Inmunotinción flotante de cerebros de ratón

Resumen

Este protocolo describe un enfoque eficiente y reproducible para los estudios histológicos cerebrales de ratón, incluida la perfusión, la seccionamiento cerebral, la inmunotinción flotante, el montaje de tejidos y las imágenes.

Resumen

La tinción inmunohistoquímica de cerebros de ratón es una técnica rutinaria comúnmente utilizada en neurociencia para investigar los mecanismos centrales subyacentes a la regulación del metabolismo energético y otros procesos neurobiológicos. Sin embargo, la calidad, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados de histología cerebral pueden variar entre los laboratorios. Para cada experimento de tinción, es necesario optimizar los procedimientos clave en función de las diferencias en especies, tejidos, proteínas objetivo y las condiciones de trabajo de los reactivos. Este documento demuestra un flujo de trabajo confiable en detalle, que incluye perfusión intraaórtica, seccionamiento cerebral, inmunotinción flotante, montaje de tejidos e imágenes, que pueden ser seguidos fácilmente por investigadores en este campo.

También se discute cómo modificar estos procedimientos para satisfacer las necesidades individuales de los investigadores. Para ilustrar la fiabilidad y eficiencia de este protocolo, las redes perineuronales se tiñeron con aglutinina Wisteria florbunda marcada con biotina (WFA) y arginina vasopresina (AVP) con un anticuerpo anti-AVP en el cerebro del ratón. Finalmente, se han abordado los detalles críticos para todo el procedimiento, y las ventajas de este protocolo en comparación con las de otros protocolos. En conjunto, este artículo presenta un protocolo optimizado para la inmunotinción flotante del tejido cerebral del ratón. Seguir este protocolo hace que este proceso sea más fácil para los científicos junior y senior para mejorar la calidad, confiabilidad y reproducibilidad de los estudios de inmunotinción.

Introducción

La prevalencia de obesidad y comorbilidades asociadas ha alcanzado niveles epidémicos, causando una tremenda carga ^{socioeconómica1,2}. Se han desarrollado diversos modelos de ratón para comprender mejor los procesos biológicos responsables de la ^obesidad3,4. Debido a que los mecanismos centrales son importantes para la regulación de la homeostasis energética en estos modelos animales, los estudios neuroanatómicos de cerebros de ratón se han convertido en una técnica necesaria en este campo. Sin embargo, la calidad, confiabilidad y reproducibilidad de las técnicas de histología cerebral varían considerablemente entre los laboratorios e incluso los investigadores dentro del mismo laboratorio por diversas razones (por ejemplo, anticuerpos, tejidos, tratamientos, especies, objetivos de investigación). Por lo tanto, es necesario establecer un protocolo general para los estudios histológicos del cerebro del ratón, incluida la perfusión, la seccionamiento cerebral, la inmunotinción flotante, el montaje de tejidos y las imágenes. Mientras tanto, los principiantes pueden aprender, dominar y ajustar rápidamente este protocolo para satisfacer sus necesidades individuales.

La tinción inmunohistoquímica es un método establecido que se ha utilizado ampliamente para visualizar tipos específicos de células, ARNm y proteínas en una variedad de tejidos (por ejemplo, tejido cerebral y periférico)^5,6. Más específicamente, un antígeno de interés puede ser marcado por un anticuerpo primario específico y un anticuerpo secundario correspondiente vinculado a una enzima (por ejemplo, inmunohistoquímica cromogénica) o un colorante fluorescente (isotiocianato de fluoresceína)⁶. Como ejemplo de la utilidad de estas técnicas, β-endorfina [un péptido codificado por pro-opiomelanocortina (POMC)] y c-fos (un marcador de actividad neuronal) se tiñeron en el núcleo arqueado. Se demostró que la deleción de triptófano hidroxilasa 2 (una enzima integral a la síntesis de serotonina) en el núcleo dorsal del rafe disminuye la expresión de c-fos en las neuronas POMC en el núcleo ^arqueado7. Además, se mapeó la distribución del ARNm del receptor de vitamina D en el cerebro del ratón mediante hibridación in situ (RNAscope)⁸. Este artículo presenta un método confiable y eficiente con un flujo de trabajo paso a paso para la inmunotinción flotante, con el objetivo de mejorar la calidad y la reproducibilidad de los estudios histológicos del cerebro del ratón.

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Protocolo

En el presente estudio se utilizaron ratones C57BL/6J de ambos sexos (8-16 semanas de edad). El cuidado de todos los animales y todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de Baylor College of Medicine.

1. Perfusión

NOTA: Los pasos 1.1 a 1.6 se realizan en una campana extractora de humos.

1. Anestesia
   1. Vierta 5 ml de isoflurano (consulte la Tabla de materiales) sobre una toalla de papel colocada en la parte inferior de un desecador. Introduzca el ratón en la barrera agujereada dentro del desecador y espere hasta que los signos de respiración hayan desaparecido.
      NOTA: Sin respiración, el ratón todavía tiene latidos cardíacos durante un corto período de tiempo, y se perfundirá antes de la desaparición de los latidos del corazón.
   2. Antes de continuar, confirme que no hay reflejo de un pellizco en el dedo del pie.
   3. Fije el ratón a una tabla de espuma pasando un alfiler a través de cada pie. Asegúrese de que la tabla de espuma se coloque en una bandeja para recoger el derrame de líquido.
2. Exponiendo el corazón
   1. Haga una incisión superficial longitudinal a lo largo de la línea media sobre el tórax y el abdomen, luego mueva la piel a un lado para exponer la pared muscular del tórax y el abdomen. A continuación, haga una incisión en la capa muscular para exponer el hígado y el intestino. Finalmente, corte la caja torácica con tijeras para abrir el tórax y exponer el corazón y los pulmones. Use pinzas hemostáticas para tirar de la caja torácica a un lado para ensanchar el área de trabajo.
3. Recolección de sangre terminal (opcional)
   1. Inserte una jeringa de 1 ml (consulte la Tabla de materiales) cuidadosamente en la aurícula derecha del corazón hasta que la punta esté completamente incrustada. Mantenga la jeringa firme y extraiga sangre lentamente hasta que se alcance el volumen deseado.
      NOTA: Tenga cuidado de no penetrar más allá de la aurícula derecha; La recolección de 300-400 μL de sangre es alcanzable por ratón adulto. Se pueden usar aditivos como un acelerador de coágulos o anticoagulante, dependiendo del propósito de la recolección de sangre.
4. Colocación de la cánula de perfusión
   1. Para los principiantes, corte un pequeño orificio (<1 mm) en el ventrículo izquierdo del corazón con tijeras e inserte una cánula roma (aguja de 18 G para ratones jóvenes y aguja de 21 G para ratones envejecidos) a través del ventrículo izquierdo en la aorta ascendente. Alternativamente, para los experimentadores experimentados, penetre el ventrículo cardíaco izquierdo con una cánula roma directamente e insértela en la aorta ascendente con cuidado.
   2. Coloque pasadores alrededor de la conjunción de la cánula y el tubo acoplado en la tabla de espuma para evitar el movimiento durante la perfusión. Alternativamente, use pinzas hemostáticas para fijar la cánula en su lugar. Proceda a cortar la aurícula derecha para permitir la salida de sangre de la circulación.
      NOTA: La cánula de perfusión y el tubo acoplado están conectados a la bomba de perfusión.
5. Perfusión con solución salina
   1. Encienda el interruptor de presión salina y perfunda al ratón transcárdicamente con 40-60 ml de solución salina (0,9% NaCl: 25 °C, pH 7,4). Observe de cerca la salida de la aurícula derecha y el color del hígado.
      NOTA: Se utiliza una bomba de perfusión automatizada (consulte la Tabla de materiales) para enjuagar la sangre en 1-2 minutos. Como el rango de presión de la bomba es de 1-300 mmHg, la velocidad se puede ajustar en consecuencia. Si la solución salina tiene fugas de la nariz y / o el pulmón está inflado, disminuya la presión y ajuste la cánula. Una vez que el flujo de salida ya no contiene sangre, el cerebro está lo suficientemente enrojecido con solución salina. Mientras tanto, el hígado está desprovisto de sangre y se vuelve de color gris parduzco.
6. Perfusión con formalina
   1. Apague el interruptor de presión salina y encienda el interruptor de presión de formalina para perfundir el ratón con 40 ml de formalina tamponada neutra al 10% (10% NBF: 25 ° C, pH 6.8-7.2, consulte la Tabla de materiales). Observe las extremidades del animal en busca de evidencia de temblores.
      NOTA: El movimiento de la cola también se puede observar después de la infusión de 10% NBF. PRECAUCIÓN: Como nbF es peligroso, se sugiere que los investigadores usen equipo de protección personal (por ejemplo, respirador apropiado, protector facial) durante todo el procedimiento.
7. Aislamiento ^cerebral9
   1. Use tijeras para quitar la cabeza. Haga una incisión en la línea media a lo largo del tegumento para exponer el cráneo. Recorte la piel y la unión muscular con tijeras.
   2. Haga un corte en la cresta orbital y luego coloque el extremo afilado de las tijeras del iris en el foramen magnum. Avance las tijeras a lo largo de la superficie interna del cráneo, manteniendo la presión hacia arriba para evitar daños en el cerebro. Retire los huesos parietales/frontales y las meninges con cuidado. Finalmente, retire el cerebro del cráneo abierto suavemente.
8. Post-fijación
   1. Coloque el cerebro en un tubo de 15 ml lleno de 10 ml de NBF al 5% y sacarosa al 15% para la fijación durante la noche a 4 ° C.
      NOTA: Para preparar 10 ml de NBF al 5% y sacarosa al 15%, combine 5 ml de NBF al 10% y 5 ml de sacarosa al 30% (p/v, disuelto en solución salina tamponada con fosfato (PBS), consulte la Tabla de materiales). Asegúrese de que el volumen del búfer fijador sea al menos 10 veces mayor que la propia muestra. Inicialmente, el cerebro flotará en el amortiguador y se hundirá hasta el fondo después de la fijación nocturna.
9. Deshidratación
   1. Transfiera la muestra de cerebro a un tubo de 15 ml lleno de 10 ml de sacarosa al 30% para la deshidratación a 4 ° C hasta que se hunda.

2. Crioseccionación (secciones coronales)

1. Preparación
   1. Coloque hielo seco encima de la placa de ajuste de altura de un microtomo deslizante y espere hasta que la escarcha blanca sea visible. Extienda cuidadosamente 5 ml de sacarosa al 30% en la parte superior de la placa para formar una capa de una base sólida después de que la solución de sacarosa esté completamente congelada. Coloque todas las muestras de cerebro (hasta 5 muestras de cerebro en un lote) horizontalmente en una línea en la parte superior de la sacarosa, y luego agregue 0.5 ml de sacarosa al 30% a la parte inferior de cada cerebro.
      NOTA: El cerebro se adherirá inmediatamente a la base de sacarosa congelada y se congelará gradualmente de abajo hacia arriba. Coloque sacarosa adicional alrededor de la porción montada del cerebro para formar una base más resistente para cortar.
2. Seccionamiento
   1. Después de 5-10 minutos de congelación, cuando el cerebro se haya vuelto duro y blanco, recorte el cerebro hasta que se alcance la capa / región deseada.
      NOTA: Ajuste la cantidad de hielo seco en la placa para controlar la temperatura. La temperatura es demasiado baja cuando aparecen cristales de hielo en la superficie del cerebro. La temperatura es demasiado alta cuando el cerebro se vuelve blando y ya no es blanco.
   2. Cambie del modo Trim al modo Feed y sección de tejido cerebral a 25 μm de espesor. Prepare una placa de 48 pocillos llena de 1x PBS y marque cinco pocillos para un cerebro de ratón. Use un pincel para recoger cada sección de un mouse y colóquela en un pozo. Recoge la sección posterior del mismo ratón y colócala en el ^2º pozo.
   3. Repita 2.2.2 hasta que se alcance el ^5º pozo, colocando las secciones 6-10 en el ^1º-5º pozo y así sucesivamente. Repita el mismo procedimiento para el resto de los cerebros simultáneamente. Repita hasta que todas las secciones de un ratón se recojan en los 5 pocillos en orden anatómico.
      NOTA: Después de este procedimiento, las secciones cerebrales de cada ratón se alicitan en 5 series, que se pueden utilizar para hasta 5 estudios histológicos diferentes.
3. Almacenamiento
   1. Use un pincel para transferir las secciones de cada pozo a un microtubo de 1,5 ml lleno de tampón crioprotector (20% de glicerol, 30% de etilenglicol y 50% de PBS), y almacene las muestras a -20 °C.
      NOTA: Estas secciones almacenadas en tubos pequeños (1,5 ml) pueden ahorrar espacio físico en el congelador, y la integridad de las secciones se puede conservar durante varios meses.

3. Tinción WFA flotante e inmunotinción anti-AVP

1. Coloque un colador celular en un pozo de una placa de cultivo celular de 6 pocillos llena de PBS, y use un pincel para transferir una serie de secciones cerebrales al colador celular. Enjuague las secciones en PBS transfiriendo el colador celular a otro pozo lleno de PBS. Enjuague durante 6 x 10 min en un agitador para secciones almacenadas en tampón crioprotector y 3 x 10 min para secciones recién cortadas.
   NOTA: Todos los procedimientos de lavado se realizan en una placa de cultivo celular de 6 pocillos con un colador celular dentro de cada pozo (ver la Tabla de Materiales). Cada colador contiene las secciones cerebrales de interés de cada ratón. Para ahorrar reactivos, todos los procedimientos de incubación descritos a continuación se realizan en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Entre los procedimientos de lavado e incubación, use un pincel para transferir las secciones cerebrales entre cada colador celular y cada tubo. Para el lavado con PBS, 12 ml es adecuado para cada pozo.
2. Preparar 1 ml de solución WFA (1:1.000) marcada con biotina en tampón PBT (2,5 ml de Tritón X-100 disuelto en 1.000 ml de PBS) en tubo de 1,5 ml. Transfiera secciones cerebrales del colador celular al tubo e incube a temperatura ambiente en una plataforma basculante ~ 50 rpm durante la noche.
3. Enjuague las secciones cerebrales con PBS durante 3 x 10 minutos como se describe en 3.1.
4. Preparar 1 ml de solución de estreptavidina-Dylight 488 (1:500) en PBT en un tubo de 1,5 ml. Transfiera secciones cerebrales al tubo e incube a temperatura ambiente durante 2 h en una plataforma basculante a ~ 50 rpm.
   NOTA: Cubra la placa con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz de este paso adelante.
5. Enjuague las secciones cerebrales con PBS durante 3 x 10 min. Incubar las secciones cerebrales en tampón de bloqueo (3% de suero normal de burro diluido en PBT) durante 2 h a temperatura ambiente.
   NOTA: La elección del suero bloqueador está determinada por la especie a partir de la cual se genera el anticuerpo secundario. por ejemplo, si el anticuerpo secundario es de cabra, se debe usar suero de cabra normal.
6. Incubar las secciones cerebrales en anticuerpos primarios (conejo anti-AVP, 1:500) a temperatura ambiente en una plataforma basculante a ~50 rpm durante la noche.
   NOTA: Prepare anticuerpos primarios y secundarios en el tampón de bloqueo. La concentración, la duración de la incubación y la temperatura de incubación deben optimizarse en estudios piloto.
7. Enjuague las secciones cerebrales con PBS durante 3 x 10 min. Incubar las secciones cerebrales en anticuerpos secundarios (Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L), 1:500) a temperatura ambiente durante 2 h en una plataforma basculante a ~50 rpm. Enjuague las secciones cerebrales con PBS durante 3 x 10 min.

4. Montaje

1. Llene dos placas de Petri (un diámetro de 150 mm) con 100 ml de 1x PBS cada una. Transfiera todas las secciones cerebrales de un colador al primer plato y alinee las secciones cerebrales en orden neuroanatómico de caudal a rostral.
   NOTA: Para evitar mezclar secciones de diferentes animales, monte una serie de secciones cerebrales de un animal a la vez.
2. Después de que todas las secciones del cerebro estén alineadas en el primer plato, sumerja una diapositiva en el segundo plato con un extremo ligeramente inclinado con un soporte (ver Figura 1 y Figura 2). Use un pincel fino para colocar suavemente una sección cerebral justo debajo de la interfaz de búfer de aire en la diapositiva inclinada. Repita el mismo procedimiento con otra sección del cerebro y móntelo al lado de la primera sección.
3. Use una pipeta de transferencia para quitar lenta y suavemente el búfer para bajar su nivel hasta que ambas secciones del cerebro estén completamente por encima de la interfaz del búfer de aire.
   NOTA: Tenga cuidado de minimizar la perturbación de la superficie del amortiguador, o las secciones del cerebro pueden flotar. Cuando esté seca, esta fila de secciones cerebrales se adherirá firmemente a la diapositiva. Si es necesario, ajuste suavemente las secciones de la diapositiva para asegurarse de que no haya arrugas o pliegues en el tejido cuando las secciones aún estén húmedas.
4. Repita este proceso hasta que se alcance la parte inferior de la diapositiva. Continúe repitiendo hasta que todas las secciones estén montadas en la(s) diapositiva(s).

5. Coverslipping

1. Después de que todas las secciones se hayan secado (1-24 h a temperatura ambiente), coloque 80-100 μL de medio de montaje antidesvanecimiento con DAPI (consulte la Tabla de materiales) en la diapositiva y aplique suavemente una cubierta de vidrio para cubrir las muestras.
   NOTA: Aplique la cubierta de vidrio con cuidado y lentamente para evitar burbujas.
2. Coloque los portaobjetos en una caja de portaobjetos de microscopio (consulte la Tabla de materiales) y guárdelos a 4 °C.
   NOTA: Tome imágenes de todas las secciones dentro de 1-3 días para evitar el desvanecimiento de la fluorescencia y el desarrollo de la autofluorescencia.

6. Imágenes

1. Encienda el escáner y el ordenador (consulte la Tabla de materiales). Coloque las diapositivas en el soporte de la diapositiva con el dispositivo de carga e inserte el soporte en el escáner.
   NOTA: El escáner permite escanear múltiples canales (por ejemplo, canales 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), verde y rojo) simultáneamente. El escáner escanea diapositivas solo con un aumento de 20x, y se puede usar un microscopio fluorescente tradicional (consulte la Tabla de materiales) cuando se necesita un aumento más alto (por ejemplo, 40x).
2. Abra el software del escáner (consulte la Tabla de materiales). Elija la ubicación de almacenamiento y el perfil de escaneo adecuados.
3. Inicie el análisis de vista previa haciendo clic en el botón Iniciar análisis de vista previa . Después de la exploración preliminar, abra el asistente de detección de tejidos y rodee las regiones de interés para la obtención de imágenes.
4. Haga clic en el botón Iniciar escaneo después de elegir las regiones para la obtención de imágenes. Espere a que la máquina termine de escanear. Compruebe el archivo de resultados y exporte las imágenes.
   NOTA: Si el perfil no es adecuado para la diapositiva, ajuste reenfocando y cambiando el tiempo de exposición o la intensidad de la luz para adaptar el perfil a los tejidos. Consulte las instrucciones del escáner para obtener más detalles técnicos (Tabla de materiales).

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Resultados

El diagrama de flujo de este protocolo se ilustra brevemente en la Figura 1. El procedimiento de crioseccionamiento de este laboratorio se demuestra en la Figura 2A, en la que se seccionaron 5 muestras de cerebro simultáneamente. El montaje de las secciones cerebrales se muestra en la Figura 2B, y una diapositiva completamente montada con secciones cerebrales se ilustra en la Figura 2C. En

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Discusión

Este protocolo proporciona un método establecido para estudios neuroanatómicos del cerebro del ratón, incluida la perfusión, la seccionamiento de tejido, la inmunotinción flotante, el montaje de tejidos y las imágenes. Sin embargo, se deben optimizar algunos detalles clave esenciales para obtener resultados consistentes y confiables.

La calidad de la perfusión es fundamental para una tinción exitosa. Los resultados de las tinciones podrían verse afectados si la sangre permanece en el ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21207
30% Sucrose	VWR	470302	30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS
Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128	10%, 25 °C, pH 6.8-7.2
1 mL Sub-Q Syringe	BD	309597
48 Well Cell Culture Plate	Corning	3548
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
Antifading mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Autoclavable plastic desiccator	Thermo Scientific Nalgene	5315-0150
AVP antibody	Phoenix Pharmaceuticals	H-065-07
Cell Strainer	Corning	431752
Cryoprotectant buffer	User preference	Not applicable	20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Leica DFC310FX microscope	Leica	Not applicable
Microscope Slide Boxes (50-place)	VWR	Not applicable
PBT	User preference	Not applicable	2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS
Perfusion two automated Perfusion System	Leica	39471005
Phosphate-buffered saline (PBS) 20x	VWR	VWRVE703-1L	25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer
Slideing Microtome Microm HM450	ThermoFisher	Microm HM450
Sodium Chloride	RICCA Chemical	7220-32	0.9%, 25 °C, pH 7.4
Streptavidin Protein, DyLight 488	ThermoFisher	#21832
Triton X-100	Sigma-Aldrich	089k01921
WFA antibody	Sigma-Aldrich	L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner	Zeiss	Not applicable
Zen 3.1 software			scanner software