マウス脳のフリーフローティング免疫染色

要約

このプロトコルは、灌流、脳切片、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングを含むマウス脳組織学的研究のための効率的で再現可能なアプローチを記述する。

要約

マウス脳の免疫構造化学的染色は、エネルギー代謝やその他の神経生物学的プロセスの調節の基礎となる中心的なメカニズムを調査するために神経科学で一般的に使用される日常的な技術です。しかし、脳組織学の結果の質、信頼性、再現性は、実験室によって異なる場合があります。染色実験ごとに、種、組織、標的タンパク質、試薬の作業条件の違いに基づいて重要な手順を最適化する必要があります。本論文では、大動脈灌流、脳切除、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングなど、この分野の研究者が容易に追跡できる信頼性の高いワークフローを詳細に示す。

また、研究者の個々のニーズを満たすためにこれらの手順を変更する方法についても説明します。このプロトコルの信頼性と効率を説明するために、ペリニューロンネットは、マウス脳内の抗AVP抗体を有するビオチン標識藤フラルブダ凝集(WFA)およびアルギニンバソプレシン(AVP)で染色された。最後に、手順全体の重要な詳細が取り上げられており、このプロトコルの利点は他のプロトコルのそれと比較されます。本論文は、マウス脳組織の自由浮遊免疫染色に最適化されたプロトコルを提示する。このプロトコルに従うと、このプロセスは、ジュニアと上級の両方の科学者が免疫染色研究の品質、信頼性、および再現性を向上させることが容易になります。

概要

肥満とそれに伴う併存疾患の有病率は流行レベルに達し、社会経済的負担が大きい^1,2を引き起こしている。肥満の原因となる生物学的プロセスをより深く理解するために、様々なマウスモデルが開発されました^3,4。これらの動物モデルにおけるエネルギー恒常性の調節には中心的なメカニズムが重要であるため、マウス脳の神経解剖学的研究はこの分野で必要な技術となっています。しかし、脳組織学の技術の品質、信頼性、再現性は、様々な理由(例えば、抗体、組織、治療、種、研究目的)のために、同じ研究室内の研究室や研究者によってかなり異なります。したがって、灌流、脳切片、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングなど、マウス脳の組織学的研究のための一般的なプロトコルを確立する必要があります。一方、初心者は、迅速に学び、マスターし、個々のニーズを満たすために、このプロトコルを調整することができます。

免疫組織化学的染色は、様々な組織(例えば、脳および末梢^{組織)における}特定の細胞タイプ、mRNA、およびタンパク質を可視化するために広く使用されてきた確立された方法である^5,6。より具体的には、目的の抗原は、酵素(例えば、発色性免疫組織化学)または蛍光色素(フルオレセイン等性菌化)⁶に結合した特異的一次抗体および対応する二次抗体によって標識することができる。これらの技術の有用性の一例として、β-エンドルフィン(プロアピオメラノコルチン(POMC)でコードされる1つのペプチド)およびc-fos(ニューロン活性のマーカー)を円弧核に染色した。トリプトファンヒドロキシラーゼ2(セロトニン合成に不可欠な酵素)の欠失は、アルクアテ核中のPOMCニューロンにおけるc-fos発現を減少させることが示^された。また、ビタミンD受容体mRNAの分布を、その領域ハイブリダイゼーション(RNAscope)⁸でマウス脳内にマッピングした。本論文は、マウス脳の組織学的研究の質と再現性を向上させることを目的として、自由浮遊免疫染色のためのステップバイステップのワークフローを用いて、信頼性の高い効率的な方法を提示する。

プロトコル

両性のC57BL/6Jマウス(8〜16週齢)を本研究で使用した。すべての動物のケアとすべての手順は、ベイラー医科大学の制度的動物ケアと使用委員会によって承認されました。

1. 灌流

注:ステップ 1.1-1.6 はヒュームフードで行われます。

1. 麻酔
   1. 5 mL のイオブルラン( 材料表参照)を、デシケータの底に置いたペーパータオルに注ぎます。デシケータの内側に穴があいたバリアにマウスを導入し、呼吸の兆候が消えるまで待ちます。
      注: 呼吸なしで、マウスは短時間の心拍を持ち、心拍が消失する前に、それが浸透します。
   2. 先に進む前に、つま先ピンチに反射がないことを確認してください。
   3. 各足を通してピンを駆動することにより、泡板にマウスを固定します。泡板が液体の波及を集めるために皿に置かれていることを確認して下ろします。
2. 心をさらけ出す
   1. 胸郭と腹部の上に正中線に沿って縦方向の表面的な切開を行い、胸部と腹部の筋肉壁を露出させるために皮膚を脇に移動します。次に、筋肉層を切開して肝臓と腸を露出させる。最後に、胸郭を開き、心臓と肺を露出させるためにはさみで肋骨ケージをカットします。止血鉗子を使用して胸部を引き離し、作業領域を広げます。
3. 末端血液の収集(オプション)
   1. 先端が完全に埋め込まれるまで、1 mLのシリンジ( 材料表を参照)を心臓の右心房に慎重に挿入します。シリンジをしっかり保持し、所望のボリュームに達するまでゆっくりと血液を引きます。
      注:右のアトリウムを越えて浸透しないように注意してください。300-400 μLの血液の収集は、成虫マウス1頭につき達成可能です。血栓促進剤または抗凝固剤などの添加剤は、採血の目的に応じて使用され得る。
4. 灌流カニューレの配置
   1. 初心者のために、心臓の左心室に小さな穴(<1mm)をはさみで切り、左心室を通して鈍いカニューレ(若いマウスは18G針、老化したマウスは21G針)を左心室から上昇大根に挿入する。あるいは、経験豊富な実験者のために、鈍いカニューレで左心室を直接浸透させ、慎重に上昇大オルタに挿入する。
   2. カニューレと結合チューブの接続体の周りにピンを置き、発泡板にチューブを結合して、灌流中の動きを防ぎます。あるいは、止血鉗子を使用してカニューレを所定の位置に固定します。右心房を切って血液の循環からの流出を可能にする。
      注:灌流カニューレと結合チューブは、灌流ポンプに接続されています。
5. 生理食前の灌流
   1. 生理液圧スイッチをオンにし、マウスを40~60mLの生理的に透過して透過します(0.9%NaCl:25°C、pH 7.4)。右心房からの流出と肝臓の色を注意深く観察します。
      注:自動灌流ポンプ( 材料表を参照)は、1〜2分以内に血液を洗い流すために使用されます。ポンプの圧力範囲は1-300 mmHgであるため、速度はそれに応じて調整することができます。生理が鼻から漏れている場合や肺が膨張している場合は、圧力を下げ、カニューレを調整します。流出が血液を含まなくなったら、脳は生理的に十分に洗い流される。一方、肝臓は血液を欠き、色が茶色がかった灰色になります。
6. ホルマリンの灌流
   1. 生理用圧力スイッチをオフにし、ホルマリン圧力スイッチをオンにして、マウスに10%中性緩衝ホルマリン(10%NBF:25°C、pH 6.8-7.2)の40 mLを使用してマウスを浸透させます( 材料表参照)。揺れの証拠のために動物の手足を観察してください。
      注:10%NBFの注入後に尾の動きも観察されるかもしれません。注意:NBFは危険であるため、研究者は手順全体を通して個人的な保護具(例えば、適切な呼吸器、顔シールド)を着用することが示唆されています。
7. 脳分離⁹
   1. 頭を取り除くためにはさみを使用してください。頭蓋骨を露出させるために、インテグメントに沿って中間線の切開を行います。はさみで皮膚と筋肉の付着を切り落とします。
   2. 軌道尾根でカットを行い、虹彩はさみの鋭い端を奥のマグナムに入れ。頭蓋の内面に沿ってはさみを進め、脳の損傷を避けるために上圧を維持する。頭頂部/前頭骨と髄膜を慎重に取り除きます。最後に、開いた頭蓋骨から脳を優しく取り除きます。
8. 後固定
   1. 脳を15mLのチューブに入れ、10mLの5%NBFと15%のスクロースを15%のスクロースで満たし、4°Cで一晩固定します。
      注:5%NBFと15%スクロースの10 mLを調製するには、10%NBFの5 mLと30%スクロースの5 mLを組み合わせます(w/v、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解し、 材料表を参照してください。固定バッファーのボリュームがサンプル自体よりも少なくとも 10 倍大きいことを確認します。最初は、脳はバッファに浮かび、一晩固定した後に底に沈みます。
9. 脱水
   1. 脳サンプルを、沈むまで4°Cで脱水するために、10 mLのスクロースを10 mLで満たしたチューブに移します。

2. クライオセクニング(コロナセクション)

1. 準備
   1. スライド式ミクロトームの高さ調整プレートの上にドライアイスを置き、白霜が見えるまで待ちます。プレートの上に5mLのスクロースを慎重に広げ、スクロース溶液を完全凍結した後に固形塩基の層を形成する。すべての脳サンプル(1つのバッチで最大5つの脳サンプル)をスクロースの上の行に水平に配置し、各脳の底に30%のスクロースの0.5 mLを追加します。
      注:脳はすぐに凍結スクロースベースに固執し、徐々に下から上に凍結します。脳の取り付けられた部分の周りに追加のスクロースを配置し、切断のための頑丈なベースを形成します。
2. セクショニング
   1. 凍結の5〜10分後、脳が硬く白くなったら、所望の層/領域に達するまで脳を整える。
      メモ:温度を制御するためにプレート上のドライアイスの量を調整します。氷の結晶が脳の表面に現れると、温度が低すぎます。脳が柔らかくなり、白くなくなったとき、温度が高すぎます。
   2. トリムモードからフィードモードに切り替え、脳組織を25μmの厚さに切り替えます。1x PBSで満たされた48ウェルプレートを準備し、1つのマウス脳に5つの井戸をマークします。1つのマウスから各セクションを収集し、1つの井戸にそれを配置するために、ペイントブラシを使用しています。同じマウスの後続のセクションを収集し^、第二の井戸にそれを配置します。
   3. 5^番目 のウェルに達するまで2.2.2を繰り返し、セクション6-10を^第1-5^ウェル に配置します。脳の残りの部分に対して同じ手順を同時に繰り返します。1つのマウスからすべてのセクションが解剖学的順序で5つの井戸に集められるまで繰り返します。
      注:この手順に従って、各マウスからの脳のセクションは、最大5つの異なる組織学的研究のために使用することができる5シリーズにアリクォートされています。
3. 貯蔵
   1. 各ウェルから、クリオプロテクトバッファー(グリセロール20%、エチレングリコール30%、PBS50%)を充填した1.5mLマイクロチューブに切片を移し、サンプルを-20°Cで保存します。
      注:小さなチューブ(1.5 mL)に保存されたこれらのセクションは、冷凍庫の物理的なスペースを節約することができ、セクションの整合性は数ヶ月間保持することができます。

3. フリーフローティングWFA染色および抗AVP免疫染色

1. PBSで満たされた6ウェルの細胞培養プレートのウェルに細胞ストレーナーを入れ、ペイントブラシを使用して1つの一連の脳セクションを細胞ストレーナーに移します。細胞ストレーナーをPBSで満たされた別の細胞に移すことによって、PBSのセクションをすすいだ。クライオプロテクタントバッファーに保管されているセクションのシェーカーで6 x 10分、切りたばかりのセクションでは3 x 10分のリンス。
   注:すべての洗浄手順は、各ウェル内に細胞ストレーナーを備えた6ウェル細胞培養プレートで行われます( 材料表を参照)。各ストレーナーは、各マウスから関心のある脳のセクションを保持します。試薬を保存するために、以下に説明するすべてのインキュベーション手順は、1.5 mLマイクロ遠心分離チューブで行われます。洗浄とインキュベーションの間に、各細胞ストレーナーと各チューブの間で脳の切片を転移させるために絵筆を使用します。PBSで洗浄する場合、各ウェルに12mLが適しています。
2. 1.5 mLチューブでPBT(トリトンX-100の2.5 mL)バッファーに1mLのビオチン標識WFA(1:1,000)溶液を調製します。脳切片を細胞ストレーナーからチューブに移し、一晩でロッキングプラットフォームで室温でインキュベートします。
3. 3.1 で説明したように 3 x 10 分間 PBS で脳のセクションをすすい。
4. PBTで1mLのストレプトアビジン-ダイライト488(1:500)溶液を1.5mLチューブで調製します。脳切片をチューブに移し、~50rpmで揺れるプラットホームで2時間室温でインキュベートする。
   注:このステップからの光の露出を防ぐためにホイルでプレートを覆います。
5. 3 x 10分間PBSで脳切片をすすいでください。脳切片をブロッキングバッファー(PBTで希釈した正常ロバ血清3%)で室温で2時間インキュベートする。
   注:血清を遮断する選択は、二次抗体が生成される種によって決定されます。例えば、二次抗体がヤギからである場合、通常のヤギ血清を使用する必要があります。
6. 一次抗体の脳切片(ウサギの抗AVP、1:500)を、ロッキングプラットフォーム上で一晩〜50rpmで室温でインキュベートする。
   注: ブロッキング バッファーで一次抗体と 2 次抗体の両方を準備します。インキュベーションの濃度、持続時間、およびインキュベーションの温度は、パイロット研究で最適化する必要があります。
7. 3 x 10分間PBSで脳切片をすすいでください。脳切片を二次抗体(Alexa Flour 594ロバ抗ウサギIgG(H+L)、1:500)のロッキングプラットフォーム上で2時間室温で、~50rpmでインキュベートします。3 x 10分間PBSで脳切片をすすいでください。

4. 取り付け

1. 2つのペトリ皿(直径150mm)にそれぞれ100mLの1x PBSを充填します。1つのストレーナーから最初の皿にすべての脳セクションを転送し、尾部から鼻尾部までの神経解剖学的秩序で脳セクションを整列させます。
   注:異なる動物からのセクションを混合しないように、一度に1つの動物から脳のセクションの1つのシリーズをマウントします。
2. 最初の皿ですべての脳のセクションが整列した後、1つのスライドを2番目の皿に沈め、片方の端をスタンドでわずかに傾けます( 図1 と 図2を参照)。細かいペイントブラシを使用して、傾いたスライドのすぐ下に脳部をエアバッファインターフェースのすぐ下にそっと置きます。別の脳のセクションと同じ手順を繰り返し、最初のセクションと並んでそれをマウント.
3. 両方の脳のセクションが完全に空気バッファーインターフェイスの上になるまで、ゆっくりと穏やかにバッファーを除去するために転送ピペットを使用します。
   注:バッファー表面の乱れを最小限に抑えるように注意してください、 または脳のセクションが離れて浮かびます.乾いた場合、この行の脳セクションはスライドにしっかりと付着します。必要に応じて、スライド上のセクションをそっと調整して、セクションが濡れているときに組織にしわや折り目がないことを確認します。
4. スライドの下部に到達するまで、この手順を繰り返します。すべてのセクションがスライドに取り付けられるまで繰り返し実行します。

5. カバーの切り抜き

1. すべてのセクションが乾燥した後(室温で1-24時間)、80-100 μLのアンチフェーディング実装媒体をスライド上にDAPI( 材料表参照)を付けて、ガラスカバースリップをそっと塗布してサンプルを覆います。
   注:ガラスカバースリップを慎重かつゆっくりと塗布して、泡を避けてください。
2. スライドを顕微鏡スライドボックス( 材料表参照)に入れ、4°Cで保管します。
   注:蛍光の退色や自己蛍光の発生を避けるために、1〜3日以内にすべてのセクションを画像化します。

6. イメージング

1. スキャナとコンピュータの電源を入れます( 資料表を参照)。スライドをローディングデバイスでスライドホルダーに配置し、ホルダーをスキャナーに挿入します。
   注:スキャナーは、複数のチャンネル(例えば、4′、6-diamidino-2-フェニリンドール(DAPI)、緑、および赤色のチャンネル)を同時にスキャンできます。走査は20倍の倍率のみでスライドをスキャンし、より高い倍率(例えば40倍)が必要な場合には従来の蛍光顕微鏡( 材料表を参照)を使用できます。
2. スキャナーのソフトウェアを開きます( 資料表を参照)。適切な保存場所とスキャン プロファイルを選択します。
3. プレビュー スキャンを開始する] ボタンをクリックして 、プレビュー スキャンを開始 します。プレビュー スキャンの後、 組織検出 ウィザードを開き、イメージング用の対象領域を丸で囲みます。
4. イメージングのリージョンを選択した後で、[ スキャンの開始 ]ボタンをクリックします。スキャンが完了するまで待ちます。結果ファイルを確認し、イメージをエクスポートします。
   注:プロファイルがスライドに適していない場合は、露出時間または光強度を再調整して、プロファイルを組織に合わせて調整します。技術的な詳細については、スキャナの説明書を参照してください(資料表)。

結果

このプロトコルのフローチャートを 図 1 に簡単に示します。この研究室の凍結切除手順は、5つの脳サンプルを同時に切り離した 図2Aで実証されています。脳部の取り付けは 図2Bに示され、脳部を備えた完全に取り付けられたスライドを 図2Cに示す。 図3において、ブレグマ-0.82mm?...

ディスカッション

このプロトコルは、灌流、組織切片、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングを含むマウス脳の神経解剖学的研究のための確立された方法を提供する。ただし、一貫性のある信頼性の高い結果を得るには、いくつかの重要な詳細を最適化する必要があります。

灌流の質は、染色を成功させるために重要です。血液細胞(例えば、赤血球)が人工的な「陽性」染色

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21207
30% Sucrose	VWR	470302	30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS
Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128	10%, 25 °C, pH 6.8-7.2
1 mL Sub-Q Syringe	BD	309597
48 Well Cell Culture Plate	Corning	3548
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
Antifading mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Autoclavable plastic desiccator	Thermo Scientific Nalgene	5315-0150
AVP antibody	Phoenix Pharmaceuticals	H-065-07
Cell Strainer	Corning	431752
Cryoprotectant buffer	User preference	Not applicable	20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Leica DFC310FX microscope	Leica	Not applicable
Microscope Slide Boxes (50-place)	VWR	Not applicable
PBT	User preference	Not applicable	2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS
Perfusion two automated Perfusion System	Leica	39471005
Phosphate-buffered saline (PBS) 20x	VWR	VWRVE703-1L	25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer
Slideing Microtome Microm HM450	ThermoFisher	Microm HM450
Sodium Chloride	RICCA Chemical	7220-32	0.9%, 25 °C, pH 7.4
Streptavidin Protein, DyLight 488	ThermoFisher	#21832
Triton X-100	Sigma-Aldrich	089k01921
WFA antibody	Sigma-Aldrich	L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner	Zeiss	Not applicable
Zen 3.1 software			scanner software