белым.
   2. Переключитесь из режима Обрезки в режим Подачи и разреза ткани мозга толщиной 25 мкм. Подготовьте 48-луночную пластину, заполненную 1x PBS, и отметьте пять лунок для одного мозга мыши. Используйте кисть, чтобы собрать каждый участок от одной мыши и поместить его в один колодец. Соберите последующий участок той же мыши и поместите его во ^{2-й колодец} .
   3. Повторяйте 2.2.2 до достижения ^5-й скважины, помещая секции 6-10 ^в 1-5-ю скважину и так далее. Повторите ту же процедуру для остальной части мозга одновременно. Повторяйте до тех пор, пока все участки от одной мыши не будут собраны в 5 лунок в анатомическом порядке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После этой процедуры участки мозга каждой мыши распределяются в 5 серий, которые могут быть использованы для 5 различных гистологических исследований.
3. Хранение
   1. Используйте кисть для переноса участков из каждой скважины в микропробирку объемом 1,5 мл, заполненную буфером криопротектора (20% глицерина, 30% этиленгликоля и 50% PBS), и храните образцы при -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти секции, хранящиеся в небольших пробирках (1,5 мл), могут сэкономить физическое пространство в морозильной камере, а целостность секций может сохраняться в течение нескольких месяцев.

3. Свободно плавающее окрашивание WFA и анти-AVP иммуноокрашающее

1. Поместите клеточный ситечко в колодец из 6-луночной пластины для культивирования клеток, заполненной PBS, и используйте кисть для переноса одной серии участков мозга в клеточный ситечко. Промыть участки в PBS, перенеся клеточный ситечко в другой колодец, заполненный PBS. Промыть в течение 6 х 10 мин на шейкере для секций, хранящихся в криопротекторном буфере и 3 х 10 мин для свежеразрезанных срезов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры промывки выполняются в 6-луночной клеточной культуральной пластине с клеточным сетчатым фильтром внутри каждой скважины (см. Таблицу материалов). Каждое ситечко содержит участки мозга, представляющие интерес для каждой мыши. Для экономии реагентов все описанные ниже процедуры инкубации выполняются в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Между промывкой и инкубационными процедурами используйте кисть для переноса участков мозга между каждым клеточным ситечком и каждой трубкой. Для промывки PBS достаточно 12 мл для каждой лунки.
2. Готовят 1 мл меченого биотином раствора WFA (1:1000) в буфере PBT (2,5 мл Triton X-100, растворенного в 1000 мл PBS) в пробирке объемом 1,5 мл. Перенесите участки мозга из клеточного ситечка в трубку и инкубируйте при комнатной температуре на качающейся платформе ~ 50 об/мин в течение ночи.
3. Промывайте участки мозга PBS в течение 3 x 10 мин, как описано в 3.1.
4. Готовят 1 мл раствора стрептавидина-Дилайта 488 (1:500) в ПБТ в пробирке объемом 1,5 мл. Перенесите срезы мозга в трубку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 ч на качающейся платформе при ~50 об/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Накройте пластину фольгой, чтобы избежать воздействия света с этого шага вперед.
5. Промывайте участки мозга PBS в течение 3 x 10 мин. Инкубируют участки мозга в блокирующем буфере (3% нормальной ослиной сыворотки, разведенной в ПБТ) в течение 2 ч при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор блокирующей сыворотки определяется видом, из которого генерируется вторичное антитело. Например, если вторичное антитело от козла, следует использовать нормальную козью сыворотку.
6. Инкубируют участки мозга в первичном антителе (анти-AVP кролика, 1:500) при комнатной температуре на качающейся платформе при ~50 об/мин в течение ночи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Получайте как первичные, так и вторичные антитела в блокирующем буфере. Концентрация, продолжительность инкубации и температура инкубации должны быть оптимизированы в пилотных исследованиях.
7. Промывайте участки мозга PBS в течение 3 x 10 мин. Инкубируют участки мозга во вторичных антителах (Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L), 1:500) при комнатной температуре в течение 2 ч на качающейся платформе при ~50 об/мин. Промывайте участки мозга PBS в течение 3 x 10 мин.

4. Монтаж

1. Наполните две чашки Петри (диаметром 150 мм) 100 мл по 1x PBS каждая. Переместите все участки мозга с одного ситечка в первую чашку и выровняйте участки мозга в нейроанатомическом порядке от каудального до рострального.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать смешивания секций разных животных, установите одну серию секций мозга от одного животного за раз.
2. После того, как все участки мозга выровнены в первой чашке, погрузите один слайд во второе блюдо с одним концом, слегка наклоненным подставкой (см. Рисунок 1 и Рисунок 2). Используйте тонкую кисть, чтобы аккуратно поместить секцию мозга чуть ниже интерфейса воздушного буфера на наклонном слайде. Повторите ту же процедуру с другим участком мозга и установите его бок о бок с первым отделом.
3. Используйте передаточную пипетку, чтобы медленно и осторожно удалить буфер, чтобы понизить его уровень, пока оба отдела мозга не окажутся полностью над интерфейсом воздух-буфер.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы свести к минимуму нарушение буферной поверхности, иначе участки мозга могут уплыть. При высыхании этот ряд участков мозга будет прочно прилипать к слайду. При необходимости аккуратно отрегулируйте участки на слайде, чтобы убедиться, что в ткани нет морщин или складок, когда участки еще влажные.
4. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будет достигнута нижняя часть слайда. Продолжайте повторять до тех пор, пока все секции не будут установлены на слайд(ы).

5. Обшивка

1. После того, как все секции высохнут (1-24 ч при комнатной температуре), поместите 80-100 мкл антивядающей монтажной среды с DAPI (см. Таблицу материалов) на слайд и аккуратно нанесите стеклянную крышку, чтобы покрыть образцы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наносите стеклянную крышку осторожно и медленно, чтобы избежать пузырьков.
2. Поместите слайды в коробку для слайдов микроскопа (см. Таблицу материалов) и храните их при температуре 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изобразите все участки в течение 1-3 дней, чтобы избежать затухания флуоресценции и развития автофлуоресценции.

6. Визуализация

1. Включите сканер и компьютер (см. Таблицу материалов). Поместите слайды в держатель слайдов вместе с загрузочным устройством и вставьте держатель в сканер.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сканер позволяет сканировать несколько каналов (например, 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), зеленый и красный каналы) одновременно. Сканер сканирует слайды только с 20-кратным увеличением, а традиционный флуоресцентный микроскоп (см. Таблицу материалов) можно использовать, когда требуется более высокое увеличение (например, 40x).
2. Откройте программное обеспечение для сканера (см. Таблицу материалов). Выберите соответствующее место хранения и профиль сканирования.
3. Запустите сканирование предварительного просмотра, нажав кнопку Начать предварительное сканирование . После предварительного сканирования откройте мастер обнаружения тканей и обведите кружком интересующие области для визуализации.
4. Нажмите кнопку Начать сканирование после выбора областей для визуализации. Подождите, пока устройство завершит сканирование. Проверьте файл результатов и экспортируйте изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если профиль не подходит для слайда, отрегулируйте, перефокусировав и изменив время экспозиции или силу света, чтобы адаптировать профиль к тканям. Обратитесь к инструкции к сканеру для получения более подробной технической информации (Таблица материалов).

Результаты

Блок-схема этого протокола кратко проиллюстрирована на рисунке 1. Процедура криосечения в этой лаборатории показана на рисунке 2А, в котором 5 образцов мозга были разделены одновременно. Крепление участков мозга показано на рисунке 2B, а п?...

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает установленный метод нейроанатомических исследований мозга мыши, включая перфузию, сечение тканей, свободно плавающее иммуноокрашивание, монтаж тканей и визуализацию. Тем не менее, несколько ключевых деталей, необходимых для последовательных и надежных рез...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21207
30% Sucrose	VWR	470302	30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS
Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128	10%, 25 °C, pH 6.8-7.2
1 mL Sub-Q Syringe	BD	309597
48 Well Cell Culture Plate	Corning	3548
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
Antifading mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Autoclavable plastic desiccator	Thermo Scientific Nalgene	5315-0150
AVP antibody	Phoenix Pharmaceuticals	H-065-07
Cell Strainer	Corning	431752
Cryoprotectant buffer	User preference	Not applicable	20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Leica DFC310FX microscope	Leica	Not applicable
Microscope Slide Boxes (50-place)	VWR	Not applicable
PBT	User preference	Not applicable	2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS
Perfusion two automated Perfusion System	Leica	39471005
Phosphate-buffered saline (PBS) 20x	VWR	VWRVE703-1L	25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer
Slideing Microtome Microm HM450	ThermoFisher	Microm HM450
Sodium Chloride	RICCA Chemical	7220-32	0.9%, 25 °C, pH 7.4
Streptavidin Protein, DyLight 488	ThermoFisher	#21832
Triton X-100	Sigma-Aldrich	089k01921
WFA antibody	Sigma-Aldrich	L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner	Zeiss	Not applicable
Zen 3.1 software			scanner software