Imunostaining flutuante livre de cérebros de rato

Resumo

Este protocolo descreve uma abordagem eficiente e reprodutível para estudos histológicos cerebrais do camundongo, incluindo perfusão, seção cerebral, imunostaining flutuante livre, montagem de tecido e imagem.

Resumo

A coloração imunohistoquímica do cérebro de camundongos é uma técnica de rotina comumente usada na neurociência para investigar mecanismos centrais subjacentes à regulação do metabolismo energético e outros processos neurobiológicos. No entanto, a qualidade, confiabilidade e reprodutibilidade dos resultados da histologia cerebral podem variar entre os laboratórios. Para cada experimento de coloração, é necessário otimizar os procedimentos-chave baseados em diferenças de espécies, tecidos, proteínas direcionadas e condições de trabalho dos reagentes. Este artigo demonstra um fluxo de trabalho confiável em detalhes, incluindo perfusão intra-aórtica, seção cerebral, imunostaining flutuante livre, montagem de tecido e imagem, que podem ser seguidos facilmente por pesquisadores neste campo.

Também são discutidos como modificar esses procedimentos para satisfazer as necessidades individuais dos pesquisadores. Para ilustrar a confiabilidade e eficiência deste protocolo, as redes perineuronas foram manchadas com wisteria florbunda agglutinina (WFA) e vasopressina arginina (AVP) com um anticorpo anti-AVP no cérebro do rato. Finalmente, os detalhes críticos de todo o procedimento foram abordados, e as vantagens deste protocolo em comparação com os de outros protocolos. Juntos, este artigo apresenta um protocolo otimizado para a imunostaining flutuante livre do tecido cerebral do rato. Seguir este protocolo torna esse processo mais fácil para cientistas juniores e seniores melhorarem a qualidade, confiabilidade e reprodutibilidade dos estudos de imunossuagem.

Introdução

A prevalência de obesidade e comorbidades associadas atingiu níveis epidêmicos, causando uma tremenda carga socioeconômica1,2. Vários modelos de camundongos foram desenvolvidos para entender melhor os processos biológicos responsáveis pela ^obesidade3,4. Como os mecanismos centrais são importantes para a regulação da homeostase energética nesses modelos animais, estudos neuroanatomômicos de cérebros de camundongos tornaram-se uma técnica necessária neste campo. No entanto, a qualidade, confiabilidade e reprodutibilidade das técnicas de histologia cerebral variam consideravelmente entre laboratórios e até pesquisadores dentro do mesmo laboratório por várias razões (por exemplo, anticorpos, tecidos, tratamentos, espécies, objetivos de pesquisa). Portanto, é necessário estabelecer um protocolo geral para estudos histológicos do cérebro do camundongo, incluindo perfusão, secção cerebral, imunostaining flutuante livre, montagem de tecidos e imagem. Enquanto isso, os iniciantes podem aprender, dominar e ajustar rapidamente este protocolo para satisfazer suas necessidades individuais.

A coloração imunohistoquímica é um método estabelecido que tem sido usado extensivamente para visualizar tipos de células específicas, mRNAs e proteínas em uma variedade de tecidos (por exemplo, tecidos cerebrais e periféricos)^5,6. Mais especificamente, um antígeno de interesse pode ser rotulado por um anticorpo primário específico e um anticorpo secundário correspondente ligado a uma enzima (por exemplo, imunohistoquímica cromogênica) ou um corante fluorescente (isothiocyanato fluoresceína)⁶. Como exemplo da utilidade dessas técnicas, β-endorfina [um peptídeo codificado por pró-opiomelanocortina (POMC)) e c-fos (um marcador de atividade neuronal) foram manchados no núcleo arcuato. A exclusão da hidroxilase triptofano 2 (enzima integral à síntese de serotonina) no núcleo de raphe dorsal mostrou-se diminuir a expressão c-fos nos neurônios POMC no núcleo ^arcuato7. Além disso, a distribuição do receptor de vitamina D mRNA foi mapeada no cérebro do camundongo através da hibridização in situ (RNAscope)⁸. Este artigo apresenta um método confiável e eficiente com um fluxo de trabalho passo a passo para imunostaining flutuante livre, visando melhorar a qualidade e a reprodutibilidade dos estudos histológicos do cérebro do camundongo.

Protocolo

Foram utilizados camundongos C57BL/6J de ambos os sexos (8-16 semanas de idade) no presente estudo. O cuidado com todos os animais e todos os procedimentos foi aprovado pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Baylor College of Medicine.

1. Perfusão

NOTA: As etapas 1.1 - 1.6 são realizadas em um capô de fumaça.

1. Anestesia
   1. Despeje 5 mL de isoflurane (veja a Tabela de Materiais) em uma toalha de papel colocada na parte inferior de um dessecador. Introduza o mouse na barreira furada dentro do dessedático e espere até que os sinais de respiração tenham desaparecido.
      NOTA: Sem respiração, o rato ainda tem batimentos cardíacos por um curto período de tempo, e será perfundido antes do desaparecimento dos batimentos cardíacos.
   2. Antes de prosseguir, confirme que não há reflexo para um dedo do dedo do tempo.
   3. Fixar o mouse em uma placa de espuma dirigindo um pino através de cada pé. Certifique-se de que a placa de espuma seja colocada em uma bandeja para coletar derramamento de líquido.
2. Expondo o coração
   1. Faça uma incisão superficial longitudinal ao longo da linha média sobre o tórax e abdômen, em seguida, mova a pele de lado para expor a parede muscular do tórax e abdômen. Em seguida, faça uma incisão na camada muscular para expor o fígado e o intestino. Por fim, corte a caixa torácica com uma tesoura para abrir o tórax e expor o coração e os pulmões. Use fórceps hemostáticos para puxar a caixa torácica de lado para ampliar a área de trabalho.
3. Coleta de sangue terminal (opcional)
   1. Insira uma seringa de 1 mL (veja a tabela de materiais) cuidadosamente no átrio direito do coração até que a ponta esteja completamente embutida. Mantenha a seringa firme e retire o sangue lentamente até que o volume desejado seja atingido.
      NOTA: Tome cuidado para não penetrar além do átrio direito; A coleta de 300-400 μL de sangue é alcançável por rato adulto. Podem ser utilizados aditivos como um acelerador de coágulos ou anticoagulante, dependendo da finalidade da coleta de sangue.
4. Colocação da cânula de perfusão
   1. Para iniciantes, corte um pequeno orifício (<1 mm) no ventrículo esquerdo do coração com uma tesoura e insira uma cânula cega (agulha de 18 G para camundongos jovens e agulha de 21 G para camundongos envelhecidos) através do ventrículo esquerdo na aorta ascendente. Alternativamente, para experimentadores experientes, penetre o ventrículo cardíaco esquerdo com uma cânula sem corte diretamente e insira-o na aorta ascendente cuidadosamente.
   2. Coloque pinos ao redor da conjunção da cânula e tubos acoplados na placa de espuma para evitar o movimento durante a perfusão. Alternativamente, use fórceps hemostáticos para fixar a cânula no lugar. Prossiga para cortar o átrio direito para permitir a saída de sangue de circulação.
      NOTA: A cânula de perfusão e o tubo acoplado estão conectados à bomba de perfusão.
5. Perfusão com soro fisiológico
   1. Ligue o interruptor de pressão salina e perfunde o rato transcardialmente com 40-60 mL de soro fisiológico (0,9% NaCl: 25 °C, pH 7.4). Observe a saída do átrio direito e a cor do fígado de perto.
      NOTA: Uma bomba de perfusão automatizada (ver a tabela de materiais) é usada para lavar o sangue dentro de 1-2 min. Como a faixa de pressão da bomba é de 1-300 mmHg, a velocidade pode ser ajustada de acordo. Se a solução salina estiver vazando do nariz e/ou o pulmão estiver inflado, diminua a pressão e ajuste a cânula. Uma vez que o fluxo de saída não contém mais sangue, o cérebro é suficientemente lavado com soro fisiológico. Enquanto isso, o fígado é desprovido de sangue e se torna cor marrom-cinza.
6. Perfusão com formalina
   1. Desligue o interruptor de pressão salina e ligue o interruptor de pressão formalina para permear o mouse com 40 mL de formalina tamponada neutra de 10% (10% NBF: 25 °C, pH 6.8-7.2, ver a Tabela de Materiais). Observe os membros do animal para obter evidências de tremores.
      NOTA: O movimento da cauda também pode ser observado após a infusão de 10% de NBF. ATENÇÃO: Como a NBF é perigosa, sugere-se que os pesquisadores usem equipamentos de proteção individual (por exemplo, respirador apropriado, protetor facial) durante todo o procedimento.
7. Isolamento ^cerebral9
   1. Use uma tesoura para remover a cabeça. Faça uma incisão da linha média ao longo do argumento para expor o crânio. Corte a pele e o apego muscular com uma tesoura.
   2. Faça um corte no cume orbital, e então coloque a ponta afiada da tesoura de íris no foramen magnum. Avance a tesoura ao longo da superfície interna do crânio, mantendo a pressão para cima para evitar danos ao cérebro. Remova os ossos parietal/frontal e meninges cuidadosamente. Finalmente, remova o cérebro do crânio aberto suavemente.
8. Pós-fixação
   1. Coloque o cérebro em um tubo de 15 mL preenchido com 10 mL de 5% NBF e 15% de sacarose para fixação durante a noite a 4 °C.
      NOTA: Para preparar 10 mL de 5% de NBF e 15% de sacarose, combine 5 mL de 10% NBF e 5 mL de 30% de sacarose (c/v, dissolvida em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS), consulte a Tabela de Materiais). Certifique-se de que o volume do buffer fixador seja pelo menos 10x maior do que a própria amostra. Inicialmente, o cérebro flutuará no tampão e afundará até o fundo após a fixação durante a noite.
9. Desidratação
   1. Transfira a amostra cerebral para um tubo de 15 mL preenchido com 10 mL de 30% de sacarose para desidratação a 4 °C até afundar.

2. Cryosectioning (seções coronais)

1. Preparação
   1. Coloque gelo seco em cima da placa de ajuste de altura de um microtome deslizante, e espere até que a geada branca seja visível. Espalhe cuidadosamente 5 mL de 30% de sacarose em cima da placa para formar uma camada de base sólida depois que a solução de sacarose estiver totalmente congelada. Coloque todas as amostras cerebrais (até 5 amostras cerebrais em um lote) horizontalmente em uma linha em cima da sacarose, e depois adicione 0,5 mL de 30% de sacarose ao fundo de cada cérebro.
      NOTA: O cérebro se aterá imediatamente à base de sacarose congelada e congelará gradualmente de baixo para cima. Coloque sacarose adicional ao redor da porção montada do cérebro para formar uma base mais resistente para o corte.
2. Corte
   1. Após 5-10 minutos de congelamento, quando o cérebro se tornar duro e branco, corte o cérebro até que a camada/região desejada seja atingida.
      NOTA: Ajuste a quantidade de gelo seco na placa para controlar a temperatura. A temperatura é muito baixa quando cristais de gelo aparecem na superfície do cérebro. A temperatura é muito alta quando o cérebro fica macio e não é mais branco.
   2. Mude do modo Trim para o modo Alimentação e se sectione tecido cerebral para 25 μm de espessura. Prepare uma placa de 48 poços cheia de 1x PBS, e marque cinco poços para um cérebro de rato. Use um pincel para coletar cada seção de um rato e colocá-lo em um poço. Colete a seção subsequente do mesmo mouse e coloque-a no ^{segundo poço.}
   3. Repita 2.2.2 até que o ^{quinto poço seja} alcançado, colocando as seções 6-10 no ^1º-5º bem e assim por diante. Repita o mesmo procedimento para o resto do cérebro simultaneamente. Repita até que todas as seções de um rato sejam coletadas nos 5 poços em ordem anatômica.
      NOTA: Após este procedimento, as seções cerebrais de cada rato são aliquos em série 5, que pode ser usada para até 5 estudos histológicos diferentes.
3. Armazenamento
   1. Use um pincel para transferir as seções de cada poço para um microtubo de 1,5 mL cheio de tampão crioprotetor (20% glicerol, 30% de etileno glicol e 50% PBS), e armazene as amostras a -20 °C.
      NOTA: Estas seções armazenadas em tubos pequenos (1,5 mL) podem economizar espaço físico no congelador, e a integridade das seções pode ser preservada por vários meses.

3. Coloração WFA flutuante livre e imunostaining anti-AVP

1. Coloque um coador de células em um poço de uma placa de cultura celular de 6 poços cheia de PBS, e use um pincel para transferir uma série de seções cerebrais para o coador celular. Enxágüe as seções em PBS transferindo o coador de células para outro bem preenchido com PBS. Enxágüe por 6 x 10 min em um shaker para seções armazenadas em tampão crioprotetor e 3 x 10 min para seções recém-cortadas.
   NOTA: Todos os procedimentos de lavagem são realizados em uma placa de cultura celular de 6 poços com um coador de célula dentro de cada poço (veja a Tabela de Materiais). Cada coador contém as seções cerebrais de interesse de cada rato. Para salvar reagentes, todos os procedimentos de incubação descritos abaixo são realizados em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL. Entre os procedimentos de lavagem e incubação, use um pincel para transferir as seções cerebrais entre cada coador celular e cada tubo. Para lavar com PBS, 12 mL é adequado para cada poço.
2. Prepare 1 mL de solução WFA (1:1.000) com rótulo biotina em PBT (2,5 mL de Triton X-100 dissolvido em 1.000 mL de PBS) tampão em tubo de 1,5 mL. Transfira seções cerebrais do coador celular para o tubo e incubar à temperatura ambiente em uma plataforma de balanço ~50 rpm durante a noite.
3. Enxágüe as seções cerebrais com PBS por 3 x 10 min, conforme descrito em 3.1.
4. Prepare 1 mL de solução streptavidin-Dylight 488 (1:500) em PBT em um tubo de 1,5 mL. Transfira seções cerebrais para o tubo e incubar à temperatura ambiente por 2 h em uma plataforma de balanço a ~50 rpm.
   NOTA: Cubra a placa com papel alumínio para evitar a exposição da luz deste passo em frente.
5. Enxágüe as seções cerebrais com PBS por 3 x 10 min. Incubar as seções cerebrais no tampão de bloqueio (3% de soro de burro normal diluído em PBT) por 2 h à temperatura ambiente.
   NOTA: A escolha do soro de bloqueio é determinada pela espécie a partir da qual o anticorpo secundário é gerado. por exemplo, se o anticorpo secundário for de cabra, deve ser usado soro de cabra normal.
6. Incubar as seções cerebrais em anticorpos primários (anti-AVP de coelho, 1:500) à temperatura ambiente em uma plataforma de balanço a ~50 rpm durante a noite.
   NOTA: Prepare os anticorpos primários e secundários no buffer de bloqueio. A concentração, duração da incubação e temperatura da incubação precisam ser otimizadas em estudos piloto.
7. Enxágüe as seções cerebrais com PBS por 3 x 10 min. Incubar as seções cerebrais em anticorpos secundários (Alexa Farinha 594 burro anti-coelho IgG (H+L), 1:500) à temperatura ambiente por 2 h em uma plataforma de balanço a ~50 rpm. Enxágüe as seções cerebrais com PBS por 3 x 10 min.

4. Montagem

1. Encha duas placas de Petri (um diâmetro de 150 mm) com 100 mL de 1x PBS cada. Transfira todas as seções cerebrais de um coador para o primeiro prato, e alinhe as seções cerebrais na ordem neuroanatomética de caudal para rostral.
   NOTA: Para evitar misturar seções de diferentes animais, monte uma série de seções cerebrais de um animal de cada vez.
2. Depois que todas as seções cerebrais estão alinhadas no primeiro prato, submergir um deslize para o segundo prato com uma extremidade ligeiramente inclinada com um suporte (ver Figura 1 e Figura 2). Use um pincel fino para colocar suavemente uma seção cerebral logo abaixo da interface de tampão de ar no slide inclinado. Repita o mesmo procedimento com outra seção cerebral e monte-o lado a lado com a primeira seção.
3. Use uma pipeta de transferência para remover lentamente e suavemente o buffer para baixar seu nível até que ambas as seções cerebrais estejam inteiramente acima da interface de tampão de ar.
   NOTA: Tome cuidado para minimizar a perturbação da superfície tampão, ou as seções cerebrais podem flutuar para longe. Quando seca, esta linha de seções cerebrais vai aderir ao slide firmemente. Se necessário, ajuste suavemente as seções na lâmina para garantir que não haja rugas ou dobras no tecido quando as seções ainda estiverem molhadas.
4. Repita este processo até que a parte inferior do slide seja atingida. Continue a repetir até que todas as seções sejam montadas no slide(s).

5. Cobertura

1. Depois de todas as seções secarem (1-24 h à temperatura ambiente), coloque 80-100 μL de meio de montagem anti-desbotamento com DAPI (veja a Tabela de Materiais) no slide, e aplique delicadamente uma mancha de vidro para cobrir as amostras.
   NOTA: Aplique a tampa do vidro com cuidado e lentamente para evitar bolhas.
2. Coloque os slides em uma caixa de slides de microscópio (veja a tabela de materiais) e armazene-os a 4 °C.
   NOTA: Imagem de todas as seções dentro de 1-3 dias para evitar o desbotamento da fluorescência e o desenvolvimento de autofluorescência.

6. Imagem

1. Ligue o scanner e o computador (ver Tabela de Materiais). Posicione os slides no suporte de slides com o dispositivo de carregamento e insira o suporte no scanner.
   NOTA: O scanner permite a varredura de múltiplos canais (por exemplo, 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), canais verdes e vermelhos) simultaneamente. O scanner escaneia slides apenas com uma ampliação de 20x, e um microscópio fluorescente tradicional (ver Tabela de Materiais) pode ser usado quando uma ampliação mais alta (por exemplo, 40x) é necessária.
2. Abra o software para o scanner (consulte a Tabela de Materiais). Escolha o local de armazenamento apropriado e o perfil de digitalização.
3. Inicie a verificação de visualização clicando no botão Iniciar a verificação de visualização . Após a visualização, abra o assistente de detecção de tecidos e circule as regiões de interesse para a imagem.
4. Clique no botão Iniciar varredura depois de escolher as regiões para imagens. Aguarde que a máquina termine a varredura. Verifique o arquivo de resultado e exporte as imagens.
   NOTA: Se o perfil estiver inadequado para o slide, ajuste refocando e alterando o tempo de exposição ou a força da luz para adaptar o perfil aos tecidos. Consulte as instruções para o scanner para obter mais detalhes técnicos (Tabela de Materiais).

Resultados

O fluxograma deste protocolo é brevemente ilustrado na Figura 1. O procedimento de crioseção deste laboratório é demonstrado na Figura 2A, na qual 5 amostras cerebrais foram seccionadas simultaneamente. A montagem de seções cerebrais é mostrada na Figura 2B, e um slide totalmente montado com seções cerebrais é ilustrado na Figura 2C. Na Figura 3, foram observadas...

Discussão

Este protocolo fornece um método estabelecido para estudos neuroanatomáticos do cérebro do camundongo, incluindo perfusão, secção tecidual, imunostaining flutuante livre, montagem de tecido e imagem. No entanto, alguns detalhes-chave essenciais para resultados consistentes e confiáveis devem ser otimizados.

A qualidade da perfusão é fundamental para o sucesso da coloração. Os resultados da coloração podem ser afetados se o sangue permanecer no cérebro, dado que os glóbulos sangu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21207
30% Sucrose	VWR	470302	30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS
Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128	10%, 25 °C, pH 6.8-7.2
1 mL Sub-Q Syringe	BD	309597
48 Well Cell Culture Plate	Corning	3548
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
Antifading mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Autoclavable plastic desiccator	Thermo Scientific Nalgene	5315-0150
AVP antibody	Phoenix Pharmaceuticals	H-065-07
Cell Strainer	Corning	431752
Cryoprotectant buffer	User preference	Not applicable	20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Leica DFC310FX microscope	Leica	Not applicable
Microscope Slide Boxes (50-place)	VWR	Not applicable
PBT	User preference	Not applicable	2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS
Perfusion two automated Perfusion System	Leica	39471005
Phosphate-buffered saline (PBS) 20x	VWR	VWRVE703-1L	25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer
Slideing Microtome Microm HM450	ThermoFisher	Microm HM450
Sodium Chloride	RICCA Chemical	7220-32	0.9%, 25 °C, pH 7.4
Streptavidin Protein, DyLight 488	ThermoFisher	#21832
Triton X-100	Sigma-Aldrich	089k01921
WFA antibody	Sigma-Aldrich	L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner	Zeiss	Not applicable
Zen 3.1 software			scanner software